柚皮素眼用组合物的质量控制方法
【专利摘要】本发明涉及柚皮素眼用组合物的质量控制方法，具体地说，本发明所述方法包括使用高效液相色谱法对所述眼用组合物中的活性成分柚皮素进行含量测定的步骤。在一个实施方案中，所述柚皮素眼用组合物是滴眼液。与现有技术方法相比，本发明质量控制方法具有明显更优异的方法学性能，并且能够克服现有技术中的某些缺陷。为抗视网膜光感受器细胞凋亡的药物开发提供坚实的技术保障。
【专利说明】
柚皮素眼用组合物的质量控制方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种具有抗视网膜光感受器细胞凋亡的柚皮素眼用组合物的质量控 制方法。本发明特别地涉及一种柚皮素滴眼液组合物的质量控制方法。
【背景技术】
[0002] 光感受器细胞指的是能感受光刺激，并产生冲动传向中枢神经的感觉细胞。人类 的光感受器细胞主要有两种，分别是视杆细胞和视锥细胞。如果光感受器细胞凋亡则难以 再生和修复，将导致多种难治性的致盲疾病，如视网膜色素变性(retinitis pigmentosa， RP)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)和视网膜脱离等。
[0003] 光感受器细胞凋亡所引起的视网膜疾病可利用光动力疗法、玻璃体腔注射各种抗 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的药物等抑制新生血管 形成、玻璃体视网膜手术等方法进行治疗。这些方法主要用于疾病的晚期，光动力疗法和玻 璃体腔注射各种抗VEGF的药物可抑制病情进一步发展，但是操作复杂，需要定期到医院重 复治疗。玻璃体视网膜手术使得各种复杂的视网膜脱离和DR得到了解剖上的完全复位，但 由于疾病所致的光感受器细胞的凋亡尚无法逆转，从而也不能从根本上恢复患者的视功 能。此外，还有基因治疗和视网膜移植术，这给光感受器细胞凋亡所引起的视网膜疾病的治 疗带来了新的希望，但是这些方法处于试验阶段，仍不成熟。
[0004] 目前，延缓光感受器细胞凋亡的药物主要是与光感受器细胞代谢相关的物质，如： (1)维生素A、牛磺酸和二十二碳六烯酸(DHA)，是目前用于干预RP异常生化代谢最常用的物 质，这些物质在视网膜内含量高，参与光感受器细胞正常结构和功能维持及正常光电转化 反应。研究发现大剂量的补充这些物质能够延缓RP等视网膜疾病的病程进展;2)神经营养 因子如FGF、TGF等均能延缓光感受器细胞的凋亡，但作用持续时间不同，而且目前也是仅限 动物试验阶段；（3)钙离子拮抗剂可以延缓rd鼠光感受器细胞凋亡的发展，但钙拮抗剂用于 RP治疗的安全剂量如何确定，长期应用是否会对机体产生不良后果等，均待进一步研究。因 此，对于光感受器细胞凋亡所引起的视网膜疾病，急待一种安全有效的药物出现。
[0005] 柚皮素的化学名称为4'，5,7-三羟基黄酮（11&41^611丨11，4'，5,7-trihydroxyflavanone)，化学结构如下式（I)所示。柚皮素是一种黄酮类化合物，它广泛存 在于葡萄和西红柿等植物中。柚皮素毒性很小，实验浓度下均无细胞毒性，长期毒理试验证 明药物无毒性。柚皮素药理作用广泛，如抗肿瘤、抗炎、止咳化痰和降糖等等。
[0007] 现代药理作用研究表明，柚皮素在眼科方面具有以下功效：1)增加眼部血流量。50 μL浓度为1 %的柚皮素滴眼液能显著增加新西兰兔眼球的脉络膜、虹膜和睫状体的血流量。 由于眼部血流量和视网膜功能密切相关，因此柚皮素增加眼部血流量的作用可能有助于改 善眼球缺血缺氧所造成的视网膜损伤和新生血管的生成。2)逆转眼部缺血造成的视网膜功 能降低。阻断中央视网膜和后睫状体动脉30min引起视网膜缺血引起闪光视网膜电流图b波 消失。30min新让视网膜得到血液供应，则闪光视网膜电流图b波将缓慢恢复，4小时后b波的 振幅可恢复到正常值的30%左右。给大鼠预先腹腔注射柚皮素（10mg/kg)能显著加快闪光 视网膜电流图b波的恢复，并且4小时后使闪光视网膜电流图b值恢复到正常值的55%。这个 结果表明柚皮素能有效改善视网膜缺血引起的视网膜功能损伤。3)抑制脉络膜新生血管的 生成。GeorgeChiou教授发现，浓度为1%的柚皮素滴眼液能够显著降低激光诱发大鼠眼脉 络膜新生血管的形成。与模型对照组相比，柚皮素滴眼后2周和4周（3次/日）对脉络膜新生 血管形成的抑制率高达47%和51%。4)柚皮素具有抗氧化作用，能逆转氧化剂所引起的脐 静脉内皮细胞和视网膜色素上皮细胞的氧化损伤。5)眼部抗炎作用。LPS诱发Lewis大鼠葡 萄膜炎，使房水中PGE2、N0和细胞数量生成增多。玻璃体内注射0.4、4和40yg/kg体重的柚皮 素可剂量依赖性抑制PGE2和N0的生成，给药剂量为40yg/kg柚皮素也能减少进入房水中的 细胞数量达38 %。
[0008] CN102716117A(中国专利申请号201210228744.X，广州中医药大学）公开了柚皮素 在制备抗视网膜光感受器细胞凋亡的药物中的应用，据信化合物柚皮素对视网膜光感受器 细胞的光化学损伤具有保护作用，且能抗视网膜光感受器细胞的凋亡，可用于制备各种抗 视网膜光感受器细胞凋亡药物，以利于提高人类的生存质量。
[0009] 以眼用方式给药是柚皮素作为抗视网膜光感受器细胞凋亡药物的优选给药途径。 CN102716117A已经公开了一种具有优异药学性能的柚皮素滴眼液，特别适用于抗视网膜光 感受器细胞凋亡药物的药剂。然而，由于药物理化性能的特殊性，本发明人已经发现，即使 是使用现有的高分辨率的方法例如高效液相色谱法，对上述现有技术所公开的柚皮素滴眼 液进行质量控制时，仍然具有巨大的困难的。
[0010]例如，周桂芬等（周桂芬等，高效液相色谱法测定铁皮石斛中柚皮素的含量，中国 中药杂志，2013年04期)探寻了铁皮石斛中指标性成分，建立指标性成分的含量测定方法， 并测定浙江省不同种植基地、不同生长年限铁皮石斛中柚皮素的含量。其中采用高效液相 色谱法测定柚皮素的含量。色谱柱为XB C18(4.6mmX250mm，5ym)，以甲醇-0.2%磷酸水溶 液为流动相，检测波长为290nm。结果表明：柚皮素在0.026~0.208yg线性关系良好(r = 1); 平均加样回收率为96.3% (RSD1.8% )。同一生长年限不同种植基地铁皮石斛中柚皮素含量 波动范围较大;并且同一种植基地铁皮石斛随着生长年限的增加柚皮素的含量先增加后降 低，三年生铁皮石斛中柚皮素的含量最高。据信该方法准确、可靠，可用于铁皮石斛药材及 相关产品中柚皮素的含量测定，为完善铁皮石斛药材质量标准提供参考。
[0011]又例如，巴寅颖等（巴寅颖等，HPLC法同时测定鬼箭羽药材中4种有效成分的含量， 药物分析杂志，2010年06期)建立了高效液相色谱法测定鬼箭羽药材中4种主要有效成分儿 茶素、去氢双儿茶素A、香橙素和柚皮素的含量，其方法是采用Diam 〇nsilTMC18(250mmX 4.6mm，5μπι)色谱柱，以甲醇-乙腈-0.1 %甲酸水溶液为流动相梯度洗脱(0~35min，9:9:82 -17 · 5:17 · 5:65)，流速lmL/min，检测波长280nm(儿茶素、香橙素和柚皮素）、380nm(去氢双 儿茶素A)，柱温30°C。据信该方法的结果能够满足同时测定四种有效成分的测定要求，9批 样品测定结果表明本法简便、准确，重复性好，可用于鬼箭羽药材中儿茶素等4种成分的含 量测定。
[0012] 此外，詹志斌等(詹志斌等，高效液相色谱法同时测定枳实中6种成分的含量，中国 医院药学杂志，2015年12期)建立了高效液相色谱(HPLC)法同时测定枳实药材中柚皮素、橙 皮素、马尔敏、6'，7'_二羟基香柠檬素、川陈皮素和桔皮素6种成分含量的方法，其方法昌采 用Symmetry C18(250mm X 4.6mm，5μπι)色谱柱，以乙腈-水为流动相，梯度洗脱，流速1.0ml/ min，检测波长324nm，柱温30°C。据信该方法的结果能够满足同时测定四种有效成分的测定 要求，并且该法简便、快速、重现性好，为枳实药材及饮片的质量控制提供参考。
[0013] 孙丽丽等（孙丽丽等，不同来源降香中柚皮素与异甘草素含量的高效液相色谱测 定，时珍国医国药，2010年06期)建立了高效液相色谱(HPLC)法测定降香中柚皮素和异甘草 素含量的方法，比较不同来源的11批降香药材中的柚皮素和异甘草素的含量。具体地是采 用HPLC法测定，以甲醇-0.2%磷酸水(60:40)为流动相，检测波长为372nm(柚皮素)和290nm (异甘草素）。结果柚皮素在0.948~4.740yg范围内线性关系良好，r = 0.9999;异甘草素在 1.432~10.024yg范围内线性关系良好，r = 0.9999。降香中的柚皮素含量在2.585~ 5.429mg/g之间；异甘草素含量在7.526~28.329mg/g之间。结论不同来源的降香药材中的 柚皮素和异甘草素含量差异较大。该方法操作简便、快速、重复性好，适用于降香的质量控 制。
[0014] 本发明人发现，使用上述这些针对药材中柚皮素的测定方法，它们均不能有效地 用于测定本发明所涉及的柚皮素滴眼液。
[0015] 此外，颜美秋等(颜美秋等，RP-HPLC法测定铁皮楓斗颗粒中柚皮素含量，中华中医 药学刊，2013年09期)建立了一种高效液相色谱法测定铁皮楓斗颗粒中柚皮素含量的方法。 该方法所用色谱柱Ultimate 乂8-(：18(25〇111111\4.6111111，5以111);流动相为0.2%!13?04的水溶液 与甲醇采用梯度洗脱;流速为1. OmL/min;检测波长为280nm;柱温30°C。据信该法准确，阴性 制剂无干扰，精密度高，重复性好，可用于铁皮楓斗颗粒中柚皮素的含量测定，并为其它铁 皮柄斗相关制剂质量检测提供参考。
[0016] 丁洁等(丁洁等，HPLC测定艾蒿黄酮乳膏中槲皮素和柚皮素的含量，中国实验方剂 学杂志，2014年16期)建立了以高效液相色谱法测定艾蒿黄酮乳膏中槲皮素和柚皮素含量 的方法。该方法为：66111；[11；[(]18反相色谱柱（4.61]1111\25〇1]1111，5以111)，流速1.〇111]^/111；[11，柱温25 °C，检测波长330nm，进样量1 OyL，流动相0.5 %乙酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱。据信该方 法简便、快速、重复性好，可用于艾蒿黄酮乳膏的质量控制。
[0017] 本发明人发现，即使是使用上述这些针对药物制剂中柚皮素的测定方法，它们同 样地均不能有效地用于测定本发明所涉及的柚皮素滴眼液。
[0018] 因此，本领域技术人员迫切期待有新的适用于柚皮素药物组合物特别是其滴眼液 的质量控制方法，并且期待这种质量控制方法具有优异的药物分析性能。
【发明内容】
[0019] 本发明目的在于提供一种适用于柚皮素药物组合物特别是其滴眼液的质量控制 方法，并且期待这种质量控制方法具有优异的药物分析性能。已经出人意料地发现，使用本 发明方法能够有效地实现上述一个或多个目的。本发明基于此发现而得以完成。
[0020] 在本发明中，提及柚皮素眼用组合物、组合物、滴眼液等时，它们均具有相同的含 义，并且可以通用。
[0021] 为此，本发明第一方面提供了一种柚皮素眼用组合物的质量控制方法，该方法包 括使用高效液相色谱法对所述眼用组合物中的活性成分柚皮素进行含量测定的步骤。
[0022] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述柚皮素眼用组合物是液体药 物组合物。
[0023] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述柚皮素眼用组合物是滴眼 液。
[0024] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述柚皮素眼用组合物中包含： 柚皮素、聚卡波菲、羟丙基-β_环糊精、泊洛沙姆、依地酸二钠、氯化钠、苯扎氯铵、酸碱调节 剂和水。
[0025] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述柚皮素眼用组合物每1000ml 中包含：柚皮素l〇g、聚卡波菲l〇g、羟丙基-β-环糊精150g、泊洛沙姆407型2g、依地酸二钠 lg、氯化钠2g、苯扎氯铵O.lg、酸碱调节剂适量(例如使该组合物最终的pH值在6.0-7.0范围 内）和加至平衡量的水。
[0026] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述柚皮素眼用组合物是滴眼 液，并且其是通过包括以下步骤的方法制备得到的：
[0027] (i)取400ml注射用水，搅拌下加入10g聚卡波菲，溶胀2h以上，用浓度为2mol/L的 NaOH溶液调pH值至6.0-6.5，热压灭菌消毒，作为溶液I备用。
[0028] (ii)取400ml注射用水，加入羟丙基-β-环糊精150g，搅拌溶解，加入柚皮素10g超 声2h溶解;然后加入2g泊洛沙姆407，超声0.5h溶解;加入lg依地酸二钠、2g氯化钠和0. lg苯 扎氯铵，搅拌溶解，作为溶液II备用；
[0029] (iii)不断搅拌下将溶液I和溶液II混合均匀，加入注射用水定容至1000ml，最后 用过滤除菌的浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至6.0-7.0，充分搅拌均匀并灌装在滴 眼液瓶中，每瓶装l〇ml。
[0030] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述柚皮素眼用组合物是各组份 完全溶解的溶液。
[0031] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述高效液相色谱法是参照《中 华人民共和国药典》2010年版一部附录36页"附录VI D高效液相色谱法"所载方法测定，或 者参照《中华人民共和国药典》2015年版四部第59页"0512高效液相色谱法"所载方法测定。
[0032] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，该方法包括以下测定过程或测定项 目：
[0033] (1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(例 如所用色谱柱是XB C18柱，4.6mm X 250mm，5μπι);以甲醇为流动相A，0.2 %磷酸溶液为流动 相B，进行梯度洗脱，具体梯度为：25:75~40:60(0~lOmin)，40:60~50:50(10~25min)，50 :50~70:30(25~45min);检测波长为280nm;理论板数按柚皮素峰计算应不低于3000;
[0034] (2)对照品溶液的制备：柚皮素对照品置五氧化二磷干燥器中干燥12h后，精密称 取适量，加甲醇制成每lmL含柚皮素100yg的柚皮素对照品溶液；
[0035] (3)供试品溶液的制备：精密量取柚皮素眼用组合物1ml，置100ml量瓶中，加90 % 甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每lmL含柚皮素lOOyg的溶液，作为供试品溶液；
[0036] (4)测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μ1，注入液相色谱仪，测 定并计算每lml柚皮素眼用组合物中柚皮素的含量，即得。
[0037] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(3)在配制供试品溶液时，还 包括预先对所述柚皮素眼用组合物用无机碱进行处理的步骤。
[0038] 根据本发明第一方面任一实施方案的方法，所述无机碱是碳酸氢钠或碳酸氢钾。 下文实施例3考察了碳酸氢钠，本发明人在补充试验中还考察了碳酸氢钾，显示其结果与使 用碳酸氢钠相同。但是在实施例3中当使用等当量的碳酸钠或碳酸钾来替代碳酸氢钠时，却 不能有效地提高加样回收率以达到令人满意的程度，回收率仍然低于96%。
[0039]根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(3)是照如下方式处理的:精 密量取柚皮素眼用组合物lml，置100ml量瓶中，加0.1 moVL无机碱2ml，混匀，在40°C水浴中 温热3〇111；[11，取出，冷却，加0.111101/1^盐酸21111中和 ；接着加90%甲醇稀释至刻度，摇勾，用 0.45μπι微孔滤膜过滤，制成每lmL含柚皮素100yg的溶液，作为供试品溶液。已经出人意料地 发现，在这样使用无机碱处理供试品后，可以克服高效液相色谱法测定本发明柚皮素眼用 组合物回收率不足的问题，这种结果是现有技术的理论和实践根本无从解释的，也完全是 出人意料的。
[0040] 进一步地，本发明第二方面提供了一种柚皮素眼用组合物，其是液体药物组合物， 并且其中包含:柚皮素、聚卡波菲、羟丙基-β_环糊精、泊洛沙姆、依地酸二钠、氯化钠、苯扎 氯铵、酸碱调节剂和水。
[0041] 根据本发明第二方面任一实施方案的柚皮素眼用组合物，其是滴眼液。
[0042] 根据本发明第二方面任一实施方案的柚皮素眼用组合物，其每1000ml中包含:柚 皮素l〇g、聚卡波菲l〇g、羟丙基-β-环糊精150g、泊洛沙姆407型2g、依地酸二钠lg、氯化钠 2g、苯扎氯铵0. lg、酸碱调节剂适量(例如使该组合物最终的pH值在6.0-7.0范围内）和加至 平衡量的水。
[0043] 根据本发明第二方面任一实施方案的柚皮素眼用组合物，其是滴眼液，并且其是 通过包括以下步骤的方法制备得到的：
[0044] (i)取400ml注射用水，搅拌下加入10g聚卡波菲，溶胀2h以上，用浓度为2mol/L的 NaOH溶液调pH值至6.0-6.5，热压灭菌消毒，作为溶液I备用。
[0045] (ii)取400ml注射用水，加入羟丙基-β-环糊精150g，搅拌溶解，加入柚皮素lOg超 声2h溶解;然后加入2g泊洛沙姆407，超声0.5h溶解;加入lg依地酸二钠、2g氯化钠和0. lg苯 扎氯铵，搅拌溶解，作为溶液II备用；
[0046] (iii)不断搅拌下将溶液I和溶液II混合均匀，加入注射用水定容至1000ml，最后 用过滤除菌的浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至6.0-7.0，充分搅拌均匀并灌装在滴 眼液瓶中，每瓶装l〇ml。
[0047] 根据本发明第二方面任一实施方案的柚皮素眼用组合物，其中各组份完全溶解的 溶液。
[0048] 本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用 其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互 之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一 步的描述。本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文 献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和 短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和 短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表 述的含义为准。
【具体实施方式】
[0049] 通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限 于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以 对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性 和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的， 但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
[0050] 实施例1:制备柚皮素眼用组合物(滴眼液)
[0051 ] (i)取400ml注射用水，搅拌下加入10g聚卡波菲，溶胀2h以上，用浓度为2mol/L的 NaOH溶液调pH值至6.0-6.5，热压灭菌消毒，作为溶液I备用。
[0052] (ii)取400ml注射用水，加入羟丙基-β-环糊精150g，搅拌溶解，加入柚皮素10g超 声2h溶解;然后加入2g泊洛沙姆407，超声0.5h溶解;加入lg依地酸二钠、2g氯化钠和0. lg苯 扎氯铵，搅拌溶解，作为溶液II备用；
[0053] (iii)不断搅拌下将溶液I和溶液II混合均匀，加入注射用水定容至1000ml，最后 用过滤除菌的浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至6.0-7.0，充分搅拌均匀并灌装在滴 眼液瓶中，每瓶装l〇ml。每毫升含有10mg柚皮素。
[0054] 如未另外说明，本实施例1制备的滴眼液用于下面测定实例的供试品。
[0055] 另外，参照本实施例1的步骤配料，不同的仅是在步骤（ii)中不添加柚皮素，制得 不含药的滴眼液，在此可称为空白滴眼液，并且其可作为空白样品用于滴眼液中柚皮素含 量测定的工具。如未另外说明，本空白滴眼液用于以下测定实例。
[0056] 实施例2、使用高效液相色谱法测定滴眼液中柚皮素的含量 [0057] (A)HPLC的测定过程或测定项目
[0058] (1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(所 用色谱柱是XB C18柱，4.6mm X 250mm，5μπι);以甲醇为流动相A，0.2 %磷酸溶液为流动相B， 进行梯度洗脱，具体梯度为：25:75~40:60(0~lOmin)，40:60~50:50( 10~25min)，50:50 ~70:30(25~45min);检测波长为280nm;理论板数按柚皮素峰计算应不低于3000;
[0059] (2)对照品溶液的制备:柚皮素对照品置五氧化二磷干燥器中干燥12h后，精密称 取适量，加甲醇制成每lmL含柚皮素lOOyg的柚皮素对照品溶液；
[0060] (3)供试品溶液的制备：精密量取柚皮素眼用组合物1ml，置100ml量瓶中，加90 % 甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每lmL含柚皮素lOOyg的溶液，作为供试品溶液；
[0061] (4)测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μ1，注入液相色谱仪，测 定并计算每lml柚皮素眼用组合物中柚皮素的含量，即得。
[0062] (B)空白样品溶液的制备及测定：精密量取空白滴眼液1 m 1，置10 0m 1量瓶中，加 90%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。针对该空白样品溶液，使用本实施例上述(A)中的HPLC法 测定，结合对照品溶液与供试品溶液所得色谱图，结果表明辅料和杂质不会干扰柚皮素的 出峰。这表明HPLC分离效果是令人满意的。
[0063] (C)方法的线性关系考察：取本实施例上述(A)中的柚皮素对照品溶液，分别精密 吸取2、5、10、15、20、25、30、50yL，注入液相色谱仪，按本实施例上述(A)中的色谱条件项下 方法测定柚皮素峰面积，以对照品峰面积Y对进样量X进行线性回归，绘制标准曲线，计算回 归方程和相关系数，结果表明，柚皮素在上述进样量范围内与峰面积呈现良好的线性关系， 相关系数(r 2)大于0.9999。这表明上述方法的线性关系完全能够满足测定要求。
[0064] (D)精密度试验:精密吸取柚皮素对照品溶液20yL，连续进样6次，测得柚皮素峰面 积，所得峰面积RSD值为0.21 %表明仪器精密度良好。
[0065] (E)稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液，在0h、4h、8h和12h分别进样，测定柚皮 素峰面积，柚皮素峰面积RSD为0.63 %，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。
[0066] (F)重复性试验:取同一批滴眼液样品，6份，按本实施例上述(A)供试品溶液的制 备项下进行制备，依法测定，得到滴眼液样品中柚皮素平均含量为9.41mg/ml，RSD为 0.83%，表明该方法的重现性良好。但是，由于滴眼液理论投料计算其柚皮素含量应为 10mg/ml左右，显然上述平均含量9.41mg/ml比预计值偏低。
[0067] (G)加样回收率试验:精密吸取已知含量同一批次样品（实施例1所得)6份，每份 lml(相当于含柚皮素约lmg)，精密称定，分别精密加入对照品适量(约lmg)，按本实施例上 述(A)供试品溶液的制备项下进行制备加样回收样品，依法测定，计算回收率，柚皮素平均 回收率为93.23 %，RSD为0.89 %，这表明，该该方法可靠有待提高。
[0068] (H)照本实施例上述(A)至(G)进行，不同的仅是色谱条件与系统适用性试验分别 采用本发明【背景技术】部分所提到的周桂芬等、巴寅颖等、詹志斌等、孙丽丽等、丁洁等的五 种文献方法条件进行测定。结果显示:五种文献方法在测定空白样品溶液、对照品溶液、供 试品溶液色谱图并比较时，发现组合物中的辅料和杂质均不会干扰柚皮素的出峰;五种文 献方法在进行方法的线性关系考察时，发现柚皮素在所述进样量范围内与峰面积均呈现良 好的线性关系，相关系数(r 2)亦均大于0.9999;五种文献方法在进行精密度试验时，发现仪 器精密度均优良；五种文献方法在进行稳定性试验时，柚皮素峰面积RSD均在0.47~0.72 % 范围内，表明供试品溶液在12h内稳定性均良好;五种文献方法在进行重复性试验时，测得 滴眼液样品中柚皮素平均含量均在9.27~9.53mg/ml范围内，RSD均在0.58~0.94%范围 内，表明该方法的重现性良好，但是平均含量均比预计值偏低;五种文献方法在进行加样回 收率试验时，发现柚皮素平均回收率均在92.2~95.3 %范围内，RSD均在0.76~0.92 %范围 内，表明该方法可靠性有待提尚。
[0069] 实施例3、使用高效液相色谱法测定滴眼液中柚皮素的含量 [0070] (A)HPLC的测定过程或测定项目
[0071] (1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(所 用色谱柱是XB C18柱，4.6mm X 250mm，5μπι);以甲醇为流动相A，0.2 %磷酸溶液为流动相B， 进行梯度洗脱，具体梯度为：25:75~40:60(0~lOmin)，40:60~50:50( 10~25min)，50:50 ~70:30(25~45min);检测波长为280nm;理论板数按柚皮素峰计算应不低于3000;
[0072] (2)对照品溶液的制备：柚皮素对照品置五氧化二磷干燥器中干燥12h后，精密称 取适量，加甲醇制成每lmL含柚皮素lOOyg的柚皮素对照品溶液；
[0073] (3 )供试品溶液的制备：精密量取柚皮素眼用组合物1 m 1，置100m 1量瓶中，加 0 · lmol/L碳酸氢钠2ml，混勾，在40°C水浴中温热30min，取出，冷却，加0 · lmol/L盐酸2ml中 和;接着加90 %甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μπι微孔滤膜过滤，制成每lmL含柚皮素100yg 的溶液，作为供试品溶液；
[0074] (4)测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μ1，注入液相色谱仪，测 定并计算每lml柚皮素眼用组合物中柚皮素的含量，即得。
[0075] (B)空白样品溶液的制备及测定:精密量取空白滴眼液lml，置100ml量瓶中，
[0076] 加0.1mol/L碳酸氢钠2ml，混匀，在40°C水浴中温热30min，取出，冷却，加0.1mol/L 盐酸2ml中和;接着加90%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μπι微孔滤膜过滤，即得。针对该空 白样品溶液，使用本实施例上述(Α)中的HPLC法测定，结合对照品溶液与供试品溶液所得色 谱图，结果表明辅料和杂质不会干扰柚皮素的出峰。这表明HPLC分离效果是令人满意的。 [0077] (C)方法的线性关系考察：取本实施例上述(Α)中的柚皮素对照品溶液，分别精密 吸取2、5、10、15、20、25、30、50yL，注入液相色谱仪，按本实施例上述(Α)中的色谱条件项下 方法测定柚皮素峰面积，以对照品峰面积Y对进样量X进行线性回归，绘制标准曲线，计算回 归方程和相关系数，结果表明，柚皮素在上述进样量范围内与峰面积呈现良好的线性关系， 相关系数(r 2)大于0.9999。这表明上述方法的线性关系完全能够满足测定要求。
[0078] (D)精密度试验:精密吸取柚皮素对照品溶液20yL，连续进样6次，测得柚皮素峰面 积，所得峰面积RSD值为0.23 %表明仪器精密度良好。
[0079] (E)稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液，在Oh、4h、8h和12h分别进样，测定柚皮 素峰面积，柚皮素峰面积RSD为0.58 %，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。
[0080] (F)重复性试验：取同一批滴眼液样品，6份，按本实施例上述(A)供试品溶液的制 备项下进行制备，依法测定，得到滴眼液样品中柚皮素平均含量为l〇.12mg/ml，RSD为 0.76%，表明该方法的重现性良好。但是，由于滴眼液理论投料计算其柚皮素含量应为 10mg/ml左右，显然上述平均含量与预计值吻合。
[0081] (G)加样回收率试验:精密吸取已知含量同一批次样品（实施例1所得)6份，每份 lml(相当于含柚皮素约lmg)，精密称定，分别精密加入对照品适量(约lmg)，按本实施例上 述(A)之步骤(3)供试品溶液的制备项下进行制备加样回收样品，依法测定，计算回收率，柚 皮素平均回收率为99.97 %，RSD为0.63 %，这表明，该方法具体优异的可靠性。
【主权项】
1. 柚皮素眼用组合物的质量控制方法，该方法包括使用高效液相色谱法对所述眼用组 合物中的活性成分柚皮素进行含量测定的步骤。2. 根据权利要求1的方法，其中： 所述柚皮素眼用组合物是液体药物组合物； 所述柚皮素眼用组合物是滴眼液;和/或， 所述柚皮素眼用组合物是各组份完全溶解的溶液。3. 根据权利要求1 _2的方法，其中： 所述柚皮素眼用组合物中包含:柚皮素、聚卡波菲、羟丙基-β_环糊精、泊洛沙姆、依地 酸二钠、氯化钠、苯扎氯铵、酸碱调节剂和水;和/或， 所述柚皮素眼用组合物每1000ml中包含:柚皮素10g、聚卡波菲10g、羟丙基-β-环糊精 150g、泊洛沙姆407型2g、依地酸二钠 lg、氯化钠2g、苯扎氯铵O.lg、酸碱调节剂适量(例如使 该组合物最终的pH值在6.0-7.0范围内）和加至平衡量的水。4. 根据权利要求1-3的方法，其中所述柚皮素眼用组合物是滴眼液，并且其是通过包括 以下步骤的方法制备得到的： (i)取400ml注射用水，搅拌下加入10g聚卡波菲，溶胀2h以上，用浓度为2mol/L的NaOH 溶液调pH值至6.0-6.5，热压灭菌消毒，作为溶液I备用。 (i i)取400ml注射用水，加入羟丙基-β-环糊精150g，搅拌溶解，加入柚皮素10g超声2h 溶解;然后加入2g泊洛沙姆407，超声0.5h溶解;加入lg依地酸二钠、2g氯化钠和0. lg苯扎氯 铵，搅拌溶解，作为溶液II备用； (iii)不断搅拌下将溶液I和溶液II混合均匀，加入注射用水定容至l〇〇〇ml，最后用过 滤除菌的浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至6.0-7.0，充分搅拌均匀并灌装在滴眼液 瓶中，每瓶装l〇ml。5. 根据权利要求1-4的方法，其中所述高效液相色谱法是参照《中华人民共和国药典》 2010年版一部附录36页"附录VI D高效液相色谱法"所载方法测定，或者参照《中华人民共 和国药典》2015年版四部第59页"0512高效液相色谱法"所载方法测定。6. 根据权利要求1-5的方法，该方法包括以下测定过程或测定项目： (1) 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(例如所 用色谱柱是XB C18柱，4.6mm X 250mm，5μπι);以甲醇为流动相A，0.2 %磷酸溶液为流动相B， 进行梯度洗脱，具体梯度为：25:75~40:60(0~10min)，40:60~50:50( 10~25min)，50:50 ~70:30(25~45min);检测波长为280nm;理论板数按柚皮素峰计算应不低于3000; (2) 对照品溶液的制备:柚皮素对照品置五氧化二磷干燥器中干燥12h后，精密称取适 量，加甲醇制成每lmL含柚皮素100yg的柚皮素对照品溶液； (3) 供试品溶液的制备:精密量取柚皮素眼用组合物lml，置100ml量瓶中，加90 %甲醇 稀释至刻度，摇匀，制成每lmL含柚皮素100yg的溶液，作为供试品溶液； (4) 测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μ1，注入液相色谱仪，测定并 计算每lml柚皮素眼用组合物中柚皮素的含量，即得。7. 根据权利要求1-6的方法，其中步骤(3)在配制供试品溶液时，还包括预先对所述柚 皮素眼用组合物用无机碱进行处理的步骤。8. 根据权利要求1-7的方法，所述无机碱是碳酸氢钠或碳酸氢钾。9. 根据权利要求1-8的方法，其中步骤(3)是照如下方式处理的：精密量取柚皮素眼用 组合物lml，置100ml量瓶中，加0. lmol/L无机碱2ml，混匀，在40°C水浴中温热30min，取出， 冷去卩，加0 . lmol/L盐酸2ml中和；接着加90 %甲醇稀释至刻度，摇勾，用0.45μηι微孔滤膜过 滤，制成每lmL含柚皮素1 OOyg的溶液，作为供试品溶液。10. -种柚皮素眼用组合物，其是液体药物组合物，并且其中包含:柚皮素、聚卡波菲、 羟丙基-β-环糊精、泊洛沙姆、依地酸二钠、氯化钠、苯扎氯铵、酸碱调节剂和水;例如，其每 1000ml中包含:柚皮素10g、聚卡波菲10g、羟丙基-β-环糊精150g、泊洛沙姆407型2g、依地酸 二钠lg、氯化钠2g、苯扎氯铵O.lg、酸碱调节剂适量(例如使该组合物最终的pH值在6.0-7.0 范围内）和加至平衡量的水。
【文档编号】A61K31/198GK105866259SQ201610167441
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月15日
【发明人】林宝琴, 陈文培, 周成浩
【申请人】林宝琴