一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法
【专利摘要】本发明涉及一种高效筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法。该方法通过FLAG标签的使用将哺乳动物细胞中过表达的血管紧张素转化酶一步纯化并固定至磁珠上，应用于天然药物活性成分的筛选，并结合高效液相色谱?质谱法跟踪评价酶抑制活性，使得筛选方法更为灵敏。该方法解决了纯酶的快速制备问题；且通过真核细胞过表达目标酶，最大程度地保证了酶的功能，操作上较从动物组织提取酶更为简便，减少因为操作繁琐导致酶失活的情况发生，并大大降低酶制备纯化的成本。
【专利说明】
一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]高血压是威胁人类健康的重要疾病，血管紧张素转化酶(ang1tensinconverting enzyme，ACE)广泛存在于人体组织及血楽中，一方面催化血管紧张素I生成具有极强收缩血管的物质血管紧张素II，另一方面使具有血管舒张作用的激肽失活，转化为无活性的缓激肽，导致血压升高。ACE抑制剂(ACE inhibitor，ACEI)已作为治疗高血压的一线药物应用于临床，现有降压药物卡托普利、依那普利、赖诺普利、喹那普利等能显著抑制ACE活性起到降压作用，但人工合成的ACEI具有干咳、味觉功能紊乱及皮疹等不良反应(段练，世界中西医结合杂志，2014，(11): 1247-251)。因此，目前开发新型、低毒副作用、安全天然ACEI的研究倍受关注，天然ACEI主要来源于食物、动物、植物及中药等，临床实践与实验研究表明，钩藤、黄芪、葛根、罗布麻、杜仲等多种天然药物具有降血压作用(陈捷，海峡药学，2012，24(6): 225-227)，且天然药物具有安全性高、副作用小等特点，从天然药物中筛选出新的ACEI将可能为高血压的治疗提供新的药物。
[0003]根据ACE酶所处状态不同，目前，筛选ACE抑制剂的方法主要有两种，一种是均相溶液酶法，另一种是固相酶法。均相溶液酶法是以溶液酶作为酶源，通过检测抑制剂加入组与空白对照组产物生成量的变化来评价其抑制活性，最常用的反应系统是缓冲液中ACE酶催化底物马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)生成产物马尿酸(HA)系统，采用紫外分光光度法、高效液相色谱法、荧光法和毛细管电泳法等方法检测产物马尿酸的含量;固相酶法是将ACE酶进行固定化处理，利用其催化活性筛选或抑制剂与固定化酶的亲和作用进行亲和筛选。固相酶法与均相溶液酶法相比，具有反应过程可严格控制、可实现反应液与酶的快速分离、稳定性高、可重复使用降低成本等优势。然而，目前将ACE固定化且用于天然药物筛选的研究相对较少，洪韫嘉等(洪韫嘉，高等学校化学学报，2009，30(2):328-331)采用硫酸铵分级沉淀、透析平衡、亲和分离等多种步骤纯化猪肺ACE，得到高纯度ACE，研究了壳聚糖固定化ACE的性质；周敬豪等(周敬豪，广西大学，2013)采用共价交联法将猪肺ACE酶固定至磁性壳聚糖微球，结果显示固定化酶的pH值稳定性和热稳定性均得到提高;Cristina M等(CristinaM, Journal of Agricultural&Food Chemistry，2006，54(19):7120-7124)使用琼脂糖凝胶固定化ACE，并将其填装成酶柱，从葵花籽、油菜杆蛋白水解液中亲和筛选ACEI; Tang等人(Zhong,Analytical Chemistry，2006，78(8):2514-2520)通过吸附作用将ACE固定于毛细管柱上，通过测定抑制剂加入前后产物生成量的改变测定了多种中药的抑制活性。上述两种方法都需要用到大量纯酶，ACE的主要来源一是购买商品化ACE，二是从动物组织中提取，商品化纯酶价格昂贵，而从组织中提取纯化ACE步骤繁琐且易导致酶活力下降甚至失活。因此，采用适宜的方法在保持酶活的同时，获取纯化酶并采用合适的载体进行固定化处理是建立ACE抑制剂筛选方法的关键。
[0004]磁珠(ma gn e t i c b e a d s，MB)是一种新型的固定化载体，呈均勾球形，具有超顺磁性，可在外加磁场作用下定向移动达到快速分离目标物的目的。磁珠兼具液体的流动性和固体磁性材料快速吸附等特点，且表面可引入多种功能基团，能与多种生物活性物质如蛋白质、核酸、酶和抗体等进行偶联，广泛应用于生物大分子纯化、细胞分选、细菌等病原微生物检测等方面。根据磁珠表面的功能基团不同，常见的商品化磁珠包括氨基磁珠、羧基磁珠、羟基磁珠、环氧基磁珠、氨基磁珠、链霉亲和素磁珠、含标签磁珠和偶联抗体磁珠等。与传统用于药物筛选的固相载体相比，磁珠的比表面积更大、功能基团密度更高、可结合更多生物大分子;操作上只需要简单的磁性分离，省去离心、色谱分离等步骤，具有快速、简便、高通量、可重复使用、节约成本等优势。
[0005]随着基因分子生物学及蛋白质组学技术的发展，亲和标签为蛋白纯化提供了简单方便的纯化工具，将标签融合在目的蛋白的N端或C端表达融合蛋白，由于标签可特异性地与相应配基亲和，可达到快速纯化目的蛋白的目的。常见的亲和标签有多聚精氨酸标签(His-tag)、FLAG标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签(GST-tag)、生物素-链霉亲和素系统标签(Strep-tag)等。FLAG标签是由八个氨基酸(DYKDDDDK)组成的亲水性多肽，与其特异性抗体结合达到纯化目的，与其它标签相比，FLAG标签亲水性强，易定位于融合蛋白表面，与其抗体亲和力较强、特异性高且分子量较小，对目的蛋白结构及功能影响较小，因此，适合从更复杂的真核表达系统中纯化蛋白。
[0006]本发明通过FLAG标签的使用将哺乳动物细胞中过表达的ACE—步纯化并固定至磁珠上，应用于ACE抑制剂的筛选。与之前方法相比较，通过免疫磁珠富集，解决了纯酶来源问题;通过真核细胞过表达目标酶，操作上与从动物组织提取酶相比较更为简便，很大程度上减少因为操作繁琐导致酶失活的现象;利用真核细胞过表达，最大程度的保证了酶的功能；另外，利用高效液相联合质谱法跟踪监测，使得检测结果更为灵敏。
【发明内容】
[0007]本发明提供一种哺乳动物过表达磁珠固定化ACE偶联LC-MS—体化筛选技术，该方法精确、灵敏，为降压药物的研发提供技术支持。
[0008]—种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，该方法包括以下步骤:
[0009]步骤1:融合FLAG标签的血管紧张素转化酶质粒在大肠杆菌内的转化、扩增和抽提；
[0010]步骤2: 293T/17细胞接种后瞬时转染步骤I中抽提质粒；
[0011]步骤3:提取步骤2中细胞胞浆总蛋白；
[0012]步骤4:免疫磁珠富集并固定化步骤3中过表达的血管紧张素转化酶；
[0013]步骤5:建立LC-MS检测磁珠固定化ACE活性检测方法；
[0014]步骤6:阳性药验证步骤4中所富集并固定化酶的活性；
[0015]步骤7:通过利用步骤4中富集并固定化的的靶标酶，筛选血管紧张素转化酶抑制剂。
[0016]本发明的一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，步骤I中，融合FLAG标签的血管紧张素转化酶质粒在大肠杆菌内的转化的时间为90s，质粒扩增时间为2_4h，质粒抽提最终洗脱液为100-300yL。
[0017]本发明的一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，步骤2中，293T/17细胞的接种密度为0.8 X 15个/CHi2-1.5 X 15个/cm2，接种后10_24h进行瞬时转染，瞬时转染采用转染试剂转染，转染试剂为Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000和Exfect?中的一种。
[0018]本发明的一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，步骤3中，提取细胞胞浆总蛋白的时间为瞬时转染后24_48h，提取细胞胞浆总蛋白的方法为超声裂解法和裂解液裂解法中的一种，裂解液采用RIPA-NP40、RIPA-Triton-X100和M-PER中的一种，裂解时间为15min-60min，裂解温度为 4°C。
[0019]本发明的一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，步骤4中，含FLAG标签的融合蛋白与ANT1-DDK免疫磁珠通过特异性亲和作用达到分离纯化目的。通过构建不同目的蛋白或酶的FLAG融合表达载体质粒，可将其他目的蛋白纯化并固定至磁珠上。磁珠分选架磁性分离免疫磁珠蛋白复合物的静置时间为10s-120s，免疫磁珠富集靶标酶的用量比例为1:20-1:100(磁珠用量:胞浆总蛋白量，yL: yg)，免疫磁珠固定化靶标酶的温度为4°C-37°C，固定化时间为2h-24h。
[0020]本发明的一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，步骤5中，可以利用产物HA在228nm处的紫外吸收采用分光光度计、酶标仪、高效液相紫外检测器进行活性检测，或毛细管电泳法、高效液相联合质谱法等方法进行检测，高效液相联合质谱法可以在正离子模式以普萘洛尔为内标，跟踪检测产物生成量评价靶标酶活性。
[0021]本发明的一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，步骤7中，所筛选对象可以是小分子单体化合物、小分子混合物、天然药物提取物、多肽单体、多肽混合物。
[0022]本发明的一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，通过构建不同目的蛋白或酶的FLAG融合表达载体质粒，在高转染效率高表达的真核细胞如CH0、293T、293细胞中进行过表达，细胞裂解后与ANT1-DDK磁珠孵育，可将目的蛋白或酶纯化并固定至磁珠上。同样适用于将其它目标酶的底物与待测化合物与磁珠蛋白复合物孵育，通过检测加药组与空白对照组产物含量的变化筛选目标酶的抑制剂。
[0023]本发明将哺乳动物过表达磁珠固定化ACE偶联LC-MS—体化技术应用于ACE酶抑制剂筛选，和现有方法相比，具有以下优点:
[0024]1、本发明通过在哺乳动物细胞中过表达ACE更能保证酶的功能，FLAG标签的使用将过表达的ACE—步纯化并固定在ANT1-DDK磁珠上，无需购买商品化纯酶，操作上与从动物组织提取酶相比较更为简便，很大程度上减少因为操作繁琐导致酶失活的现象;通过快速磁性分离即可实现反应缓冲液与固定化酶的分离，无需离心、透析等复杂步骤，可增加产物收率、提高产物质量;且具有固定化酶贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控等优点；
[0025]2、本发明使用液质联用技术(LC-MS)检测待测物的ACE抑制活性，并使用内标减少系统误差，在高效液相分离的同时利用质谱SIM模式检测反应产物，可减少杂质对活性检测的影响，具有精确性尚、重复性好、灵敏度尚的特点。
【附图说明】
[0026]图1为实施例结果(I)中不同比例磁珠与总蛋白孵育后的westernblot结果图，
[0027]图2为实施例结果(I)中总蛋白与磁珠不同孵育时间的western blot结果图；
[0028]图3为实施例结果(2)中产物马尿酸的标准曲线；
[0029 ]图4为实施例结果(3)中阳性药卡托普利浓度抑制率曲线；
[0030]图5为实施例结果(3)中阳性药卡托普利浓度的对数与抑制率曲线图；
[0031]图6为实施例结果(4)中空白对照组S頂模式下的提取离子流图；
[0032]图7为实施例结果(4)中给药组S頂模式下的提取离子流图；
[0033]图8为实施例结果(5)中空白对照组S頂模式下的提取离子流图；
[0034]图9为实施例结果(5)中给药组S頂模式下的提取离子流图。
【具体实施方式】
[0035]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详述，但本发明的实施方式不限于此。
[0036]实施例
[0037]I实验材料与仪器
[0038](I)细胞及质粒:293T/17细胞(ATCC，美国)；感受态DH5a细胞(南京阿恩地，中国)；ACE 质粒(origene，美国)。
[0039](2)试剂:DMEM培养基(Corning，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；青霉素1kU/mL及链霉素 I OkU/mL (Invitrogen，美国)；Opt1-MEM 培养基(Invitrogen，美国)；SuperSignalWest Pico化学发光底物(Thermo，美国)；色谱纯乙腈(Tedia，美国)；Mill1-Q系统制备(Millipore，美国)；马尿酰-组氨酰-亮氨酸(sigma，美国)；马尿酸(sigma，美国)；卡托普利(sigma，美国)；普萘洛尔(sigma，美国);ANTI_DDK磁珠(origene，美国)。
[0040](3)转染试剂:
[0041 ] ExFect?转染试剂(Vazyme，中国)；Lipofectamine 2000( Invitrogen，美国)；Lipofectamine 3000( Invitrogen，美国)。
[0042](4)三种裂解液:
[0043]A:RIPA-NP40(2mM Tris-HCl，150mM NaCl，I%NP_40，ImM EDTA，pH 7.0)；
[0044]B:RIPA-TritonX100(2mM Tris-HCl，150mM NaCl, I %Triton-XlOO, ImM EDTA，pH7.0)；
[0045]C: M-PER (Thermo，美国)。
[0046](5)0.1M硼酸缓冲液:称取硼酸12.37g，加热溶解后定容至IL备用。量取175mL硼砂缓冲液与325mL硼酸缓冲液混匀，使用NaOH调节PH至8.3，加入17.532g NaCl，加蒸馏水定容至IL，即可得0.1M硼酸缓冲液(PH 8.3，含0】NaCl)。
[0047](6)仪器:Thermo Scientific 1300A2 型超净台(Thermo，美国)；倒置显微镜(Nikon，日本)；Synergy 2型酶标仪(B1tek，美国);C02培养箱(Thermo，美国);Frescol7离心机(Thermo，美国)；垂直电泳槽及等点聚胶仪(B1-Rad，美国)；化学发光成像系统(Tanon，中国)；Nano-100微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司，中国);KH_500DB型超声波提取器(100Hz，220V);磁力分选架(英诺，中国);Agilent 1100HPLC(Agilent，美国)配备双高压栗、脱气机、盘式自动进样器、柱温箱、VWD检测器和单四级杆检测器;Chemstat1n质谱工作站(Agi lent，美国)。
[0048]2实验方法
[0049](I)融合FLAG标签的ACE质粒在大肠杆菌内的转化、扩增和抽提
[0050]取融合FLAG标签的ACE质粒0.1yg置于1.5mL离心管内，加入20yL DH5a感受态细胞，轻吹打混匀后冰浴静置30min，然后移入42 °C金属浴静置热击90s后迅速移入冰浴内冷却3-5min，向离心管中加入480yL无菌液体LB培养基(不含抗生素)，吹打混匀后，37 °C摇床150rpm孵育4h(EP管内可见明显浑浊)，取上述转化后的感受态细胞适量，均匀涂抹于10mm固体LB培养基(含卡那霉素25yg/mL)，倒置培养，37 V孵箱内过夜培养至培养皿内可见明显菌落，挑取生长状态良好的菌落适量于液体LB培养基内(含卡那霉素25yg/mL)，37 V摇床220rpm孵育12h至培养瓶可见明显浑浊，4°(:保存备用，采用质粒提取试剂盒(TIANGEN公司)提取质粒，最终加入120yL TB缓冲液洗脱质粒，Nano-100测定DNA浓度。
[0051](2)293T/17细胞接种后瞬时转染并提取总蛋白
[0052]293Τ/17细胞接种于6孔板中，于37°C，5 %⑶2孵箱中培养至密度达到80% -90 %时进行转染，整个转染过程需在30min之内完成，转染方法如下:
[0053]a)对于每孔细胞，使用200yL Opt1-MEM培养基稀释5yg质粒，多孔操作可以批量制备，室温放置5min。
[0054]b)对于每孔细胞，使用200yL Opt1-MEM培养基稀释1yL ExFect?转染试剂，多孔操作可以批量制备，室温静置5min。
[0055]c)以1:1的比例将转染试剂-培养基混合物(第2步)缓慢滴加入质粒-培养基混合物(第I步)中，用移液器轻轻混匀后室温静置20min。
[0056]d)直接将上述质粒和转染试剂形成的复合物缓慢滴加到6孔板中，400yL/孔。
[0057]e)37°C，5%⑶2孵箱中培养36h，一般培养24h时可添加不含抗生素的新鲜培养基ImL/孑Lο
[0058]总蛋白提取:
[0059]弃去大部分培养基后，吹打细胞并收集至1.5mL离心管内，100rpm X 5min离心后加入I3BS吹打混匀洗涤(重复3次)，每孔细胞加入250yL RIPA-NP40裂解液、RIPA-Triton裂解液、M-Per裂解液中的一种(含cocktaiI总蛋白酶抑制剂)，冰浴摇床上裂解30min后，13，000\101^11，4°(:离心收集上清，804测定蛋白浓度在5?1(^8/4^。
[0060](3)免疫磁珠富集并固定化过表达的血管紧张素转化酶
[0061]a)取表面结合ant1-DDK多克隆抗体的免疫磁珠混悬液，加入1.5mL离心管中，将离心管置于磁珠分选架，静置120s，使磁珠贴于近磁铁的管壁一侧。
[0062]b)吸出管内溶剂(注意不要碰触聚集的磁珠)。
[0063]c)将离心管从分选架上取下，管内加入ImL空白RIPA裂解液(不加蛋白酶抑制剂)，混匀(轻轻摇动EP管，摇散磁珠，1s)，重新置于磁珠分选架，静置120s，除去管内的空白裂解液。
[0064]d)重复步骤③，清洗磁珠，除去原磁珠液中的叠氮钠等，活化磁珠。
[0065]e)将离心管从分选架上取下，加入适量空白RIPA裂解液(不加蛋白酶抑制剂)，混匀(轻轻摇动EP管，摇散磁珠，1s)，分装至1.5mL离心管。
[0066]f)将离心管重新置于磁珠分选架，静置120s，除去管内的空白裂解液。
[0067]g)取下离心管，加入转染目的质粒组的细胞裂解液，摇散磁珠，置于摇床，4°C反应12h0
[0068]h)将含有免疫磁珠与细胞裂解液反应12h后样品的离心管置于磁珠分选架静置120s，吸取管内上清液并置于新的1.5mL离心管中，加入6 X SDS-PAGE上样缓冲液，95°C金属浴lOmin，冷却后作为上清样品。
[0069]i)用空白RIPA裂解液清洗磁珠I次，硼酸盐缓冲液清洗2次，方法同步骤c)，弃去清洗液。
[0070]i)将离心管内留下的蛋白磁珠复合物重新溶于一定量空白RIPA裂解液中，加入6X SDS-PAGE上样缓冲液，950C金属浴1min，使目的蛋白与磁珠分离下来，12，OOOrpm离心5min，取上清液作为沉淀样品。
[0071]蛋白磁珠结合实验共对蛋白磁珠比例及孵育时间进行考察:取100yg、200yg、300yg、400yg、500yg总蛋白与5yL磁珠过夜孵育，不同孵育时间取300yg总蛋白与5yL磁珠进行孵育，共设Ih、2h、4h、过夜四个时间点。取出上清后加入ImL空白RIPA裂解液清洗3次，并加入6XSDS-PAGE上样缓冲液变性，western blot检测ACE及内参β-actin富集情况。
[0072](4)磁珠固定化ACE酶活性检测实验
[0073]取5yL蛋白磁珠复合物与150yL含25μΜ底物HHL的硼酸缓冲液在37°C摇床220rpm孵育90min，磁性分离取出反应缓冲液，加入等体积含0.5μΜ普萘洛尔的乙腈溶液，涡旋后13，OOOrpm离心I Omin，LC-MS进行检测。
[0074]液相及质谱条件为:
[0075]色谱柱:VenusilXBP C18 4.6 X 200mm，5μηι;流动相:A相0.I % 甲酸水，B相乙臆；梯度洗脱:0-811^11，25%8;8-1211^11，25-70%8;12-1811^11，70-95%8;18-2511^11，95%8;进样量:1yL ；流速:0.8mL/min ；检测波长:228nm。质谱条件:干燥载气流速:IIL/min ；干燥气体温度:325°C;雾化压力:45psig;毛细管电压:3500V;裂解电压:120V;采用正离子模式进行检测，提取离子为产物马尿酸m/z 180、底物马尿酰-组氨酰-亮氨酸m/z 430、内标普萘洛尔m/z 260ο
[0076]马尿酸标准曲线:精密称取并配置马尿酸lmg/mL母液，稀释至0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0yg/mL八个浓度，各取50yL分别加入50yL含0.5μΜ普萘洛尔的乙腈溶液，得到马尿酸终浓度为0.025、0.05、0.10、0.250、0.50、1.00、2.50、5.0(^8/111匕涡旋后13，000离心10min，LC-MS进行分析；由马尿酸做标准曲线计算磁珠固定化ACE中马尿酸的生成量。酶活力定义:在上述条件下每分钟水解25μΜ马尿酰-组氨酰-亮氨酸生成ΙμΜ马尿酸所需要的酶量为一个单位(Unit)。
[0077](5)阳性药验证固定化ACE活性
[0078]取ImM卡托普利母液(硼酸缓冲液溶解)母液，加入适量硼酸缓冲液稀释至960nM、480nM、240nM、120nM、60nM、30nM、15nM、7.5nM、3.75nM9 个浓度，实验组为不同浓度的卡托普利，空白对照组为相同体积的硼酸盐缓冲液，取30yL不同浓度药物加至150yL底物中，37°C孵育5min，取150yL含不同浓度的卡托普利的底物溶液与5yL蛋白磁珠复合物37 V摇床孵育90min，取出反应缓冲液，加入等体积含0.5μΜ内标普萘洛尔的乙腈溶液，涡旋后13，OOOrpm离心1min，LC-MS进行检测，计算卡托普利ICso值。
[0079]磁珠固定化ACE酶抑制率计算
[0080]通过上述方法得到反应组和空白对照组反应产物HA和内标的峰面积，待测物的ACE抑制率IP为(AC/ISc-AS/ISa) X 100/AC/ISc，其中:IP为样品对ACE的抑制率;AC为空白对照组中HA的峰面积;AS为反应组中HA的峰面积，IS为内标峰面积。
[0081 ] (6)三七提取物磁珠固定化ACE抑制活性实验
[0082]称取三七药材粉末1g，放入锥形瓶中，加入100mL70%甲醇，超声处理两次，每次lh，过滤，合并滤液;减压浓缩，再经冷冻干燥，制备所得冻干粉保存于密闭的干燥器中。精密称取一定量三七冻干粉，DMSO进行溶解，硼酸缓冲盐稀释至终浓度60mg/mL，取30yL三七提取物与150yL含25μΜ底物HHL的硼酸缓冲液37 °C孵育5min，空白对照组为取30yL硼酸缓冲盐，分别取150yL加至2yL蛋白磁珠复合物中，37°C220rpm摇床孵育90min，磁性分离取出上清，加入等体积含0.5μΜ内标普萘洛尔的乙腈溶液，涡旋后13，OOOrpm离心1min，LC-MS进行检测，计算抑制率。
[0083](7)丹参提取物ACE抑制活性实验
[0084]称取丹参药材粉末10g，放入锥形瓶中，加10mL90%乙醇，超声Ih，过滤。滤液55°(:减压浓缩，再经冷冻干燥，制备所得冻干粉保存于密闭的干燥器中。精密称取-定量丹参冻干粉，DMSO进行溶解，硼酸缓冲液稀释至终浓度60mg/mL，取30yL丹参总提物与150yL含25μΜ底物HHL的硼酸缓冲液37 °C孵育5min，空白对照组为取30yL硼酸缓冲盐，分别取150yL加至2yL蛋白磁珠复合物中，37 °C 220rpm摇床反应90min，磁性分离取出上清，加入等体积含
0.5μΜ内标普萘洛尔的乙腈溶液，涡旋后13，OOOrpm离心1min，LC-MS检测，计算抑制率。
[0085]3实验结果
[0086](I)免疫磁珠富集并固定化过表达的血管紧张素转化酶
[0087]蛋白磁珠不同比例及孵育时间实验结果见图1和图2，总蛋白组含有过表达ACE和内参β-actin，沉淀组只含ACE，说明磁珠能选择性固定化ACE，而不会沉淀其他蛋白。从结果中可以看出当蛋白比例增加时，沉淀组中ACE增加，当总蛋白为300yg时，继续增加蛋白的量，固定化ACE不再增加，因此，蛋白磁珠比例为60yg总蛋白AxL磁珠。同理，孵育时间为过夜孵育。
[0088](2)磁珠固定化ACE酶活性检测实验结果
[0089]将各浓度HA峰面积/内标峰面积与浓度作图，结果见图3，结果显示，HA浓度范围在25ng/mL-5yg/mL时，线性范围良好，5yL磁珠与300yg总蛋白过夜孵育，得到5yL蛋白磁珠复合物，与15(^(25口10底物冊1^，37°(:孵育901^11后，产物与内标的比值为1.441975886，代入标准曲线得到HA的含量为3.158643yg，即为0.017646μΜ。将在此条件下每分钟生成ΙμΜ产物时所需酶量定义为IU，此时，固定化ACE酶量为0.196067mU。
[0090](3)阳性药卡托普利抑ffjljACE IC5q的测定结果
[0091]卡托普利浓度抑制率曲线及浓度的对数值与抑制率关系如图4和图5所示:浓度的对数值与抑制率关系呈S型曲线，经计算IC5q为3.302nM。本实验测得的IC5q与文献报道相当，说明此方法可行。
[0092](4)三七提取物ACE抑制活性实验结果
[0093]LC-MS检测空白对照组和给药组结果如图6和图7，空白对照组HA的出峰时间为6.888min峰面积为169533.4、册1的出峰时间为8.799111丨11峰面积为2591313.5、15的出峰时间为14.787min峰面积为538086.5，给药组HA的出峰时间为6.817min峰面积为45652.7、HHL的出峰时间为8.702min峰面积为5399599.5、15的出峰时间为14.81511^11峰面积为522406.4。利用软件计算空白对照组和实验组SM模式下HA和IS峰面积，按照ACE酶抑制率公式进行计算，10mg/mL三七提取物ACE抑制率为72.3 %。重复测定三次，计算抑制率，其RSD为4.76 %。该方法精密度高、重复性好。
[0094](5)丹参提取物ACE抑制活性实验结果
[0095]LC-MS检测S頂模式下空白对照组和给药组结果如图8和图9，空白对照组HA的出峰时间为6.923min峰面积为193242.5、HHL的出峰时间为8.604min峰面积为2866574.5、IS的出峰时间为14.857min峰面积为475848.9，给药组似的出峰时间为6.926111丨11峰面积为106959.1、冊1^的出峰时间为8.201111丨11峰面积为3794112.3、15的出峰时间为14.871111丨11峰面积为549610.8，利用软件计算空白对照组和实验组SM模式下HA和IS峰面积。按照ACE酶抑制率公式进行计算，10mg/mL丹参总提物ACE的抑制率为52.1 %。重复测定三次，计算抑制率，其RSD为3.37%o该方法精密度高、重复性好。
【主权项】
1.一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1:融合FLAG标签的血管紧张素转化酶质粒在大肠杆菌内的转化、扩增和抽提； 步骤2: 293T/17细胞接种后瞬时转染步骤I中抽提质粒； 步骤3:提取步骤2中细胞的胞浆总蛋白； 步骤4:免疫磁珠富集并固定化步骤3中过表达的血管紧张素转化酶； 步骤5:建立检测磁珠固定化ACE活性的LC-MS方法； 步骤6:阳性药验证步骤4中所富集并固定化酶的活性； 步骤7:利用步骤4中富集并固定化的靶标酶，筛选血管紧张素转化酶抑制剂。2.如权利要求1所述的一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，其特征在于，步骤I中，融合FLAG标签的血管紧张素转化酶质粒在大肠杆菌内的转化的时间为90s，质粒扩增时间为2-4h，质粒抽提最终洗脱液为100_200yL。3.如权利要求1所述的一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，其特征在于，步骤2中，293T细胞的接种密度为0.8 X 15个/cm2-l.5 X 15个/cm2，接种后10_24h进行瞬时转染，瞬时转染采用转染试剂转染，转染试剂为Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000和Exfec?中的一种。4.如权利要求1所述的一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，其特征在于，步骤3中，提取细胞胞浆总蛋白的时间为瞬时转染后24-48h，提取细胞胞浆总蛋白的方法为超声裂解法和裂解液裂解法中的一种，裂解液采用RIPA-NP40、RIPA-Triton-X100和M-PER中的一种，裂解时间为15min-60min，裂解温度为4°C。5.如权利要求1所述的一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，其特征在于，步骤4中，免疫磁珠富集靶标酶的用量为1:20-1:100 (磁珠用量:胞浆总蛋白量，yL: yg)，免疫磁珠固定化靶标酶的温度为4°C_37°C，固定化时间为2h-24h。6.如权利要求1所述的一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，其特征在于，步骤5中，采用高效液相联合质谱法进行检测，以普萘洛尔为内标，跟踪检测产物产生量评价靶标酶活性。7.如权利要求1所述的一种筛选血管紧张素转化酶抑制剂的新方法，其特征在于，步骤7中，所筛选对象为小分子单体化合物、小分子混合物、天然药物提取物、多肽单体、多肽混合物。
【文档编号】G01N30/08GK105866260SQ201610167749
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月21日
【发明人】陈君, 贾冰洁, 汤维维, 李萍
【申请人】中国药科大学