一种泊马度胺有关物质的高效液相色谱分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种泊马度胺有关物质的高效液相色谱分析方法，该方法采用反相色谱柱及紫外检测器，以乙腈?水?磷酸为流动相，进行梯度洗脱。本方法可同时分析泊马度胺原料及其制剂中的所有已知杂质，并且可通过加校正因子的主成分自身对照法有效控制各已知杂质含量，各杂质峰之间及主峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，主峰与各杂质峰峰纯度均为1.0。本发明为泊马度胺原料及其制剂的质量控制分析提供了简易、可靠的分析方法。
【专利说明】
一种泊马度胺有关物质的高效液相色谱分析方法 一、
技术领域
[0001] 本发明涉及一种化学药物纯度的分析方法，具体地说是一种泊马度胺有关物质的 高效液相色谱分析方法。 二、
【背景技术】
[0002] 泊马度胺(Macitentan)，化学名为(RS)-4-氨基-2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-异吲哚 啉-1，3-二酮，化学结构式如下：
[0004] 泊马度胺是由美国塞尔基因（Celgene)公司研制开发的继沙利度胺和来那度胺之 后的第三个免疫调节剂类药物，适用于既往接受过至少两种药物治疗[包括来那度胺 (lenalidomide)和硼替佐米(bortezomib)]且最近治疗进行中或治疗完成60天内疾病进展 的多发性骨髓瘤患者。
[0005] 泊马度胺的通用合成方法在专利US2007004920及US5635517中已公开，根据合成 工艺分析，其杂质主要来源于合成过程中引入的反应原料(杂质G、杂质F或杂质H)、合成中 间体(杂质B)、反应副产物(杂质A、杂质C、杂质I)及降解杂质（杂质C、杂质D、杂质E)，其中杂 质F或杂质Η为酸酐结构，不稳定，实际检测的是其水解杂质3-硝基邻苯二甲酸或3-氨基邻 苯二甲酸;泊马度胺降解杂质与其结构中哌啶酮和邻苯二甲酰亚胺结构稳定性有关，其中 哌啶酮结构在酸或碱中易开环生成杂质D或杂质Ε，邻苯二甲酰亚胺结构上的氨基易氧化生 成杂质C;杂质Α为工艺杂质，结构与泊马度胺类似，实验证明该杂质结晶难除，并且由于生 产工艺的原因，现有的市售原料(杂质F或杂质H)均会引入邻苯二甲酸酐或邻苯二甲酸，因 此，在泊马度胺合成中的杂质A的生成不可避免。另外，发明人通过试验发现泊马度胺中可 检出的有关物质主要为杂质A、杂质B及杂质C。
[0006] 专利CN201310683222.3公开了一种测定泊马度胺及其有关物质的方法，仅研究了 工艺杂质杂质B、杂质G、杂质F、杂质H、杂质I，未对杂质A、杂质C、杂质D、杂质E进行定位，方 法局限性明显。专利CN201510182078.4公开的高效液相色谱检测分离泊马度胺有关物质的 方法未对杂质A、杂质E、杂质I、杂质J进行定位，应用范围受限。
[0007] 目前建立在全面杂质谱分析基础上的泊马度胺原料及其制剂分析方法还没有相 关的文献报道。 三、
【发明内容】
[0008] 本发明针对现有文献对泊马度胺原料及其制剂杂质鉴定研究的缺失，目的在于提 供一种泊马度胺有关物质的高效液相色谱分析方法。本发明通过工艺试制、强制降解试验 对泊马度胺杂质进行富集、分离提纯，鉴定了9个主要已知杂质，并且对杂质进行了溯源归 属，包括泊马度胺反应原料(杂质G、杂质F或杂质Η)、合成中间体(杂质B)、反应副产物(杂质 A、杂质C、杂质I、杂质J)及降解杂质(杂质C、杂质D、杂质E)。
[0010]发明人曾试图通过等度洗脱分离各已知杂质，但在保证各杂质达到基线分离的情 况下色谱保留时间大于2h，耗时，不实用。因此，改用梯度洗脱法，经对流动相组成及比例的 优化筛选，确定本发明的分析方法。同时按中国药典2015年版四部通则〈0512> (高效液相色 谱法)及通则〈9101〉（药品质量标准分析方法验证指导原则）的定义和验证方法，进行专属 性验证，结果表明该方法可同时分析泊马度胺原料及其制剂中的所有已知杂质，并且可通 过外标法和自身对照法有效控制各已知杂质含量，各杂质峰之间及主峰与相邻杂质峰之间 的分离度均大于1.5,主峰与各杂质峰峰纯度均为1.0。
[0011] 所述峰纯度是指采用配有相应分析软件的光二极管阵列检测器，采集、记录、分析 经色谱柱分离组份的光谱数据，自动生成的表征特定分离组份对应的光谱特征一致性的加 权值。
[0012] 本发明泊马度胺有关物质的高效液相色谱分析方法，采用反相色谱柱及紫外检测 器，是以乙腈-水-磷酸的混合溶液为流动相，进行梯度洗脱，包括如下步骤：
[0013] ⑴样品配制：取泊马度胺原料或制剂粉末，用体积比为50:50:0.1的乙腈-7K-磷 酸溶液(磷酸的体积以质量浓度85%的磷酸溶液计，乙腈为色谱纯)超声溶解，过滤或者离 心，配制成浓度为0.1 -0.5mg/ml的泊马度胺溶液；
[0014] (2)色谱条件设置：采用反相C18柱，柱温设置在20-50°C ;以体积比为5 : 90-98 : 0.05-0.15的乙腈-水-磷酸混合液为流动相A，以体积比为25:70-80:0.05-0.15的乙腈-水-磷酸混合液为流动相B，进行梯度洗脱;流速为0.5-2. Oml/min;检测波长为220-270nm;洗脱 液由流动相A和流动相B构成；
[0015] (3)检测:取步骤(1)配制的泊马度胺溶液，进样10-50μ1，记录色谱图。
[0016] 步骤（2)中反相C18 柱选自 Agilent C18(150X4.6mm，5ym)、Apollo C18(150X 4.6mm，5ym)或Luna C18( 150 X4.6mm，5ym)，优选Agilent C18( 150 X4.6mm，5ym) 〇
[0017] 步骤(2)中所述流动相A中乙腈、7尺和磷酸按体积比优选为5:90-95:0.05-0.15，最 优为5:95:0.1;流动相B中乙腈、水和磷酸按体积比优选为25:70-75:0.05-0.15，最优为25: 75:0.1。所述磷酸的质量浓度为85 %。
[0018]步骤（2)中梯度洗脱程序为：0-2min流动相A占洗脱液的体积百分比为100 %， 2111；[11-151]1；[11流动相六占洗脱液的体积百分比由100%逐步递减至0%，151]1；[11-601]1；[11流动相八 占洗脱液的体积百分比为0,60min-61min流动相A占洗脱液的体积百分比由0逐步递增至 100%，61min-70min流动相Α占洗脱液的体积百分比为100%。
[0019] 更优的洗脱程序为:0-2min流动相A占洗脱液的体积百分比为100%，2min-15min 流动相A占洗脱液的体积百分比由100 %逐步递减至0%，15min-40min流动相A占洗脱液的 体积百分比为〇，40min-41min流动相A占洗脱液的体积百分比由0逐步递增至100%，41min-50min流动相A占洗脱液的体积百分比为100 %。
[0020] 步骤(2)中流速为0 · 5-1 · 5ml/min;检测波长为220-250nm。
[0021] 步骤(3)中进样量为20μ1。
[0022] 采用本发明方法可有效地控制泊马度胺原料及制剂中的有关物质，9个已知杂质 均能在一张图谱上分析出来，各杂质峰之间及主峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5， 主峰与各杂质峰峰纯度均为1.0。分析过程见实施例1，典型色谱图见图1，计算结果见表1。
[0023] 表1泊马度胺与各已知杂质色谱分离参数结果
[0026]采用本发明方法能够分析泊马度胺在各种复杂环境下的降解杂质，方法专属性 强。按中国药典2015年版四部通则〈0512>(高效液相色谱法)及通则〈9101 >(药品质量标准 分析方法验证指导原则）的定义和验证方法，将泊马度胺原料或制剂粉末分别用酸、碱、高 温、氧化、光照破坏，制得破坏样品，按本发明方法分别采集各破坏样品色谱图，分析过程见 实施例2,典型色谱图见图2-7。结果表明该方法能够分析经酸、碱、高温、氧化、光照破坏的 样品，主峰与各杂质峰均能达到基线分离，主峰纯度均为1.0。
[0027]采用本发明方法能对各已知杂质进行定量分析。按中国药典2015年版四部通则〈 0512〉(高效液相色谱法)及通则〈9101〉(药品质量标准分析方法验证指导原则)的定义和验 证方法，采用杂质对照法对泊马度胺9个已知杂质的检测限、定量限进行检测，结果表明该 方法对各杂质的响应值高，能有效控制各已知杂质，结果见表2。
[0028]表2泊马度胺已知杂质定量分析验证参数结果
[0030] 本发明首次对泊马度胺原料及其制剂杂质进行溯源归属，鉴定了 9个已知杂质，为 泊马度胺原料及其制剂有关物质研究提供了可靠的杂质谱参考，具有较大的积极进步效果 和实际应用价值。 四、【附图说明】
[0031] 图1是实施例1泊马度胺与已知杂质的混合色谱图。
[0032] 图2是实施例2酸破坏色谱图。
[0033]图3是实施例2碱破坏色谱图。
[0034]图4是实施例2高温破坏色谱图。
[0035]图5是实施例2氧化破坏色谱图。
[0036]图6是实施例2光照破坏色谱图。
[0037] 图7是实施例2泊马度胺胶囊(lmg)未破坏样品色谱图。
[0038] 图8是实施例3泊马度胺有关物质色谱图。
[0039]采用本发明分析方法定位已知杂质（杂质A-I，图1)，主峰与各杂质峰均能达到基 线分离。采用本发明分析方法泊马度胺及其胶囊有关物质，结果泊马度胺原料仅检出微量 杂质A、杂质B和杂质C(保留时间依次为：19.61411^11、20.4461^11、18.4271^11，图8)，泊马度胺 胶囊则检出微量杂质A和杂质C(保留时间依次为：19.72711^11、18.4551^11，图7)。采用本发明 分析方法考察泊马度胺制剂样品在酸、碱、高温、光照、氧化等因素影响下的降解产物，与降 解前样品比较，结果表明本品对高温、光较稳定，高温破坏检出微量杂质A、杂质B和杂质C (保留时间依次为：19.74411^11、20.58〇1^11、18.4921^11，图4)，光破坏检出微量杂质4、杂质8 和杂质C(保留时间依次为：19.74311^11、20.62〇1^11、18.5171^11，图6) ;本品在酸、碱、氧化条 件下不稳定，其中酸破坏检出杂质D(保留时间：6.164min)和5个未知杂质（图2)，碱破坏检 出杂质B(保留时间：20.528min)、杂质C(保留时间：18.489min)、杂质D(保留时间： 6.149min)和5个未知杂质（图3)，氧化破坏检出杂质A(保留时间：19.798min)、杂质B(保留 时间：20.102min)、杂质F(保留时间：13.11111^11)、杂质1(保留时间 ：17.2151^11)和8个未知 杂质（图5)。 五、【具体实施方式】
[0040] 实施例1:
[0041] 检测仪器与色谱条件：
[0042] 高效液相色谱仪:LC-10AD栗，Sro-ΜΙΟΑ检测器
[0043] 色谱柱:Agilent C18(150X4.6mm，5ym);流动相A:体积比为5:95:0.1 的乙腈_水_ 磷酸溶液；流动相B:体积比为25 : 75 : 0.1的乙腈-水-磷酸溶液；检测波长：226nm;流速： 1 · Oml/min;进样量:20μ1。
[0044] 实验步骤：
[0045] (D样品配制：
[0046]取泊马度胺、已知杂质A-Ι各适量，加体积比50: 50:0.1的乙腈-水-磷酸溶液超声 溶解并定量稀释至适宜浓度的混合溶液，摇匀，作为样品溶液。
[0047] (2)梯度洗脱程序设置：
[0049] (3)检测:取上述样品溶液，分别进样20μ1，分别记录色谱图。
[0050] 典型色谱图见图1。
[0051 ] 实施例2:
[0052]检测仪器与色谱条件：
[0053] 高效液相色谱仪:LC-10AD栗，Sro-ΜΙΟΑ检测器
[0054] 色谱柱:Agilent (：18(150\4.6111111，5以111);流动相六:同实施例1，流动相8 :同实施例 1;流速：1 .Oml/min;检测波长:226nm;进样体积：20μ1〇
[0055] (D样品配制：
[0056] 酸破坏:取泊马度胺胶囊内容物，研细，取细粉适量(约相当于含泊马度胺20mg)， 置100ml量瓶中，加lmol/L盐酸溶液4ml，置100°C水浴1小时，取出放冷，加lmol/L氢氧化钠 溶液4ml中和，加体积比50 : 50 :0.1的乙腈-水-磷酸溶液适量超声处理使溶解并稀释至刻 度，摇匀，过滤，作为酸破坏样品；
[0057] 碱破坏:取泊马度胺胶囊内容物，研细，取细粉适量(约相当于含泊马度胺20mg)， 置100ml量瓶中，加0 · lmol/L的碳酸钠溶液4ml，室温放置2小时，加0 · 2mol/L盐酸溶液4ml中 和，加体积比50:50:0.1的乙腈-水-磷酸溶液适量超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，过 滤，作为碱破坏样品；
[0058] 高温破坏:取泊马度胺胶囊内容物，研细，于150 °C加热5小时，取细粉适量(约相当 于含泊马度胺20mg)，置100ml量瓶中，加体积比50:50:0.1的乙腈-水-磷酸溶液适量超声处 理使溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为高温破坏样品；
[0059] 氧化破坏：取泊马度胺胶囊内容物，研细，取细粉适量（约相当于含泊马度胺 20mg)，置100ml量瓶中，加30 %过氧化氢溶液4ml，置100 °C水浴1小时，取出放冷，加体积比 50:50:0.1的乙腈-水-磷酸溶液适量超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为氧化 破坏样品；
[0060] 光破坏:取泊马度胺胶囊内容物，研细，取细粉适量(约相当于含泊马度胺20mg)， 置100ml量瓶中，加体积比50:50:0.1的乙腈-水-磷酸溶液适量超声处理使溶解并稀释至刻 度，摇匀，置强光(冷白色荧光灯+近紫外灯)下照射72小时，摇匀，过滤，作为光破坏样品；
[0061] 未破坏:取泊马度胺胶囊内容物，研细，取细粉适量(约相当于含泊马度胺20mg)， 置100ml量瓶中，加体积比50:50:0.1的乙腈-水-磷酸溶液适量超声处理使溶解并稀释至刻 度，摇匀，过滤，作为未坏样品。
[0062] (2)梯度洗脱程序设置:同实施例1。
[0063] (3)检测:取上述各样品溶液，分别进样20μ1，分别记录色谱图。
[0064] 典型色谱图见图2-7。
[0065] 实施例3:
[0066]检测仪器与色谱条件：
[0067] 高效液相色谱仪:UltiMate 3000栗，UltiMate 3000紫外检测器
[0068] 色谱柱:Agilent (：18(150\4.6111111，5以111);流动相六:同实施例1，流动相8 :同实施例 1;流速：1 .Oml/min;检测波长:226nm;进样体积：20μ1〇
[0069] 实验步骤：
[0070] (1)样品配制：取泊马度胺20mg，置100ml量瓶中，用体积比50: 50:0.1的乙腈_水_ 磷酸溶液超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。
[0071] (2)梯度洗脱程序设置：
[0073] (3)检测:取上述各样品溶液，进样20μ1，记录色谱图。
[0074] 典型色谱图见图8。
【主权项】
1. 一种泊马度胺有关物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 样品配制：取泊马度胺原料或制剂粉末，用体积比为50:50:0.1的乙腈-水-磷酸溶 液超声溶解，过滤或者离心，配制成浓度为〇. 1 -〇. 5mg/ml的泊马度胺溶液； (2) 色谱条件设置:采用反相C18柱，柱温设置在20-50°C ;以体积比为5 :90-98: 0. Οδ-Ο. 15 的乙腈-水-磷酸混合液为流动相 A， 以体积比为 25: 70-80:0.05-0.15 的乙腈-水-磷酸 混合液为流动相Β，进行梯度洗脱;流速为0.5-2. Oml/min;检测波长为220-270nm;洗脱液由 流动相A和流动相B构成； (3) 检测:取步骤（1)配制的泊马度胺溶液，进样10-50μ1，记录色谱图。2. 根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤（2)中反相C18柱选自 Agilent C18(150X4.6mm，5ym)、Apollo C18(150X4.6mm，5 μπι)或Luna C18(150X4.6mm，5ym)〇3. 根据权利要求1或2所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤(2)中反相C18柱为Agilent C18( 150X4·6πιπι，5μπι)〇4. 根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤(2)中所述流动相A中乙腈、水和磷酸按体积比为5:90-95:0.05-0.15 ;流动相B中 乙腈、水和磷酸按体积比为25:70-75:0.05-0.15。5. 根据权利要求1或4所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤(2)中所述流动相A中乙腈、水和磷酸按体积比为5: 95:0.1;流动相B中乙腈、水和 磷酸按体积比为25:75:0.1。6. 根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤（2)中梯度洗脱程序为：0-2min流动相A占洗脱液的体积百分比为100 %，2min-15min流动相A占洗脱液的体积百分比由100%逐步递减至0%，15min-60min流动相A占洗脱 液的体积百分比为〇，60min-61min流动相A占洗脱液的体积百分比由0逐步递增至100 %， 6 lmin-70miη流动相A占洗脱液的体积百分比为100 %。7. 根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤（2)中梯度洗脱程序为：0-2min流动相A占洗脱液的体积百分比为100 %，2min-15min流动相A占洗脱液的体积百分比由100%逐步递减至0%，15min-40min流动相A占洗脱 液的体积百分比为〇，40min-41min流动相A占洗脱液的体积百分比由0逐步递增至100 %， 4lmin-50miη流动相A占洗脱液的体积百分比为100 %。8. 根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤(2)中流速为0 · 5-1 · 5ml/min;检测波长为220-250nm〇9. 根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于： 步骤(3)中进样量为20μ1。
【文档编号】G01N30/02GK105866297SQ201610475929
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】吴标, 李晓梅, 施伶俐, 崔红晓
【申请人】合肥久诺医药科技有限公司