一种基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针，由光纤珐珀干涉结构器件、光纤珐珀干涉结构器件端面的化学修饰层以及固定在化学修饰层上的生物分子敏感膜构成，光纤珐珀干涉结构器件由一段光子晶体光纤熔接两段普通单模光纤制成；化学修饰层为生物相容性材料；生物分子敏感膜为具有特异性识别功能生物分子。检测时，待测物与探针上的生物分子发生特异性结合，引起生物分子敏感层的有效折射率和厚度变化，通过光纤珐珀干涉传感系统测得干涉谱的变化，实现对待测物的检测。该生物传感探针结构紧凑、制作简单、灵敏度高，消除了温度、光源扰动等对检测光信号的影响，可实现对生物分子的免标记检测和生物反应的动态实时监测。
【专利说明】
一种基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针
技术领域
[0001]本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针。
【背景技术】
[0002]生物传感技术对于分子生物学、临床医学和免疫检测、环境和食品安全检测、药物研制及军事生化检测等具有重要的研究和应用价值。生物传感器按是否使用标记物可分为两类:一类是标记型生物传感器，检测时先用荧光素、放射性同位素或酶等标记物对待测物进行标记，然后通过检测标记物的信号来获取待测物的信息；另一类是免标记型生物传感器，不需要对待测物进行标记，而是直接通过生物复合物形成时的物理、化学变化对生物对象进行检测，其中免标记光纤生物传感器是免标记生物传感器家族中的重要一员。
[0003]光纤生物传感器是上世纪70年代诞生的新型传感技术，它将具有特异性识别功能的生物分子(如酶、抗原、抗体、核酸、病原体等)固定在光纤表面，利用生物反应引起的光参数(光强、波长、相位等)变化，对待测物进行检测。与传统的电化学生物传感器相比，光纤生物传感器具有体积小、结构灵活、抗电磁干扰、耐腐蚀、生物相容性好、灵敏度高、成本低、可实现原位在线以及远距离监测等优点，尤其适用于对生物活体的体内检测。
[0004]免标记光纤生物传感器可直接将生物反应引起的生物分子层有效折射率或厚度的变化转变为可测光信号，不需要使用标记物，极大地简化了操作过程，并且不会污染样本，基本不影响生物分子的活性，安全可靠，可对生物反应过程进行实时、原位及真实的检测，具有极大的应用价值，近年来受到广泛关注。
[0005]目前研究较多的免标记光纤生物传感器有光纤表面等离子体共振传感器、光纤光栅传感器、光纤倏逝波传感器等。然而现有的免标记光纤生物传感器仍存在诸多问题，包括:光纤表面等离子体共振(SPR)传感器往往需要在光纤表面进行金属镀膜处理，利用识别反应发生时金属薄膜表面的折射率变化继而改变表面波的共振角度这一变量来检测，但SPR生物传感器制作工艺比较复杂，制备和使用成本高;光纤光栅传感器利用传输光谱的谐振波长变化来检测，但其普遍存在温度交叉敏感的问题;光纤倏逝波传感器需要将光纤进行腐蚀或拉锥处理，机械强度差，易损坏，其光传输损耗大，并且检测光强信号容易受到光源扰动及外界环境因素的干扰，稳定性较差。
[0006]生物传感检测领域往往具有自身的特殊性，检测环境的复杂、待测物的微量低浓度以及对于快速便捷检测的需求等，对生物传感器的小型化、稳定可靠、精确灵敏及快速简便等提出了较高的要求。针对生物传感检测，如何开发出适用性强、制备简单成本低、稳定性高、复用性好、检测灵敏度高的免标记光纤生物传感器，仍是本领域技术人员亟待解决的问题。
【发明内容】
[0007]针对现有技术中免标记光纤生物传感器存在的问题，发明人通过研究，结合光纤传感器和生物传感检测技术，提出一种基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针，该生物传感探针具有结构紧凑、制作简单、灵敏度高等特点，消除了温度、光源扰动等对检测光信号的影响，能够实现对生物分子的免标记检测和生物反应的动态实时监测。
[0008]具体的，本发明涉及以下技术方案:
[0009]首先，本发明的目的之一在于提供一种基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针，由光纤珐珀干涉结构器件、光纤珐珀干涉结构器件端面的化学修饰层以及固定在化学修饰层上的生物分子敏感膜构成，其中，光纤珐珀干涉结构器件由一段光子晶体光纤熔接两段普通单模光纤制作而成。
[0010]本发明所述的光纤珐珀干涉结构器件为一种在线型光纤珐珀传感器结构，即采用一段光子晶体光纤作为一个珐珀干涉腔，利用最简单的电弧放电光纤熔接方法将该段光子晶体光纤与两根普通单模光纤熔接起来，并将尾端的单模光纤切至一定长度，形成反射式探针型光纤珐珀传感器结构。根据菲涅尔反射原理，由于界面两边折射率不同，光子晶体光纤与单模光纤的熔接界面以及单模光纤末端端面会形成三个反射面，产生的反射光相互干涉形成珐珀干涉谱。
[0011]优选的技术方案中，所述光子晶体光纤为空芯光子晶体光纤。空芯光子晶体光纤具有特殊的空芯结构，和普通单模光纤纤芯的折射率差较大，根据菲涅尔反射理论，较大的折射率差能提供较大的界面反射率，并且空芯光子晶体光纤的光传输损耗较小，从而有利于提高干涉谱的对比度和传感器的信噪比。此外，空芯光子晶体光纤具有较低的温度敏感性。所述空心光子晶体光纤的使用，明显提高了珐珀干涉传感器检测的温度稳定性、分辨率和检测精度，降低了传输损耗。
[0012]所述化学修饰层为涂覆在光纤珐珀干涉仪端面的生物相容性材料，包括水凝胶、聚合电解质、氧化石墨烯等材料，以此作为固定生物分子的基底，有利于提高生物分子固定密度，保持生物分子的活性。发明人通过研究发现，生物相容性材料，如水凝胶、聚合电解质、氧化石墨烯等材料的化学修饰层要明显优于偶联反应或自组装的生物材料(如生物素-蛋白偶联)；水凝胶、聚合电解质、氧化石墨烯等材料的化学修饰层，接触光纤珐珀干涉结构器件的端面，直接影响反射条纹对比度，通过其可进一步提高本发明所述传感探针的检测灵敏度。
[0013]所述生物分子敏感膜为具有特异性识别功能的生物分子，能够和待测物发生特异性结合。可构成敏感膜的生物分子包括酶、抗原、抗体、核酸、病原体等，具体根据待测物的特性而决定。
[0014]其次，本发明的另一目的在于提供上述基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针的制备方法，包括以下步骤:
[0015](I)选择一根普通单模光纤，使用切割刀对普通单模光纤的一端进行切割；
[0016](2)选择一根空芯光子晶体光纤，使用切割刀对其一端进行切割，之后使用熔接机将切割好的空芯光子晶体光纤和上述步骤(I)切割好的普通单模光纤进行熔接。为避免熔接点附近空芯光子晶体光纤空气孔的熔融塌陷，选用手动熔接方式，设置合适的熔接参数，采用较低的熔接强度和较短的放电时间；
[0017](3)使用切割刀切去多余的空芯光子晶体光纤，保留预先设计的长度，一般保留长度为几十微米较为合适，切割操作可在显微镜下进行；
[0018](4)选择另一根普通单模光纤，型号与上述步骤(I)所选普通单模光纤相同，使用切割刀对其一端进行切割，之后与上述步骤(3)切割的光子晶体光纤端面进行熔接，熔接参数与上述步骤(2)所使用的参数相同；
[0019](5)使用切割刀切去多余的上述步骤(4)熔接的普通单模光纤，保留预先设计的长度，一般保留长度为空芯光子晶体光纤长度的十倍左右(几百微米)较为合适;至此光纤珐珀干涉结构器件的制作部分完成；
[0020](6)使用常规光纤表面清洁处理方法对光纤珐珀干涉结构器件的端面进行清洁，之后对光纤珐珀干涉仪端面进行生物相容性材料的涂覆，使其端面形成化学修饰层；
[0021](7)将处理后的光纤珐珀干涉结构器件浸入到一定浓度的生物分子溶液中，使生物分子吸附固定在光纤珐珀干涉结构器件端面的化学修饰层上，形成生物分子敏感膜，固定时间与环境和溶液浓度有关，达到饱和吸附为止，之后取出使用磷酸盐缓冲液进行清洗，去掉多余的未固定的生物分子，即得到基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针。
[0022]优选的，所述步骤(1)-(5)中，切割普通单模光纤和空芯光子晶体光纤的切割刀均为普通光纤切割刀。
[0023]所述步骤(2)、(4)中，熔接机为普通电弧放电熔接机。
[0024]所述步骤(6)中，常规光纤表面清洁方法包括使用酒精和去离子水清洗等。
[0025]所述步骤(6)中，光纤珐珀干涉结构器件端面化学修饰层的生物相容性材料包括水凝胶、聚合电解质、氧化石墨烯等，具体涂覆方法根据所选材料而定。
[0026]所述步骤(7)中，固定在光纤珐珀干涉仪端面的生物分子为具有特异性识别功能的生物分子，包括酶、抗原、抗体、核酸、病原体等，具体根据待测物而定。
[0027]所述步骤(7)中，在生物分子固定完成之后，通常还要使用无关的、不干扰生物反应的小蛋白分子(如小牛血清蛋白)封闭残存的结合位点，有利于稳定固定的生物分子并抑制非特异性吸收。
[0028]进一步的，本发明还提供一种基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感器系统，包括光源、光谱仪、光纤耦合器，以及上述的基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针。
[0029]此外，利用上述基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针或传感系统进行生物物质检测的方法，也是本发明的目的之一。
[0030]本发明所述基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针检测的原理为:在对待测物进行检测时，将探针浸入到待测物溶液中，待测物与探针上的生物分子发生特异性结合，弓丨起生物分子敏感层的有效折射率及厚度变化，光纤珐珀干涉结构器件能够感知外界折射率及厚度的变化，并将其最终转变为干涉谱的变化。
[0031]根据菲涅尔反射原理可知，由于普通单模光纤的纤芯折射率(nSMF)与空芯光子晶体光纤的纤芯折射率(Mcpcf)不同，会在两种光纤的熔接界面处会产生菲涅尔反射，其光强反射率为[(nSMFUHCPCF)/(nSMF+nHCPCF) ]2;同样，由于普通单模光纤的纤芯折射率(nSMF)与外界折射率(IlEX)不同，会在光纤末端端面产生菲涅尔反射，其光强反射率为[(nSMF-ΠΕΧ)/(n SMF+ηΕΧ)]2。普通单模光纤与空芯光子晶体光纤的两个熔接界面，以及普通单模光纤末端端面的反射光发生干涉，形成干涉条纹。其中，末端端面光强反射率和外界折射率有关，当外界折射率发生变化时，其光强反射率发生变化。根据珐珀干涉原理可知，干涉光束光强的变化会引起干涉条纹对比度发生变化，此外，由生物分子敏感层厚度变化引起的干涉光束光程差的变化会改变干涉条纹的相位。因此，通过光纤珐珀干涉传感系统测得干涉条纹的变化，即可对待测物及生物反应过程进行检测。基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针，其干涉谱信号对外界温度变化和光源扰动等因素不敏感，因此信号稳定。此外，待测物与生物分子敏感层可通过解离液进行解离，光纤生物传感探针可重复使用。
[0032]本发明取得了以下有益效果:
[0033](I)本发明提供了一种基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针，采用全光纤探针式结构，具有体积小、结构灵活、抗电磁干扰、耐腐蚀、灵敏度高等优点，所需样本量少，可实现对待测物的原位在线及远距离检测；
[0034](2)生物分子在光纤表面的固定是影响光纤生物传感器性能的关键，直接固定在光纤表面的生物分子活性较低，本发明通过生物相容性材料的化学修饰，并筛选使用合适材料，可以很好地保持生物分子的活性，提高固定密度，从而改善传感器性能；
[0035](3)本发明采用免标记生物检测方式，不需要加入标记物，极大地简化了操作过程，不会污染样本，基本不影响生物分子的活性，安全可靠，可实现对生物反应的动态真实检测；
[0036](4)本发明采用光纤珐珀干涉仪，结构紧凑，机械强度高，重复利用性好，而且对温度和光源扰动等不敏感，稳定性好；
[0037](5)本发明提出的基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针，制作简单，不需要特殊的工艺设备，成本低。
【附图说明】
[0038]图1是一种基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针示意图；
[0039]图2是使用本探针进行检测时，待测物与探针上的生物分子发生特异性结合的示意图。
[0040]图中:I为普通单模光纤，2为空芯光子晶体光纤，3为化学修饰层，4为生物分子敏感层，5为待测物。
【具体实施方式】
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[0041]下面以层层自组装聚合电解质膜(PAH/PSS)2Q作为化学修饰层，固定羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)作为生物分子敏感层，检测兔IgG为例，结合附图对本发明作进一步说明。
[0042]—种基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针，由光纤珐珀干涉结构器件、光纤珐珀干涉结构器件端面的化学修饰层3以及固定在化学修饰层上的生物分子敏感膜4构成。其中，光纤珐珀干涉结构器件由普通单模光纤I和空芯光子晶体光纤2制作而成。
[0043]其中，普通单模光纤I的包层直径为125μπι，纤芯直径为9μπι，纤芯折射率约为1.4682;空芯光子晶体光纤2的型号为!1(:19-1550，其包层直径为1154111，纤芯直径为2(^111，纤芯折射率为I;化学修饰层3为通过静电层层自组装技术涂覆在光纤端面的聚合电解质膜，聚合电解质材料为聚丙烯胺盐酸盐(PAH)和聚苯乙烯磺酸钠(PSS);生物分子敏感膜4为固定在化学修饰层上的羊抗兔IgG。
[0044]—种基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针，其制备方法包括以下步骤:
[0045](I)选择一根普通单模光纤I，使用切割刀对普通单模光纤I的一端进行切割；
[0046](2)选择一根空芯光子晶体光纤2，使用切割刀对其一端进行切割，之后使用熔接机将切割好的空芯光子晶体光纤2和上述步骤(I)切割好的普通单模光纤I进行熔接。为避免熔接点附近空芯光子晶体光纤空气孔的熔融塌陷，选用手动熔接方式，设置合适的熔接参数，采用较低的熔接强度和较短的放电时间；
[0047](3)使用切割刀切去多余的空芯光子晶体光纤2，保留长度约50μπι，切割操作可在显微镜下进行；
[0048](4)选择另一根普通单模光纤I，型号与上述步骤(I)所选普通单模光纤I相同，使用切割刀对其一端进行切割，之后与上述步骤(3)切割的光子晶体光纤2端面进行熔接，熔接参数与上述步骤(2)所使用的参数相同；
[0049](5)使用切割刀切去多余的上述步骤(4)熔接的普通单模光纤I，保留长度600μπι，至此光纤珐珀干涉结构器件的制作部分完成；
[0050](6)使用酒精和去离子水对光纤珐珀干涉结构器件的端面进行清洁；
[0051 ] (7)将清洁好的光纤珐珀干涉结构器件端面浸入Piranha溶液中30分钟，之后用去离子水充分清洗，室温下用氮气吹干；
[0052 ] 其中，P iranha溶液为98 %浓H2 SO4:30% H2O2 = 7:3(体积比)的混合物。
[0053](8)将上述处理好的光纤珐珀干涉结构器件端面交替浸入聚合电解质PAH溶液和PSS溶液中各5分钟，进行层层自组装，每次取出后都要用去离子水清洗，氮气吹干，最终完成(PAH/PSS) 2Q化学修饰层3的涂覆；
[0054](9)将上述处理好的光纤珐珀干涉结构器件端面浸入到0.05mg/ml的羊抗兔IgG溶液中，在37°C下反应I小时，使生物分子吸附固定在光纤珐珀干涉结构器件端面的化学修饰层3上，形成生物分子敏感膜4，之后取出使用磷酸盐缓冲液进行清洗，去掉多余的未固定的生物分子；
[0055](10)将上述处理好的端面浸入2mg/ml的牛血清蛋白(BSA)溶液中，在37°C下反应30分钟，目的是封闭残存的结合位点，稳定固定的生物分子并抑制非特异性吸收。最后用磷酸盐缓冲液进行清洗，即得到基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针。
[0056]上述步骤(1)-(5)中，切割普通单模光纤和空芯光子晶体光纤的切割刀均为普通光纤切割刀。
[0057]上述步骤(2)、(4)中，熔接机为普通电弧放电熔接机。
[0058]上述步骤(7)、(8)中，操作均在室温下进行。
[0059]—种基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针，在对待测物5兔IgG进行检测时，将探针浸入到一定浓度的兔IgG溶液中，室温下充分反应一段时间后，用磷酸盐缓冲液洗去未结合的兔IgG。待测物5兔IgG与探针上的羊抗兔IgG发生特异性结合，引起生物分子敏感层4的有效折射率及厚度变化。通过光纤珐珀干涉传感系统测得干涉谱的变化，即可对待测物5兔IgG及生物反应过程进行检测。待测物5兔IgG与生物分子敏感层4可通过解离液进行解离再生，光纤生物传感探针可重复使用。
[0060]本发明所述传感器的非本征型光纤法布里-珀罗的反射谱，其干涉条纹的对比度较高，达到12dB左右，经检测，传感器对于IgG的检测限可达0.02Uimol/L。通过干扰试验检测，本发明所述传感器与杂蛋白无特异性结合，具有较强的抗干扰能力和良好的温度稳定性。[0061 ]其中，解离液通常为强酸缓冲液、强碱缓冲液或高盐溶液，较为常见的如二乙胺水溶液(0.051，？!1=11.5)，617-!1(:1解离液(0.謂，？!1=2.3)等。
[0062]上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1.一种基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针，其特征在于，由光纤珐珀干涉结构器件、光纤珐珀干涉结构器件端面的化学修饰层以及固定在化学修饰层上的生物分子敏感膜构成，其中，光纤珐珀干涉结构器件由一段光子晶体光纤熔接两段普通单模光纤制作而成。2.根据权利要求1所述的免标记光纤生物传感探针，其特征在于，所述光子晶体光纤为空芯光子晶体光纤。3.根据权利要求1或2所述的免标记光纤生物传感探针，其特征在于，所述化学修饰层为涂覆在光纤珐珀干涉仪端面的生物相容性材料，优选的，选自水凝胶、聚合电解质、氧化石墨稀材料。4.根据权利要求1或2所述的免标记光纤生物传感探针，其特征在于，所述生物分子敏感膜为具有特异性识别功能的生物分子，能够和待测物发生特异性结合，生物分子选自酶、抗原、抗体、核酸、病原体中的一种。5.权利要求1-4任一项所述的免标记光纤生物传感探针的制备方法，包括以下步骤: (1)选择一根普通单模光纤，使用切割刀对普通单模光纤的一端进行切割； (2)选择一根光子晶体光纤，使用切割刀对其一端进行切割，之后使用熔接机将切割好的光子晶体光纤和上述步骤(I)切割好的普通单模光纤进行熔接； (3)使用切割刀切去多余的空芯光子晶体光纤，保留预先设计的长度； (4)选择另一根普通单模光纤，型号与上述步骤(I)所选普通单模光纤相同，使用切割刀对其一端进行切割，之后与上述步骤(3)切割的光子晶体光纤端面进行熔接，熔接参数与上述步骤(2)所使用的参数相同； (5)使用切割刀切去多余的上述步骤(4)熔接的普通单模光纤，保留预先设计的长度，形成光纤珐珀干涉结构器件； (6)使用常规光纤表面清洁处理方法对光纤珐珀干涉结构器件的端面进行清洁，之后对光纤珐珀干涉结构器件端面进行生物相容性材料的涂覆，使其端面形成化学修饰层； (7)将步骤(6)处理后的光纤珐珀干涉结构器件浸入到一定浓度的生物分子溶液中，使生物分子吸附固定在光纤珐珀干涉结构器件端面的化学修饰层上，形成生物分子敏感膜，之后取出使用磷酸盐缓冲液进行清洗，去掉多余的未固定的生物分子，即得到基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针。6.根据权利要求5所述的免标记光纤生物传感探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)-(5)中，切割普通单模光纤和空芯光子晶体光纤的切割刀均为普通光纤切割刀;所述步骤(2)、(4)中，熔接机为普通电弧放电熔接机。7.根据权利要求5所述的免标记光纤生物传感探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，常规光纤表面清洁方法包括使用酒精和去离子水清洗； 所述步骤(6)中，光纤珐珀干涉结构器件端面化学修饰层的生物相容性材料选自水凝胶、聚合电解质、氧化石墨烯中的一种。8.根据权利要求5所述的免标记光纤生物传感探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中，固定在光纤珐珀干涉仪端面的生物分子为具有特异性识别功能的生物分子，选自酶、抗原、抗体、核酸、病原体中的一种； 所述步骤(7)中，在生物分子固定完成之后，使用无关的、不干扰生物反应的小蛋白分子封闭残存的结合位点。9.一种基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感器系统，包括光源、光谱仪、光纤耦合器，以及权利要求1-4任一项所述的基于珐珀干涉的免标记光纤生物传感探针。10.权利要求1-4任一项所述的免标记光纤生物传感探针或权利要求9所述传感系统在生物物质检测中的应用。
【文档编号】G01N21/45GK105891155SQ201610218447
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】姜明顺, 刘晓慧, 张雷, 张法业, 隋青美
【申请人】山东大学