用于组胺快速检测的分子印迹-spr传感方法
【专利摘要】本发明涉及SPR传感器芯片领域，具体涉及组胺分子印迹SPR传感器芯片及其制备方法。所述组胺分子印迹SPR芯片采用旋涂接枝引发剂的方法，在SPR芯片表面原位聚合制备组胺的MIP膜。本发明组胺分子印迹SPR芯片对组胺有高特异性吸附能力，对样品中低浓度组胺有着明显的响应信号变化。采用本发明制备的组胺分子印迹SPR芯片分析组胺残留，步骤简单，分析时间短，对低浓度下分析有较高的特异性和灵敏度。
【专利说明】
用于组胺快速检测的分子印迹-SPR传感方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种SPR传感器检测方法，属于生物传感器领域。具体涉及快速检测 组胺分子印迹SPR传感器芯片及传感方法。
【背景技术】
[0002] 组胺是一种自然产生的物质，在许多蔬菜、水果、啤酒、鱼、奶酪、发酵食品和红葡 萄酒中都能产生组胺（Lehan e&011ey，2000)，这些食品中组胺的浓度相对较低，然而当腐 烂变质后，会大量的产出组胺，组胺的浓度可超过有毒水平的50mg/100g，食用后造成食物 中毒（Lehane et al.，2000)。同样新鲜的鱼中组胺含量很低，但是鱼腐烂变质后，也能 产生大量的组胺（Fernandez_Salguero&Mackie，1987;Frank，Yoshinaga，&Nip，1981)，因 此，组胺也被提出作为鱼类新鲜度的化学指标（L0pez_Sabater，Rodriguez，Roig_Sagu6s， &Mora-Ventura，1994)。美国食品和药物管理局建立的食用鱼类组胺的标准是5mg/100g，组 胺浓度超过该标准被禁止出售（Food and Drug Administration，1996)。因此，组胺的检测 对食品工业和食品安全非常重要。为了给食品加工生产时的危害分析临界控制点（HACCP) 认证提供科学依据，在食品和食品加工行业，快速、准确、可靠的检测组胺显得十分必要。
[0003] 有很多的方法被发展用于检测组胺。检测组胺最常用的技术有：高效液相色 谱法（HPLC) (Yoshitake et al.，2003)、气相色谱（GC) (Keyzer，Wolthers，Muskiet， Breukelman，Kauffman，&Vries，1984)、酶联免疫吸附试验（ELISA) (Ujike et al.，1999) 等，这些方法所用试剂、器皿较多，设备昂贵，操作繁琐、费时、灵敏度低。例如，尽管ELISA 方法提供了高样本量分析，繁琐和费时的操作步骤是其主要的缺点，该方法的另一个缺点 是它需要一个长的孵育时间，由于在酶联板上，免疫反应缓慢导致孵育时间较长。一种 基于在薄的金膜表面产生等离子体共振（SPR)现象的仪器，已用于实时检测无标记的组 胺。SPR已经被证明是一种很有前途方法，可以用于替代一些传统的方法（Homola，2008; Shankaran&Miura，2007)。SPR已经成为生命科学和药物研究实验室的一个标准工具 (Cheng，Huang，&Duan，2003)。此外，可以使用SPR传感器测量化学物质之间的结合特异性 和动力学以及对化学物质的定量测定（Myszka，1997)。如果SPR传感器的芯片被靶分子特 异性受体修饰，SPR传感器也可以被作为高选择性和灵敏性的生物传感器。例如，Yan Li 等人应用基于间接竞争免疫反应的SPR生物传感器检测组胺（Li，Kobayashi，Furui，Soh， Nakano, &Imato, 2006)，但该传感器利用生物识别元件，如抗体或酶，然而该传感系统限制 了它的应用（Kandimalla&Ju，2004 ;Yano&Karube，1999)。首先，生物识别元件价格昂贵、制 备困难，由于贮藏等原因可能导致对目标分子不一定有效。此外，生物识别元件对溶剂、温 度和酸碱度要求高，会随溶剂、温度和PH值的变化变得不稳定，而人工合成的识别元件则 具有很好的稳定性（〇wens，Karlsson，Lutz，&Andersson，1999)。我国现行的标准检验组胺 的方法是GB/T5009. 45-2003和国标《水质组胺等五种生物胺的测定高效液相色谱法》（GB/ T21970-2008)，目前还没有应用SPR传感器检测食品中组胺的标准，在国内外的文献检索 中，应用SPR传感器检测食品中组胺的方法也很少，SPR传感器有操作简便、灵敏度高、快速 等优点，因此建立食品中组胺的SPR传感器检测方法十分必要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种组胺分子印迹SPR传感器检测方法。
[0005] 本发明的技术方案概述如下：一种组胺分子印迹SPR传感器芯片是由组胺 (Histamine):单体（MAA):交联剂（EGDMA)以1 : 2 : 4比例采用旋涂接枝引发剂的方法， 在SPR芯片表面原位聚合制备组胺的MIP膜。分别用MIP膜、NIP膜修饰的SPR芯片作为 组胺的识别元件，配制不同浓度（25、50、100、250、500、1000ng/mL)的组胺PBS溶液，用SPR 传感器进行检测，记录所得数据，每个水平测量3次，得到不同浓度组胺产生的SPR响应信 号，绘制出响应曲线，建立标准曲线，然后评价各个膜对组胺的吸附性能。用该传感器对组 胺的检测范围是：25ng/mL~1000ng/mL，检测限值是：25ng/mL。
[0006] 本发明的优点：首先，MIPs的合成成本很低，远远低于抗体的制备；第二，MIPs具 有较好的稳定性，能够在极端的温度和pH值环境中应用；第三，MIPs是通过非共价键的方 法制备，具有很好的再生性。该传感器不仅对组胺分子具有较强的特异性识别和结合能力， 而且也具有良好的重复性和长期稳定性，它能够多次重复对组胺进行检测。
【附图说明】
[0007] 图1基于MIP膜的SPR传感器检测组胺的实验流程图
[0008] 图2组胺及其结构类似物
[0009] 图3扫描电子显微镜（SEM)对SPR芯片上修饰的NIP膜㈧和MIP膜⑶的表征 图
[0010] 图4不同质子化的组胺结构示意图
[0011] 图5pH值对基于MIP膜的SPR传感器检测组胺的影响（注：组胺的浓度为IOOng/ mL)
[0012] 图6MIP-SPR传感器检测不同浓度组胺的吸附响应曲线
[0013] 图7MIP-SPR传感器检测不同浓度组胺的响应曲线及标准曲线（η = 3)
[0014] 图8MIP-SPR传感器连续检测500ng/mL组胺的吸附响应曲线
[0015] 图9MIP膜与NIP膜对组胺检测的选择性比较（η = 3)
[0016] 图10组胺与结构类似物的SPR角变化的比较
【具体实施方式】
[0017] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂与材料，如无特殊说明，均可 从常规试剂公司购买得到。
[0018] 实施例1
[0019] MIP膜的制备
[0020] 将SPR芯片清洗干净后，放入5mL新配制的Piranha溶液中浸泡lh，再用双蒸水、 无水乙醇仔细冲洗，氮气吹干后备用。
[0021] 采用旋涂接枝引发剂的方法，在SPR芯片表面原位聚合制备组胺的MIP膜，制作过 程如附图1所示。
[0022] (1)预聚合液的配制：取5. OmL的DMSO于称量瓶中（40X 25mm)，加入模板分子组 胺（0. 2mmol)、单体 MAA (0. 4mmo1)、交联剂 EGDMA (0. Hmmol)，超声除氧 IOmin 后，再用 1^2除 氧 IOmin0
[0023] (2)将30mg引发剂（AIBN)和3mg粘附剂（PVC)溶解于3mL四氢呋喃（THF)溶 液中。取出IOOyL缓慢地滴加在SPR芯片表面中心位置，然后在SC-IB型匀胶台上旋涂 均匀，旋涂转速为58. 83 X 21. 60rpm，旋涂时间60s。MIP膜合成时各组成的比例为组胺 (Histamine):单体（MAA):交联剂（EG DMA)合成MIP膜的比例是1 : 2 : 4。
[0024] (3)将旋涂了旋涂液的SPR芯片迅速浸入预聚合液中，继续通N2除氧lOmin，紧密 封闭称量瓶，置于电热恒温鼓风干燥箱中，60°C反应16h。聚合反应完毕后，将SPR芯片浸泡 在甲醇：冰乙酸=9 : l(v/v)的混合溶液中，洗脱模板分子，每次40min，洗脱4次，然后再 用甲醇溶液洗脱2次，最后用无水乙醇、CldH 2O冲洗干净后队吹干备用。不加入组胺，按同 样方法制备对应的NIP膜。
[0025] SPR芯片表面聚合物膜的表面形貌通过Quanta 200FEG场发射环境扫描电子显微 镜（SEM)进行表征如附图3所示。
[0026] 实施例2
[0027] SPR 检测
[0028] 表面等离子体共振发生的特定条件是将薄的金属（金或银）膜放入激光束内， 当入射光为单色光和P -偏振光并以一定的角度射入金属膜表面时，金属表面的自由电子 将发生振荡并产生共振吸收能量，这种引起表面等离子体共振发生的入射光角度称为SPR 角，通过测量反射光的强度来检测表面等离子体共振发生的效果，当入射光以SPR角射入 时，反射光的强度会迅速的下降达到最低，SPR角的大小取决于传感芯片表面的折射率。该 表面等离子体共振传感器，基于Kretschmann结构，可以实时对结合事件进行测定，测定 过程中无需标记。偏振光是由3mW的激光二极管发射产生的，波长为670nm，检测范围为 4000毫度（mo)，在SPR芯片上有两个同体积的流通池 （channel 1和channel 2)，两个流 通池各自独立，可以加入不同的样品，当偏振光射入涂有金膜的SPR芯片上后，反射光的强 度会发生变化，通过测量反射光最弱时的SPR角来实现对样品的检测，实验所有的取样都 是通过自动取样器来完成的，分为4个阶段：基线（baseline)，结合（association)，解离 (dissocication)，再生（regeneration)。通过对浓度为 25ng/mL-1000ng/mL 的组胺溶液 进行检测，我们绘制出了对组胺检测的剂量反应曲线及标准曲线，将浓度进行对数变换后， 绘制出了标准曲线，公式为：y = 29. 001gx-31.90, R2= 0. 997,组胺的检测范围为：25ng/ mL-1000ng/mL，检测限值（LOD) :25ng/mL。如附图 7。
[0029] pH值对MIP膜识别组胺的影响，该图展示了在宽的pH值范围内（pH 1-14)组胺 和MIP膜之间的氢键形成的可能性，在pH值位于7-9时MIP膜对组胺的吸附效果最好，如 附图5, pH为8时响应最强。
[0030] 我们通过检测不同浓度的组胺来验证MIP-SPR传感器的性能。测量时，在MIP-SPR 传感器流通通路中是充满了 PBS，基线稳定后，对不同浓度组胺已分别进行检测。MIP-SPR 传感器检测不同浓度组胺的吸附响应曲线如附图6所示，由图可见SPR响应曲线随着组胺 浓度的增加呈梯度变化。
[0031] MIP膜检测完组胺后是通过0.1 M HCl再生液完成再生的，从而达到去除目标分子 获得重新检测的目的。0.1 M HCl很适合作为该传感器的再生液，它能够很好的解离组胺与 MIP膜结合的氢键从而达到再生的目的。当加入组胺溶液后，经过MIP膜对组胺的吸附和去 除非特异性吸附后，SPR响应信号达到稳定状态，此时加入再生液后，SPR信号会迅速的下 降，再经过PBS反复冲洗最终回到基线。应用MIP-SPR传感器连续检测500ng/mL组胺，反 应结果如附图8, MIP膜检测组胺具有良好的稳定性和再生性。
[0032] 分别用MIP膜、NIP膜修饰的SPR芯片作为识别元件，检测不同浓度的组胺溶液， 每个浓度测量3次，比较结果如附图9所示，由图可以看出，MIP膜对组胺的选择性明显好 于NIP膜，MIP-SPR传感器的对组胺的敏感性约为NIP-SPR传感器的5倍，可以说明制作的 MIP膜对组胺吸附作用好。
[0033] 将制备的浓度为10 μ g/mL的5-羟色胺、1-咪唑乙酸、5-羟基吲哚乙酸、组胺酸溶 液，用MIP膜、MIP膜修饰的SPR传感器分别进行检测，每个水平检测3次，检测结果绘图如 附图10,组胺结构类似物的浓度是组胺溶液的10倍，检测结果显示：制备的MIP膜对组胺 的选择性好，对检测组胺具有良好的特异性。
[0034] 为了研究该MIP-SPR传感器的实用性，我们以鱼作为实际样品进行加标回收实 验，获得了良好的回收率，回收率位于89. 33% -105. 33 %之间，相对标准偏差（RSD)位于 3. 84% -4. 81%之间。
[0035] 表2-2以鱼作为实际样品进行加标回收实验（η = 3)
【主权项】
1. 一种使用旋涂接枝引发剂在SPR芯片表面制备组胺MIP膜的方法，其特征在于其处 理过程由如下步骤组成： (1) 预聚合液的配制：取5. OmL的DMSO于称量瓶中（40X25mm)，加入模板分子组胺 (0· 2mmol)、单体 MAA (0· 4mmo1)、交联剂 EGDMA (0· Hmmol)，超声除氧 IOmin 后，再用 N2除氧 IOmin0 (2) 将30mg引发剂（AIBN)和3mg粘附剂（PVC)溶解于3mL四氢呋喃（THF)溶液中。 取出100 μ L缓慢地滴加在SPR芯片表面中心位置，然后在SC-IB型匀胶台上旋涂均匀，旋 涂转速为58. 83X21. 60rpm，旋涂时间60s。 (3) 将旋涂了旋涂液的SPR芯片迅速浸入预聚合液中，继续通N2除氧lOmin，紧密封闭 称量瓶，置于电热恒温鼓风干燥箱中，60°C反应16h。聚合反应完毕后，将SPR芯片浸泡在甲 醇：冰乙酸=9 : l(v/v)的混合溶液中，洗脱模板分子，每次40min，洗脱4次，然后再用甲 醇溶液洗脱2次，最后用无水乙醇、CldH 2O冲洗干净后队吹干备用。不加入组胺，按同样方 法制备对应的NIP膜。2. -种制备组胺MIP膜的方法，其特征是MIP膜合成时各组成的比例为组胺 (Histamine):单体（MAA):交联剂（EGDMA)合成MIP膜的比例是1 : 2 : 4。3. -种组胺快速检测的分子印迹-SPR传感方法，其特征是通过对浓度为25ng/mL~ 1000ng/mL的组胺溶液进行检测，绘制出标准曲线，公式为：y = 29. 001gx-31. 90, R2 = 0.997，组胺的检测范围为：25即/1^~10001^/1^，检测限值（11)0):251^/111匕4. 一种组胺快速检测的分子印迹-SPR传感方法，其特征在于检测组胺溶液的最佳pH 值为8。
【文档编号】G01N21/55GK105891159SQ201510016205
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月12日
【发明人】高志贤, 宁保安, 孙思明, 彭媛, 白家磊, 姜随意
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所