一种分离外周血中稀有细胞的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种分离外周血中稀有细胞的方法以及使用该方法的试剂盒。本发明的方法结合了阴性富集和密度梯度离心的策略，回收率高，简单、方便且对外周血中稀有细胞损伤较少。通过本发明的试剂盒，使用上述分离方法，可以用于乳腺癌等多种肿瘤的外周血循环肿瘤细胞的分离，也可以用于肿瘤病人的早期诊断、复发监控和药物疗效评价等用途，还可以用于胸水、腹水等体液中稀有细胞的分离，具有非常广阔的应用前景。
【专利说明】
一种分离外周血中稀有细胞的方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体地涉及外周血中稀有细胞的分离方法，还涉及使 用该方法的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 由于环境污染及人们保持多种不良生活习惯如吸烟和饮食不健康的食品等因素， 全球癌症患者数量正以惊人的速度增加。2012年，全球新增癌症病例估计约达1400万例， 世界卫生组织下属的国际癌症研究机构近日发表《2014年世界癌症报告》指出，预计20年 内这个数字将上升到2200万。"早预防，早发现，早治疗"是目前防治癌症的最好方法。目 前用于肿瘤诊断的方法可归为三大类：病理学（活检切片），影像学（超声，X光，CT，PET 等）和血清学（血清肿瘤相关蛋白，如CA-125，CA-199，CEA等），但这些方法都有不可避免 的缺点，如灵敏性及特异性差，过于依赖医生的主观判断等。
[0003] 循环肿瘤细胞（CiFCulating Tumor Cells, CTCs)是指自发或因诊疗操作进入外 周血循环的肿瘤细胞，为外周血中的稀有细胞。大量研究证实，外周血CTCs检测目前被认 为最好及最客观的检测手段之一。CTCs的分离方法很多，主要包括抗原依赖型和非抗原依 赖型。抗原依赖型主要是通过免疫磁珠富集分离系统，根据富集方法的不同有负选择富集 方法（通过采用标记有抗CD45抗体的磁珠去除白细胞）和正选择富集方法（通过标记有 抗角蛋白或其他上皮细胞标志物如EpCAM等抗体的磁珠来钓取肿瘤细胞）。非抗原依赖型 的方法主要有密度梯度离心，过滤等方法。从分离的敏感性和对细胞的损坏程度来看，抗原 依赖型是目前CTC分离的主要采用的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一种分离外周血中稀有细胞的方法，包括如下步骤：采集血样，去除 白细胞，分离细胞，转移到细胞载玻片固定，通透，加兔抗cytokeratin (Pan)多抗，加突光 素标记的山羊抗兔IgG，加含DAPI的封片剂，荧光显微镜下观察计数。其中去除白细胞可以 使用 Dynabeads CD45,细胞分离液可为 Ficoll-Paque Plus，用 Triton X-100/PBS 通透，突 光素可以使用Alexa Fluor 594。
[0005] 具体步骤可以为首先采集人外周血，加入PBS、Dynabeads CD45混匀，然后转移到 细胞分离液的液面上面，离心。将上层液体转移并离心，吸弃上清。用剩余液体重悬管底细 胞并转移到细胞载玻片上，自然干燥。干燥后的细胞玻片依次用甲醛/PBS固定，用Triton X-100/PBS通透，用5%BSA/PBS洗涤。然后加入兔抗cytokeratin(Pan)多抗，4°C孵育，然 后用PBS洗涤。随后，加入Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG，避光孵育。用PBS洗涤 后，加含DAPI的封片剂，盖上盖玻片，放置在荧光显微镜下观察计数。阳性的循环肿瘤细胞 的判定标准：细胞尺寸大于4微米，细胞完整，呈圆形或椭圆形，细胞核被DAPI染色阳性， cytokeratin染色阳性。
[0006] 实验结果显示，通过对健康人和乳腺癌患者进行评价，其中健康人中乳腺癌循环 肿瘤细胞阳性率为0,乳腺癌I-II期，III期和IV期患者中循环肿瘤细胞阳性率分别为 28. 5%，75%和 80%。
[0007] 本发明的方法结合了阴性富集和密度梯度离心的策略，回收率高，简单、方便且对 外周血中稀有细胞损伤较少。利用该分离方法，也可以用于其它类型肿瘤的外周血循环肿 瘤细胞的分离如肺癌，大肠癌，胰腺癌，肝癌等。利用该方法富集的循环肿瘤细胞，不仅可以 用于肿瘤病人的早期诊断、复发监控和药物疗效评价等用途，而且可以将上述细胞体外培 养增殖用于抗肿瘤药物敏感性的筛选。此外，该方法助于丰富TNM分期的内涵，并为肿瘤患 者的个体化诊疗提供科学依据。不限于此，上述分离程序还可以用于胸水、腹水等体液中稀 有细胞的分离，具有非常广阔的应用前景。
[0008] 本发明还公开了一种试剂盒，该试剂盒包括白细胞去除剂，兔抗 cytokeratin(Pan)多克隆抗体，突光素标记的山羊抗兔IgG,细胞分离液，含DAPI的封片 剂，以及离心管，血液采集管（枸橼酸钠抗凝）等采血及其他实验材料，以及荧光显微镜等 实验仪器。其中白细胞去除剂可以为Dynabeads CD45,荧光素可以为Alexa Fluor 594,细 胞分离液可为Ficoll-Paque Plus。本发明的试剂盒采用以下方法分离外周血中稀有细胞， 采集血样，去除白细胞，分离细胞，转移到细胞载玻片固定，通透，加兔抗cytokeratin (Pan) 多抗，加荧光素标记的山羊抗兔IgG，加含DAPI的封片剂，荧光显微镜下观察计数。其中 去除白细胞可以使用Dynabeads 0)45,用Triton X-100/PBS通透，突光素可以使用Alexa Fluor 594。更具体步骤可以为首先采集人外周血，加入PBS、Dynabeads CD45混匀，然后 转移到细胞分离液的液面上面，离心。将上层液体转移并离心，吸弃上清。用剩余液体重悬 管底细胞并转移到细胞载玻片上，自然干燥。干燥后的细胞玻片依次用甲醛/PBS固定，用 Triton X-100/PBS 通透，用 5% BSA/PBS 洗涤。然后加入兔抗 cytokeratin (Pan)多抗，4°C 孵育，然后用PBS洗涤。随后，加入Alexa FluoT 594标记的山羊抗兔IgG，避光孵育。用 PBS洗涤后，加含DAPI的封片剂，盖上盖玻片，放置在荧光显微镜下观察计数。阳性的循环 肿瘤细胞的判定标准：细胞尺寸大于4微米，细胞完整，呈圆形或椭圆形，细胞核被DAPI染 色阳性，cytokeratin染色阳性。
[0009] 使用本发明的试剂盒和本发明的分离方法，可以分离人外周血中循环肿瘤细胞， 其中肿瘤可以为乳腺癌、肺癌、大肠癌、胰腺癌或肝癌等实体瘤。使用本发明的方法及试剂 盒具有操作简单、对靶标细胞损伤无影响且重复性高的特点，在富集稀有细胞特别是循环 肿瘤细胞方面具有较高的回收率平均达到75. 99%以上，高于既往的循环肿瘤细胞富集方 法。此外，本发明的方法及试剂盒也可以分离胸水、腹水等体液中的稀有细胞，具有良好的 应用情景。
【附图说明】
[0010] 图1.掺入实验证明外周血稀有细胞分离方法的回收率
[0011] 图2.健康志愿者和不同分期乳腺癌患者循环肿瘤细胞数目
【具体实施方式】
[0012] 实施例1外周血中稀有细胞的分离
[0013] 一、实验材料
[0014] L细胞：乳腺癌细胞系，SK-BR-3, MCF-7, ZR 75-1，MDA-MB-453 ;人原髓细胞白血 病细胞HL-60,人Burkitt' s淋巴瘤细胞Raji，人外周血白血病T细胞Jurkat，购自北京协 和细胞资源中心。
[0015] 2.试剂和仪器：Dynabeads CD45, RPMI-1640,胎牛血清，Mitotracker? Red CMXRos，Hoechst 33342,膜酶，HulaMixer? 样品混匀仪购自 Life Technologies 公司。细 胞分离液Ficoll-Paque Plus购自GE Healthcare。AQ)抗凝血液收集管，15ml和50ml离 心管购自BD公司。磁力架购自Promega公司。细胞培养瓶，培养皿及6孔板购自Corning 公司。
[0016] 二、实验方法
[0017] 1.肿瘤细胞标记
[0018] 分别将乳腺癌细胞SK-BR-3, MCF-7, ZR 75-1，MDA-MB-453接种到6孔板中，培养至 亚融合状态。晃动培养板使得所有状态不好的细胞松动。用PBS漂洗两遍去除所有漂浮的 死细胞。用含有 MitoTracker (1 : 2000 稀释，0.5 μ M)和 Hoechst 33342(1 : 2000 稀释） 的细胞培养液2ml于37°C标记细胞30min。用PBS洗两遍后，加入0. 5ml预热的胰酶溶液， 37°C孵育5-10皿。用移液器重悬细胞至5ml细胞培养液中，并用细胞计数仪计数，保存在 37 °C孵箱中备用。
[0019] 2.模拟肿瘤病人外周血
[0020] 采集Iml健康志愿者的外周血于A⑶抗凝的血液收集管中，备用。将MitoTracker 和Hoechst 33342标记的肿瘤细胞计数后，将一定数量的肿瘤细胞掺入到上述外周血中模 拟肿瘤病人的外周血样品中的循环肿瘤细胞。
[0021] 3.循环肿瘤细胞分离程序
[0022] 将上述外周血转移到50ml细胞离心管中，加入9ml PBS并混匀。取0.125ml Dynabeads⑶45，加入到上述离心管中，用HulaMixer样品混匀仪室温上下颠倒混匀 30min。取50ml新离心管，加入5ml细胞分离液Ficoll-Paque Plus于管底，小心将上述血 样全部转移到分离液液面上面，350g离心5min。将上层液体全部转移到15ml离心管中， 650g离心5min，吸弃上清至100 μ 1。用剩余液体重悬管底细胞并转移到细胞载玻片上，于 荧光显微镜下观察计数。
[0023] 4.结果判断
[0024] 在突光显微镜下观察每个视野，并计数Mi toTracker和Hoechst 33342双阳性， 且有完整细胞形态的细胞。将富集后的细胞数除以原始掺入的细胞数得到细胞回收率。
[0025] 三、实验结果
[0026] 如图1所示，分别选用不等数量的不同乳腺癌细胞掺入到健康人外周血中，经过 循环肿瘤细胞分离富集程序后，评价回收率达75. 99% (55. 6%~93. 8% )
[0027] 四、实验结论
[0028] 从上面的实验结果可以看出，我们建立的外周血稀有细胞分离方法对乳腺癌细胞 的富集分离具有较高的回收率。
[0029] 实施例2乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的分离
[0030] 一、实验材料
[0031] Dynabeads CD45,兔抗 cytokerat in (Pan)多克隆抗体，Alexa Fluor 594 标 记的山羊抗兔IgG购自Life Technologi es。50ml和15ml离心管购自Corning公司。 Ficoll-Paque Plus购自GE Healthcare公司。BD Vacutaiher血液米集管（枸橡酸钠抗 凝）购自Becton-Dickinson公司。含DAPI的封片剂购自Victor Labs公司。
[0032] 二、实验方法
[0033] 用真空采血器采集健康志愿者或乳腺癌患者的外周血，弃去前2ml血液后收集 Iml血液至A⑶抗凝的采血管中。将上述外周血转移到50ml细胞离心管中，加入9ml PBS 并混匀。取0.125ml Dynabeads 0)45,加入到上述离心管中，用HulaMixer样品混匀仪室 温上下颠倒混匀30min。取50ml新离心管，加入5ml细胞分离液Ficoll-Paque Plus于管 底，小心将上述血样全部转移到分离液液面上面，350g离心5min。将上层液体全部转移到 15ml离心管中，650g离心5min，吸弃上清至100 μ 1。用剩余液体重悬管底细胞并转移到细 胞载玻片上，自然干燥备用。
[0034] 干燥后的细胞玻片用2%甲醛/PBS固定20min，然后用0. 1% Triton X-100/PBS 通透IOmin,然后用5% BSA/PBS洗3次，3min/次。然后加入兔抗cytokeratin(Pan)多抗 (1 : 200稀释到3%BSA/PBS中），4°C孵育lh，然后用PBS洗3次，3min/次。随后，加入 Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG(l : 1000稀释到3%BSA/PBS中），4°C避光孵育lh。 用PBS洗3次，3min/次后，加入1-2滴含DAPI的封片剂，盖上盖玻片，放置在荧光显微镜下 观察计数或4°C避光保存。
[0035] 阳性的循环肿瘤细胞的判定标准：细胞尺寸大于4微米，细胞完整，呈圆形或椭圆 形，细胞核被DAPI染色阳性，cytokeratin染色阳性。
[0036] 三、实验结果
[0037] 收集了 15个健康人和16个乳腺癌患者进行评价，其中健康人中乳腺癌循环肿瘤 细胞阳性率为〇,若以CTC数目大于2为阳性，则I-II期，III期和IV期乳腺癌患中循环肿 瘤细胞阳性率分别为28. 5%，75%和80%。结果见表1，表2和图2所示。
[0038] 表1.健康人循环肿瘤细胞检测情况
L0043」 四、买验结论
[0044] 根据我们建立的循环肿瘤细胞分离方法，用免疫细胞化学染色能检出乳腺癌患者 中的循环肿瘤细胞。并且，检出的循环肿瘤细胞数目与患者的临床分期有一定的相关性， 随着??Μ分期的增加，CTC检出数目和阳性检出率也在增加。上述结果提示，我们建立的循 环肿瘤分离鉴定方法有助于丰富?m分期的内涵，并为肿瘤患者的个体化诊疗提供科学依 据。
【主权项】
1. 一种分离外周血中稀有细胞的方法，采用阴性富集和密度梯度离心相结合策略， 包括如下步骤：采集血样，去除白细胞，分离细胞，转移到细胞载玻片固定，通透，加兔抗 cytokeratin(Pan)多抗，加突光素标记的山羊抗兔IgG,加含DAPI的封片剂，突光显微镜下 观察计数。2. 根据权利要求1所述方法，其中稀有细胞为肿瘤细胞。3. 根据权利要求1或2所述方法，其中肿瘤为乳腺癌、肺癌、大肠癌、胰腺癌或肝癌。4. 根据权利要求1-3任一所述方法，其中去除白细胞试剂为Dynabeads CD45,分离细 胞试剂为 Ficoll-Paque Plus，突光素为 Alexa Fluor 594。5. -种分离人外周血中稀有细胞的试剂盒，包括白细胞去除、细胞分离试剂，及兔抗 cytokeratin(Pan)多克隆抗体，突光素标记的山羊抗兔IgG,含DAPI的封片剂，以及血样采 集材料，荧光显微镜。6. 根据权利要求5所述试剂盒，其中白细胞去除试剂为Dynabeads CD45,细胞分离试 剂为 Ficoll-Paque Plus，突光素为 Alexa Fluor 594。7. 根据权利要求5或6所述试剂盒，其中人外周血稀有细胞为肿瘤细胞。8. 根据权利要求7所述试剂盒，其中肿瘤为乳腺癌、肺癌、大肠癌、胰腺癌或肝癌。9. 权利要求5-8任一所述试剂盒，通过以下步骤分离人外周血中稀有细胞：采集血样， 去除白细胞，分离细胞，转移到细胞载玻片固定，通透，加兔抗cytokeratin (Pan)多抗，加 荧光素标记的山羊抗兔IgG，加含DAPI的封片剂，荧光显微镜下观察计数。
【文档编号】G01N33/48GK105891165SQ201410608736
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月4日
【发明人】郝淮杰
【申请人】郝淮杰