基于微球的杯式时间分辨荧光d-二聚体分析方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于微球的杯式时间分辨荧光D?二聚体分析方法及试剂盒；包括在检测反应杯内表面包被D?二聚体单抗或多抗；将时间分辨荧光微球与D?二聚体单抗或多抗共价键交联制备得到荧光标记抗体；将待测D?二聚体样品加入包被后的检测反应杯内，再加入所述荧光标记抗体，25℃～40℃温育；清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，在340～380nm激发光激发下，测试检测反应杯中荧光信号；将所述荧光信号与标准曲线比对，获得所述待测D?二聚体样品的D?二聚体浓度。本发明可以在较短的检测时间内完成检测，缩短了检测时间，并有效的提高了检测灵敏度。
【专利说明】
基于微球的杯式时间分辨焚光D-二聚体分析方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及D-二聚体检测技术领域，具体涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光 D-二聚体分析方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] D-二聚体(D-dimer，D-D)是交联纤维蛋白（Fb)的特异降解产物。纤维蛋白溶解系 统(fibrinolysis system)是人体最重要的抗凝系统，当纤维蛋白凝结块(fibrin clot)形 成时，在纤溶酶原激活剂的存在下，纤溶酶原激活转化为纤溶酶，纤维蛋白溶解过程开始， 纤溶酶降解纤维蛋白凝结块形成各种可溶片段，形成纤维蛋白产物(FDP)，Π )Ρ由下列物质： X-寡聚体(X_〇ligomer)、D-二聚体(D-Dimer)、中间片段（Intermediate fragments)、片段E (Fragment E)组成。纤溶蛋白降解产物中，唯D-二聚体交联碎片可反映血栓形成后的溶栓 活性。因此，理论上，D-二聚体的定量检测可定量反映药物的溶栓效果、及可用于诊断、筛选 新形成的血栓。
[0003] 近十多年来，国内外的研究证实D-二聚体检测已成为临床诊断血栓性疾病的重要 指标，主要用于筛查深静脉血栓(DVT)，肺栓塞(PE)，弥漫性血管内凝血(DIC)。另外，只要机 体血管内有活化的血栓形成及纤维溶解活动，D-二聚体就会升高，因此，心肌梗死、脑梗死、 手术、肿瘤、感染及组织坏死、肾脏疾病、器官移植排斥反应等均可导致D-二聚体升高。特别 对老年人及住院患者，因患菌血症等病易引起凝血异常而导致D-二聚体升高。D-二聚体检 测不仅对多种疾病的辅助诊断具有重要的临床意义，也具备巨大的市场前景。
[0004] 传统上D-dimer多用免疫比浊法，化学发光法及胶体金免疫层析法或者荧光免疫 层析法等方法测定。乳胶比浊法一般采用多克隆抗体包被乳胶微球，灵敏度和特异性都不 理想，如果采用单克隆抗体包被乳胶微球，则试剂成本很高。化学发光法对技术要求高，操 作步骤相对比较繁琐，需要多步试剂添加过程。胶体金免疫层析法虽然具有标本用量少，简 便快速，便宜的优势，然而当遇到某些样品中抗原或抗体含量极低时，胶体金的颜色将很浅 甚至无显色，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度较低。荧光免疫层析法虽然灵 敏度比胶体金免疫层析法要高，但是其检测精密度并不理想，灵敏度与大型化学发光或者 电化学发光仪器仍有差距。
[0005] 时间分辨焚光(Time-resolved Fluorescence，TRF)是一种非同位素焚光标记物， 与普通荧光相比，具有Stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧 光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。
[0006]目前市面上采用时间分辨荧光检测的试剂均采用解离增强镧系元素荧光免疫分 析(DELFIA)，它采用具有双功能基团结构的螯合物，使其一段与铕(Eu)连接，另一端与抗 体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应后形成免疫复合 物，由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，需要加入一种解离增强剂，使得铕离子从复 合物上解离下来，并与增强剂中的另一种螯合剂形成胶态分子团，这种分子团在紫外光的 激发下能发出很强的荧光。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服上述现有荧光免疫层析法测定D-二聚体检测精密度不理 想以及时间分辨荧光检测法需要解离增强过程，检测步骤繁杂、时间长、精度差等不足，提 供一种基于微球的杯式时间分辨焚光D-二聚体分析方法及试剂盒。该方法基于时间分辨焚 光微球可高灵敏度定量检测D-dimer(D-二聚体）。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009] 第一方面，本发明涉及一种基于微球的杯式时间分辨焚光D-二聚体分析方法，所 述方法包括如下步骤：
[0010] Sl、在检测反应杯内表面包被针对D-二聚体特定抗原识别位点的一个或多个抗体 (所述抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体，或者多个抗体的组合形式；即，包被D-二聚体单 抗或者多抗）；
[0011] S2、将时间分辨荧光微球与D-二聚体单抗或者多抗通过共价键交联制备得到荧光 标记抗体；
[0012] S3、将待测D-二聚体样品加入步骤Sl包被后的检测反应杯内，再加入所述荧光标 记抗体，25°C~40°C温育；
[0013] S4、清洗去除未结合的抗原及焚光标记抗体，在340~380nm激发光激发下，测试检 测反应杯中荧光信号；
[0014] S5、将所述荧光信号与标准曲线比对，获得所述待测D-二聚体样品的D-二聚体浓 度。
[0015] 优选的，所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素螯合物。
[0016] 优选的，所述镧系元素螯合物为Eu(TTA)3/T0P0或Eu(TTA)3/Phen(其中TTA为噻吩 甲酰三氟丙酮(Thenoy Itrif luoroacetone)，TOPO为三辛基氧化膦，Phen为邻菲略啉）。 [0017]优选的，所述时间分辨荧光微球的粒径范围为100~lOOOnm。
[0018] 优选的，所述时间分辨焚光微球为前处理后的羧基时间分辨焚光微球;所述前处 理包括:加入MES、EDC进行初次活化处理，加入氨基己酸室温混匀15~60min，加入MES、NHS 和EDC进行再次活化处理;每Img羧基时间分辨荧光微球对应10~IOOul 50mM氨基己酸。
[0019] 更优选的，所述初次活化处理包括：每Img羧基时间分辨荧光微球，加60ul500mM MES( 2-(N-吗啡啉）乙磺酸）缓冲液pH5.0~7.0，加0.02~0.2mgl-(3-二甲氨基丙基）-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，，加纯化水至终体积600yL，室温混匀15~60min;所述再次活化处 理包括:加入所述氨基己酸室温混勾后，加 ImLlOOmM MES pH6.0，15000rpm离心清洗10~ 25min，弃去上清;加400ul IOOmM MES pH5.0~7.0,超声分离，加0.02~0.2mg N-羟基琥珀 酰亚胺(NHS)，加0.01 ~O.lmgEDC，室温混匀 10~20min;加 ImL IOOmM MES pH5.0~7.0缓冲 液，25000rpm离心清洗10~25min，弃去上清；IOOmM MES pH6.0缓冲液恢复到Iml。
[0020] 优选的，步骤S2中，还包括将共价键交联制备得到的荧光标记抗体进行封闭、清洗 后用反应缓冲液稀释到终浓度到30μg/ml，作为检测用荧光标记抗体的步骤;所述每IL反应 缓冲液中含有50~200禮？8，1~5%85厶，0.9~3%恥(：1，1~3%葡聚糖，0.02~2.0%七￥6611 20，ρΗ6·0~9.0。更优选含有50mM ?8，1%85六，0.9%他(：1，2%葡聚糖，0.5%七￥661120， ρΗ7·2〇
[0021] 优选的，所述清洗采用的清洗液每IL含5~10OmM PB，0.9~3 % NaCI，0.02~1.0 % Tween 20，pH6~9。更优选含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，ρΗ7·8。
[0022] 优选的，所述标准曲线为系列浓度的D-二聚体校准品的D-二聚体浓度与对应的荧 光信号的关系曲线;该荧光信号为采用所述基于微球的杯式时间分辨荧光D-二聚体分析方 法测得的荧光信号。
[0023] 第二方面，本发明涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光D-二聚体分析试剂盒， 所述试剂盒包括检测反应杯、荧光标记抗体和清洗液；
[0024] 所述检测反应杯内表面包被D-二聚体单抗或者多抗；
[0025] 所述荧光标记抗体是由时间分辨荧光微球与D-二聚体单抗或者多抗通过共价键 交联制备而得；
[0026] 所述清洗液每IL含5~IOOmM ΡΒ，0·9~3%NaCl，0.02~1.0%Tween 20，ρΗ6~9〇
[0027] 更优选含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，ρΗ7·2。
[0028] 该试剂盒的检测基础是双抗体夹心的免疫反应。
[0029]所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素化合物;较优的，该镧系元素螯合物为 铕螯合物;最优的，该铕螯合物可为Eu(TTA)3/T0P0或Eu(TTA)3/Phen。
[0030] 优选的，所述时间分辨荧光微球粒径范围为100~lOOOnm。
[0031 ]第三方面，本发明涉及一种基于微球的杯式时间分辨焚光D-二聚体分析试剂盒的 制备方法，包括以下步骤：
[0032] (1)检测反应杯的制备
[0033]采用D-二聚体单抗或者多抗采用物理吸附的方式结合在反应杯内表面；
[0034] (2)荧光标记抗体的制备
[0035]采用D-二聚体的单抗或者多抗采用共价交联的方式与荧光微球偶联；
[0036] (3)清洗液配制
[0037]优选的，所述偶联具体为：每1ml前处理后的羧基时间分辨荧光微球中加入 0.15mgD-二聚体的单抗或者多抗，室温混勾20~80min进行偶联(即，共价键交联）。
[0038] 优选的，所述前处理包括:加入MES、NHS和EDC进行初次活化处理，加入氨基己酸室 温混匀15~60min，加入MES、NHS和EDC进行再次活化处理;每Img羧基时间分辨荧光微球对 应10~IOOul 50mM氛基己酸。
[0039] 更优选的，所述初次活化处理包括：每Img羧基时间分辨荧光微球，加60ul500mM MES( 2-(N-吗啡啉）乙磺酸）缓冲液pH5.0~7.0，加0.02~0.2mgl-(3-二甲氨基丙基）-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，加0.4mg N-羟基琥珀酰亚胺，加纯化水至终体积600yL，室温混匀 15~60min;所述再次活化处理包括：加入所述氨基己酸室温混匀后，加 ImL IOOmM MES pH6.0,25000rpm离心清洗10~25min，弃去上清；加400ul IOOmM MES ρΗ6·0,超声分离，加 0 · 02~0 · 2mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加0 · 01~0 · lmgEDC，室温混匀10~20min。
[0040] 优选的，所述前处理包括:每Img羧基时间分辨荧光微球，加入60ul500mMpH6.0的 MES、0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.4mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS， 加纯化水至终体积600yL，室温混匀活化10~20min。
[0041] 优选的，步骤(2)中偶联之后还包括将共价键交联制备得到的荧光标记抗体进行 封闭、清洗后用反应缓冲液稀释到终浓度到30μg/ml，作为检测用荧光标记抗体的步骤;所 述每 IL 反应缓冲液中含有 50mM PB，I % BSA，0· 9 % NaCl，2 % 葡聚糖，0· 5 % tween 20，pH7 · 2。
[0042] 第四方面，本发明涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光D-二聚体分析试剂盒的 使用方法，包括将待测D-二聚体样品加入检测反应杯中，然后加入荧光标记抗体，37°C温 育，用清洗液清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，在340~380nm激发光激发下，测试反 应杯中荧光信号，检测波长为600~630nm〇
[0043] 本发明的方法将待测样品中的抗原抗体反应信息转化成了另一种更为直观的光 信号信息（荧光信号），利用该方法，经过一系列的研究工作，可以获得光子信号(荧光信号） 与待测抗原之间的对应关系，进而制作标准曲线，再通过对光子信号与标准曲线的比对或 者与阴阳性参考光子信号的比较检测最终获得待测抗原的定量或者定性检测结果。
[0044] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0045] 1)荧光标记物为时间分辨荧光乳胶微球，每个微球中填充了几万到几十万个稀土 元素离子螯合物，检测过程中并不需要解离增强过程，便可发出很强的荧光，简化了时间分 辨荧光检测步骤，解离增强时间分辨荧光检测往往需要1个小时左右时间才能得到检测结 果，而采用时间分辨荧光微球作为标记物，由于每个微球中填充了大量的镧系元素螯合物， 荧光信号放大数千倍以上，因此可以在较短的检测时间内完成检测，缩短了检测时间，并有 效的提高了检测灵敏度。
[0046] 2)荧光微粒活化过程中添加氨基己酸作为手臂，使得抗体与微球之间的距离增 加，有效的降低了空间位阻效应，提高了检测系统灵敏度。
[0047] 3)荧光免疫层析法，其特点检测时间短，但其精密度不理想，受环境温度影响较 大，且要手工操作，本发明采用基于微球的杯式时间分辨荧光分析，由于其超高的灵敏度， 其检测时间并不比层析长，一方面易于实现自动化操作，另一方面反应温度均一，不受环境 因素影响，准确性更好，精密度也优于层析试剂。
【附图说明】
[0048] 图1为本发明的原理不意图；
[0049] 图2为D-二聚体检测标准曲线；
[0050] 图3为与比浊法临床样本比对结果示意图；
[0051 ]其中，1为荧光标记抗体，2为D-二聚体抗原，3为包被抗体，4为反应杯固相表面，5 为发光免疫复合物。
【具体实施方式】
[0052]下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员 进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
[0053] 本发明的原理示意图如图1所示，包被抗体3结合在反应杯固相表面4上，在反应杯 中添加一定量的样品使得样品中的D-二聚体抗原2与反应杯固相表面结合的抗体3结合，再 加入荧光标记抗体1，温育形成发光免疫复合物5,采用清洗液清洗反应杯后去除未结合的 抗原及荧光标记抗体，检测反应杯中的荧光信号，与标准曲线进行对比，得到待测样本中D-二聚体抗原浓度。
[0054] 实施例1
[0055] I、检测反应杯的制备
[0056] (1)检测反应杯包被
[0057]将D-dimer抗体 1401 (Medix公司）用0 · 2M磷酸缓冲液(pH7 · 8)稀释成40μg/ml，100μ L/孔，37 °C包被4小时，洗板。
[0058] (2)检测反应杯封闭
[0059]用封闭缓冲液按200μ!7孔加入反应杯，37°C封闭4小时，弃去包被反应杯中的封闭 液，拍干。
[0060] (3)检测反应杯干燥
[0061 ]将上述封闭好的反应杯放置于湿度低于30 %的37 °C干燥箱中烘干8小时，密封干 燥保存。
[0062] 2、荧光标记抗体的制备 [0063] (1)荧光微粒前处理
[0064]取111^羧基时间分辨焚光微球（20〇11111，0.11111，1〇11^/1111^，1^叫81313公司），加6〇111 500mM MES(2-(N-吗啡啉）乙磺酸)缓冲液，pH6.0,加0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳 二亚胺盐酸盐(EDC)，加纯化水至终体积400yL，室温混匀15min。加 IOOul 50mM氨基己酸，室 温混勾30min。加 ImL IOOmM MES ρΗ6·0,离心清洗 15000rpm 20min，弃去上清。加400ul IOOmM MES ρΗ6·0,超声分离，加0.2mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)，加 O.lmgEDC，室温混匀 15min。加 ImL IOOmM MES ρΗ6·0缓冲液，离心清洗 15000rpm 20min，弃去上清。IOOmM MES pH6.0缓冲液恢复到Iml。
[0065] (2)抗体交联
[0066] 加0.15mg D-二聚体单克隆抗体1402(Medix公司），室温25°C混匀60min。
[0067] (3)封闭
[0068] 加 BSA封闭液，至终浓度10mg/mL BSA，室温25°C混匀过夜。
[0069] (4)清洗
[0070] 加3mL交联缓冲液（IOOmM MES pH6.0)，25000rpm离心清洗30min，弃去上清。加 500ul交联缓冲液(IOOmM MES pH6.0)，超声分离，终浓度2mg/ml。
[0071] (5)工作用荧光标记抗体配制
[0072] 配制反应缓冲液:缓冲液IL中含有50mM PB，I %BSA，0.9%NaCl，1 %葡聚糖，0.5% tween 20，pH7.2。
[0073]用反应缓冲液将上述清洗好的荧光标记抗体稀释到终浓度到30μg/ml，作为检测 用荧光标记抗体。
[0074] 3、清洗液的配制
[0075] 配制清洗缓冲液，含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，ρΗ7·2。
[0076] 4、D_二聚体检测
[0077] (1)标准曲线制备
[0078] 采用上述方法制备的试剂组合成D-二聚体时间分辨荧光定量试剂盒，测定校准 品，每个浓度重复10次。
[0079] 每个检测中加入校准品5yL，荧光标记抗体50yL，37 °C温育20min，然后清洗检测 杯，在PerkinElmer公司的Victor X4焚光读数仪上进行读数，标准曲线数据如表1所示，标 准曲线如图2所示。
[0080]由图2的标准曲线我们可以看到，该标准曲线线性良好，可以通过该标准曲线对样 本中所含的D-二聚体浓度进行定量分析。
[0081 ]通过表1结果可知，检测试剂盒的批内精密度良好，校准品各浓度点荧光信号精密 度均小于10% (除0值以外），且试剂灵敏度良好，在0.05μg/ml水平与0值校准品有显著区 分。
[0082I表1D-二聚体定量检测标准曲线数据
[0084] (2)样本测试
[0085]采用上述方法制备的试剂组合成D-二聚体时间分辨荧光定量试剂盒，测定临床样 本，与日本积水试剂配合全自动生化分析仪测试结果进行相关性分析。
[0086]每个检测中加入样品5yL，荧光标记抗体50yL，37°C温育20min，然后清洗检测杯， 在PerkinElmer公司的Victor X4焚光读数仪上进行读数，将测试结果带入图2标准曲线，计 算样品测试浓度，比对数据如表2所示，与积水试剂测试结果进行相关性分析，相关性曲线 如图3所示。
[0087]日本积水D-二聚体试剂盒是知名的免疫比浊法试剂盒是知名的D-二聚体检测试 剂盒，其精度和结果公认可靠。由图3显示可知本发明的试剂盒测定结果与积水试剂盒测定 结果相关系数R2为〇. 982，相关性很好，可用于临床诊断使用。
[0088] 表2临床样本比对结果
[0090] 实施例2
[0091] (1)检测反应杯包被
[0092] 将D-dimer抗体1401(]^虹1公司）用0.21磷酸缓冲液化!17.8)稀释成4(^8/1111，10(^ L/孔，37 °C包被4小时，洗板。
[0093] (2)检测反应杯封闭
[0094]用封闭缓冲液按200yL/孔加入反应杯，37°C封闭4小时，弃去包被反应杯中的封闭 液，拍干。
[0095] (3)检测反应杯干燥
[0096]将上述封闭好的反应杯放置于湿度低于30 %的37 °C干燥箱中烘干8小时，密封干 燥保存。
[0097] 2、荧光标记抗体的制备
[0098] (1)荧光微粒前处理
[0099] 取111^羧基时间分辨焚光微球（20〇11111，0.11111，1〇11^/1111^，1^叫81313公司），加6〇111 500mM MES(2-(N-吗啡啉）乙磺酸)缓冲液，pH6.0,加0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳 二亚胺盐酸盐(EDC)，加0.4mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，40yL，lOmg/mL)，加纯化水至终体积 400yL，室温23°C混匀 15min。加 ImL IOOmM MES ρΗ6·0缓冲液，15000rpm离心清洗20min，弃 去上清，IOOmM MES pH6.0缓冲液恢复到lml。
[0100] (2)抗体交联
[0101] 加0.15mg D-二聚体单克隆抗体1402(Medix公司），室温25°C混匀60min。
[0102] (3)封闭
[0103] 加 BSA封闭液，至终浓度10mg/mL BSA，室温25°C混匀过夜。
[0104] (4)清洗
[0105] 加3mL交联缓冲液（IOOmM MES pH6.0)，25000rpm离心清洗30min，弃去上清。加 500ul交联缓冲液(IOOmM MES pH6.0)，超声分离，终浓度2mg/ml。
[0106] (5)工作用荧光标记抗体配制
[0107] 配制反应缓冲液：缓冲液中含有50mM洲，1%83六，0.9%他(：1，1%葡聚糖，0.5% tween 20，pH7.2。
[0108] 用反应缓冲液将上述清洗好的荧光标记抗体稀释到终浓度到30μg/ml，作为检测 用荧光标记抗体。
[0109] 3、清洗液的配制
[0110] 配制清洗缓冲液，含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，ρΗ7·2。
[0111] 4、校准品测试
[0112] 采用上述方法制备的试剂组合成D-二聚体时间分辨荧光定量试剂盒，测定校准 品，每个浓度重复10次。
[0113] 每个检测中加入校准品5yL，荧光标记抗体50yL，37°C温育20min，然后清洗检测 杯，在PerkinElmer公司的Victor X4焚光读数仪上进行读数。
[0114]通过表3结果可知，检测试剂盒的批内精密度良好，校准品各浓度点荧光信号精密 度均小于10% (除0和0.05μg/ml水平以外），试剂灵敏度相比实施例1来说有所降低，仅在 0.2μg/ml水平与0值校准品有较为显著区分。说明荧光微粒前处理过程中通过添加手臂的 方式能有有效的提升检测的灵敏度。
【主权项】
1. 一种基于微球的杯式时间分辨焚光D-二聚体分析方法，其特征在于，所述方法包括 如下步骤： 51、 在检测反应杯内表面包被D-二聚体单抗或者多抗； 52、 将时间分辨荧光微球与D-二聚体单抗或者多抗通过共价键交联制备得到荧光标记 抗体； 53、 将待测D-二聚体样品加入步骤Sl包被后的检测反应杯内，再加入所述荧光标记抗 体，25°C~40°C温育； 54、 清洗去除未结合的抗原及焚光标记抗体，在340~380nm激发光激发下，测试检测反 应杯中荧光信号，检测波长为600~630nm; 55、 将所述荧光信号与标准曲线比对，获得所述待测D-二聚体样品的D-二聚体浓度。2. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光D-二聚体分析方法，其特征在 于，所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素螯合物。3. 根据权利要求2所述的基于微球的杯式时间分辨荧光D-二聚体分析方法，其特征在 于，所述镧系元素螯合物为Eu (TTA) 3/TOPO或Eu (TTA) 3/Phen。4. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光D-二聚体分析方法，其特征在 于，所述时间分辨荧光微球的粒径范围为100~1000 nm。5. 根据权利要求1~4中任一项所述的基于微球的杯式时间分辨焚光D-二聚体分析方 法，其特征在于，所述时间分辨焚光微球为前处理后的羧基时间分辨焚光微球;所述前处理 包括:加入MES、EDC进行初次活化处理，加入氨基己酸室温混匀15~60min，加入MES、NHS和 EDC进行再次活化处理;每Img羧基时间分辨荧光微球对应10~IOOul 50mM氨基己酸。6. 根据权利要求5所述的基于微球的杯式时间分辨焚光D-二聚体分析方法，其特征在 于，所述初次活化处理包括:每Img羧基时间分辨荧光微球，加60ul 500mM MES缓冲液pH5.0 ~7.0，加0.02~0. EDC，加纯化水至终体积400yL，室温混匀15~60min;所述再次活化处理 包括:加入所述氨基己酸室温混匀后，加 ImL IOOmM MES pH5.0~7.0，15000rpm离心清洗10 ~25min，弃去上清；加400ul IOOmM MES ρΗ5·0~7.0,超声分离，加0.02~0.2mg NHS，加 0·01~0·lmgEDC，室温混匀10~20min。7. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光D-二聚体分析方法，其特征在 于，步骤S2中，还包括将共价键交联制备得到的荧光标记抗体进行封闭、清洗后用反应缓冲 液稀释到终浓度30μg/ml，作为检测用荧光标记抗体的步骤;所述每IL反应缓冲液中含有50 ~200mM PB，1 ~5%BSA，0.9~3%NaCl，l~3%葡聚糖，0.02~2.0%tween 20，ρΗ6·0~ 9 · 0 〇8. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光D-二聚体分析方法，其特征在 于，所述清洗采用的清洗液每IL含5~IOOmM PB，0 · 9~3 %NaCl，0 · 02~1 · 0 % Tween 20，ρΗ6 ~9〇9. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光D-二聚体分析方法，其特征在 于，所述标准曲线为系列浓度的D-二聚体校准品的D-二聚体浓度与对应的荧光信号的关系 曲线;该荧光信号为采用所述基于微球的杯式时间分辨荧光D-二聚体分析方法测得的荧光 信号。10. -种基于微球的杯式时间分辨荧光D-二聚体分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 包括检测反应杯、荧光标记抗体和清洗液； 所述检测反应杯内表面包被D-二聚体单抗或者多抗； 所述荧光标记抗体是由时间分辨荧光微球与D-二聚体单抗或者多抗通过共价键交联 制备而得； 所述清洗液每IL含5~IOOmM ΡΒ，0·9~3%NaCl，0.02~1.0%Tween 20，pH6~9。
【文档编号】G01N33/58GK105891176SQ201610210521
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月6日
【发明人】石晓强, 杨晶, 周奕璇, 李福刚, 徐建新
【申请人】上海奥普生物医药有限公司