一种抗体修饰纳米微球电泳流动型elisa的方法

文档序号:10532905阅读:429来源:国知局
一种抗体修饰纳米微球电泳流动型elisa的方法
【专利摘要】一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法,属于生物材料领域。第一抗体吸附在多孔膜表面,再进行封闭剂蛋白吸附;抗原?第一抗体反应;电泳驱动抗体修饰纳米微球,进行第二抗体?抗原反应,对酶标第二抗体进行显色定量:电泳驱动第二抗体?抗原反应后,将多孔膜清洗,所得多孔膜基片放入第二抗体标识酶的底物溶液中,进行显色;通过检测吸光度,进行抗原定量分析。采用正电性PDDA/PSS修饰醋酸纤维素膜PEMs?CA,羧基聚苯乙烯纳米微球为酶标第二抗体修饰的载体。PEMs修饰降低了非特异性吸附,抗体修饰纳米微球起到信号放大的作用,电泳驱动力使第二抗体短时间内局部浓缩到抗原周围,实现了快速灵敏的检测。
【专利说明】
一种抗体修饰纳米微球电泳流动型EL ISA的方法
技术领域
[0001 ]本发明属于生物材料技术领域,特别涉及抗体修饰纳米微球(NP-Ab)的制备,及电 泳驱动NP-Ab流动检测的酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法。
【背景技术】
[0002] 酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA),酶(一般为辣 根过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记在抗原或者抗体上,由于抗原和抗体的特异性反应和酶 催化底物作用结合,通过其颜色变化检测和定量少量蛋白质的试验方法,其检测限(L0D)为 O.lng到lyg/mL,广泛应用于食品、工业、环境监测、和临床医学等诸多领域。由于近年来越 来越多蛋白质标志物的出现,对疾病检测的要求也越来越高。但是ELI SA在常规的聚苯乙烯 基板(polystyrene:PS)基板上的静态温育反应存在以下几个问题:(1)在PS上的第一抗体 容易变性,并且与抗原反应的部位不容易裸露在基片表面;(2)封闭效果不佳,导致抗原及 第二抗体的非特异性吸附,影响了ELISA系统的灵敏度;(3)在抗原抗体反应过程中,抗原需 要长时间的自由扩散,长时间的温育反应成为限速步骤,导致缓慢的结合速度,影响了分析 的灵敏度和动态量程。虽然有很多通过纳米材料制备来提高ELISA系统灵敏度的研究,但其 操作复杂及成本过高,导致难以实际应用。另外,微细加工芯片牌组器、微阵列芯片、微流体 技术,却由于其表面修饰技术的欠缺、操作的复杂性等弊端不能广泛的应用于高灵敏度的 临床检测。针对以上ELISA系统的检测弊端,因此,寻找一种可以"快速-灵敏-简便"检测 ELISA系统显得尤为重要。将抗体修饰纳米微球与电泳技术有机融合在ELISA系统中,解决 常规ELISA体系非特异性吸附高、反应效率低、混合样品检测困难等问题,具有重要的意义。

【发明内容】

[0003] 本发明的目的在于解决ELISA系统中样品检测低效率问题并进一步解决低灵敏度 的问题,而提供一种聚电解质多层膜基片电泳流动型ELISA方法,尤其提供一种NP-Ab电泳 流动型ELI SA方法,以解决【背景技术】中存在的问题。本发明所提供一种NP-Ab电泳流动型 ELISA方法中,表面羧基化纳米微球修饰酶标识抗体,在抗原抗体特异性反应中起到信号放 大的作用,大大提高了检测灵敏度。其次电泳技术作为ELISA体系中NP-Ab流动检测的驱动 方式,大大缩短了检测时间,提高了检测效率。
[0004] 本发明所提供的一种NP-Ab电泳流动型ELISA的方法,其特征在于,包括以下步骤:
[0005] (1)将第一抗体吸附到聚电解质修饰的多孔膜基片上;
[0006] (2)吸附第一抗体的多孔膜基片再进行封闭剂蛋白吸附;
[0007] (3)抗原-第一抗体反应:将步骤(2)第一抗体和封闭剂蛋白吸附后的多孔膜基片 加入到抗原溶液中,进行抗原-第一抗体反应;
[0008] (4)电泳驱动NP-Ab-抗原反应:将步骤(3)抗原-第一抗体反应后的多孔膜基片固 定在电泳装置中,在电泳装置中所述的多孔膜基片一侧注入NP-Ab磷酸盐缓冲液即电泳溶 液,插入负电极,多孔膜基片另一侧注入磷酸盐缓冲溶液,插入正电极;正电极和负电极加 电压,进行抗原-第二抗体反应;
[0009] (5)对酶标第二抗体进行显色定量:将步骤(4)电泳驱动NP-Ab-抗原反应后的多孔 膜基片放入到第二抗体标识酶的底物溶液中,进行显色;通过检测吸光度,进行抗原定量分 析。
[0010] 优选上述步骤(1)多孔膜基片是聚电解质多层膜修饰的醋酸纤维素多孔膜(PEMs-CA),PEMs-CA是依次利用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚苯乙烯硫酸钠交叉层叠修饰的CA 多孔膜且修饰的最外层是聚(二烯丙基二甲基氯化铵),得到正电性的PDDA/PSS修饰CA,即 PEMs-CA,优选PEMs-CA中聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚苯乙烯硫酸钠交叉层叠修饰7层, 通过其表面电荷性提高第一抗体与封闭剂(卵清蛋白ovalbumin: 0VA)的吸附量,提高抗原 与抗体反应的密度(信号)、抑制抗原和第二抗体的非特异性吸附(噪音),进而大幅度提高 灵敏性(信号与噪音比例)。上述多孔膜基片选取醋酸纤维素(cellulose acetate,CA)多孔 膜基片,醋酸纤维素多孔膜的孔径优选450nm;选取TODA/PSS修饰的醋酸纤维素膜为PEMs-CA作为检测溶液透过基片。
[0011] 进一步优选步骤(4)NP-Ab为:羧基化聚苯乙烯纳米微球(微球直径优选为200nm), 通过化学方法将纳米微球表面的羧基和酶标抗体分子的氨基偶联,进行偶联时酶标抗体分 子浓度为15-240yg/mL,微球浓度为l-5mg/mL; B y G作为模型蛋白优化酶标第二抗体及纳米 微球偶联浓度条件,优选酶标抗体分子浓度与微球浓度分别为60iig/mL,lmg/mL,得到每个 纳米微球表面修饰酶标第二抗体的数量约48个。
[0012] 进一步优选步骤(4)电泳驱动NP-Ab-抗原反应的电泳电压和电泳时间,电泳的电 压大小决定NP-Ab的移动速度;电泳时间的长短影响NP-Ab与抗原的结合效率。所以进一步 调节电泳的电压与时间,从而进一步提高检测灵敏度。电泳电压与时间优化范围为25-35V 和l_5min,进一步优选电泳电压与时间为30v、2min。
[0013] 在此电泳流动型ELISA系统中,NP-Ab浓度可进行调节,通过正交试验对NP-Ab浓度 进行最优化,确定NP-Ab的最佳浓度为100iig/mL。利用此浓度检测抗原的定量曲线,得到最 低检测限为〇.13pM。比传统ELISA检测水平高出254倍,检测速度提高了30倍。
[0014]本发明具有以下有益效果:
[0015] 1)本发明所提供的NP-Ab电泳流动型ELI SA的方法,创制电泳环境中能够高效抑制 ELISA非特异性吸附的PEMs。
[0016] 2)本发明所提供的NP-Ab电泳流动型ELISA的方法,创制能够起到信号放大作用的 NP-Ab〇
[0017] 3)本发明所提供的NP-Ab电泳流动型ELISA的方法,创制灵敏、快速、简便的电泳流 动型ELISA系统。电泳驱动型有效控制带负电NP-Ab向正极电极方向流动,所以在短时间的 流动过程中使NP-Ab局部浓缩到多孔膜(即抗原)近旁,完成灵敏、快速的抗体-抗原反应,与 传统ELISA相比,既提高了灵敏度又大幅度缩短了反应时间。
【附图说明】
[0018]图1本发明实施例所用电泳装置示意图。
[0019] 图2 NP-Ab流动型ELISA的检测曲线。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明做进一步说明,但本发明并不限于以下实施例。如所用 溶液的浓度、pH值等可根据需要调节等。
[0021] 本发明实施例采用的电泳装置见图1。电泳装置为一平放发的圆桶结构,多孔膜位 于中间将圆桶一分为二,多孔膜的一侧为NP-Ab溶液,端面设有溶液进口和电极;另一侧为 PB缓冲液,端面设有溶液进口和电极。
[0022] 实施例1 [0023] 1 ?溶液的配置:
[0024] a)50mM Tris-HC1@0.15M NaCl溶液的配置:将1.15175g Tris-base固体溶于 125mL超纯水中,取0.84mL HC1溶于100mL超纯水中得0.1M HC1溶液,待溶解后将HC1溶液滴 加入Tris-base溶液中调pH = 7.4为止,定容至250mL,称量2.208g NaCl固体加入Tris-HCl 中。
[0025] b)pH=7.4浓度为0.15M磷酸盐缓冲液(PB)的配置:称取10.74g Na2HP〇4 ? 12H20固 体加入到200mL超纯水中,称取4.68g NaH2P〇4 ? 2H20固体加入到200mL超纯水中,待溶解后 将NaH2P〇4溶液加入到Na2HP〇4溶液中,调pH=7 ? 4。
[0026] c)0.05%Tween 2000.03M PB配置:取250yL Tween-20加入到500mL 0.03M PB缓 冲液中。
[0027] d)2M H2SO4配置:取8mL超纯水加入lmL浓H2S〇4(98%)。
[0028] 2.抗体修饰纳米微球的制备方法:
[0029]活化缓冲液:0.1M PB,pH 6.3 [0030]偶联缓冲液:0.1M PB,pH 7.4 [0031] 封闭液:5mg/ml卵清蛋白(OVA)溶液
[0032] 活化剂:10mg/ml碳化二亚胺盐酸(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
[0033] 1)配置微球溶液:取一定质量羧基化聚苯乙烯微球(体积根据固含量计算)置于离 心管中(羧基化聚苯乙烯微球粒径为200nm),加入活化缓冲液稀释,超声混匀,离心 (14000rpm,13min),随后加入活化缓冲液,超声混匀。
[0034] 2)活化聚苯乙烯表面的羧基:采用活化缓冲液配置EDC和NHS溶液,将一定体积的 EDC和NHS溶液迅速加入微球溶液中,漩涡混匀,静置20分钟。
[0035] 3)清洗微球:将活化后的纳米微球离心,弃去上清液,加入偶联缓冲液超声分散, 上述步骤重复两次。
[0036] 4)偶联酶标抗体:将步骤3)得到的纳米微球中加入酶标抗体溶液,(微球浓度lmg/ mL,酶标抗体浓度60yg/mL)立刻涡旋混匀,并超声分散,随后室温反应2h。
[0037] 5)封闭未反应羧基:将步骤4)微球超声分散,加入封闭液,室温反应lh,反应后离 心清洗两次。
[0038] 3.PEMS修饰CA多孔膜制备
[0039] 1)配制PDDA与PSS溶液。分别称取PDDA和PSS固体各2mg,分别溶于10mL 50mM Tris-HC1@0.15M NaCl pH=7.4的溶液中,得PDDA和PSS浓度为0.2mg/mL。
[0041 ] 2)PEMs修饰CA多孔膜制备。超纯水浸湿的CA膜(孔径450nm)放入roDA溶液中,室温 下浸渍2min,之后用超纯水清洗30s,洗去未吸附的聚电解质溶液。然后放入PSS溶液中,室 温下浸渍2min,之后用超纯水清洗30s,以上TODA与PSS交替进行,制备7层正电性的自组装 多层膜PEMs ((PDDA/PSS) 3roDA)。
[0042] 4.NP-Ab电泳流动型ELISA检测
[0043] 1)第一抗体吸附实验。将TOMs-CA基片浸泡在60yg/mL兔抗鼠IgG抗体(rabbit anti-mouse IgG@0.03M PB)溶液中,室温下吸附2h后,将CA膜用0.03M PB缓冲液清洗3次。 [0044] 2)封闭剂蛋白(卵清蛋白,0VA)吸附实验。第一抗体吸附的PEMs-CA基片放入lmg/ mL OVA溶液中,37°C下吸附lh,将PEMs-CA基片用0.03M PB缓冲液清洗3次。
[0045] 3)抗原与第一抗体反应。将带有第一抗体及0VA的TOMs-CA基片放入抗原溶液 (mouse IgG@0.03M PB)中,37°C下吸附lh后,用0.03M TO缓冲液清洗3次,不加抗原的溶液 PEMs-CA为对照组;
[0046] 4)优化电泳电压与时间,电泳驱动N P - A b -抗原反应。将吸附第一抗体与抗原的 PEMs-CA基片固定在玻璃分离腔中央(图1),分离腔入口侧注入lmL 100yg/mLNP-Ab溶液,分 离腔出口处加入0.03M PB溶液。入口侧接入电源负极,出口侧接入电源正极。分别调节电压 为25¥、3(^、35¥,时间为1111111、2111111、5111111,进行抗原-抗体反应。将电泳后的?£]\^-04基片,经 过0.05%了¥6611-20@0.0311?8缓冲液清洗1次、0.0311?8缓冲液清洗3次 ;
[0047] 5)酶标显色定量。将PEMs-CA基片加入到0.4mL的四甲基联苯胺溶液(TMB),室温下 避光反应30min后,再加入0.4mL 2M H2S〇4溶液,终止反应。通过检测450nm处吸光度,进行抗 原定量。
[0048] 6)PEMs-CA基片电泳流动型ELISA检测曲线测定。通过测定不同电压与时间下的检 测灵敏度(信噪比值(S/N))(信号S即为抗原存在时的第二抗体反应信号;噪音N即为无抗原 时,第二抗体非特异性吸附的信号),得到最优的电压与时间条件为30v,2min。再此条件下, 检测不同浓度抗原的信号,获得PEMs-CA基片电泳流动型ELISA检测曲线(图2)。
【主权项】
1. 一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法,其特征在于,(I)将第一抗体吸附 到聚电解质修饰的多孔膜基片上; (2) 吸附第一抗体的多孔膜基片再进行封闭剂蛋白吸附; (3) 抗原-第一抗体反应:将步骤(2)第一抗体和封闭剂蛋白吸附后的多孔膜基片加入 到抗原溶液中,进行抗原-第一抗体反应; (4) 电泳驱动NP-Ab-抗原反应:将步骤(3)抗原-第一抗体反应后的多孔膜基片固定在 电泳装置中,在电泳装置中所述的多孔膜基片一侧注入NP-Ab磷酸盐缓冲液即电泳溶液,插 入负电极,多孔膜基片另一侧注入磷酸盐缓冲溶液,插入正电极;正电极和负电极加电压, 进行抗原-第二抗体反应; (5) 对酶标第二抗体进行显色定量:将步骤(4)电泳驱动NP-Ab-抗原反应后的多孔膜基 片放入到第二抗体标识酶的底物溶液中,进行显色;通过检测吸光度,进行抗原定量分析。2. 按照权利要求1所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型E LIS A的方法,其特征在 于,步骤(1)多孔膜基片是聚电解质多层膜修饰的醋酸纤维素多孔膜PEMs-CA,PEMs-CA是依 次利用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚苯乙烯硫酸钠交叉层叠修饰的CA多孔膜且修饰的 最外层是聚(二烯丙基二甲基氯化铵),得到正电性的H)DA/PSS修饰CA,即PEMs-CA。3. 按照权利要求2所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型E LIS A的方法,其特征在 于,PEMs-CA中聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚苯乙烯硫酸钠交叉层叠修饰7层。4. 按照权利要求2所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型E LIS A的方法,其特征在 于,醋酸纤维素多孔膜的孔径优选450nm。5. 按照权利要求1所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型E LIS A的方法,其特征在 于,步骤(4)NP-Ab为:羧基化聚苯乙烯纳米微球,通过化学方法将纳米微球表面的羧基和酶 标抗体分子的氨基偶联,进行偶联时酶标抗体分子浓度为15_240yg/mL,微球浓度为l-5mg/ mL〇6. 按照权利要求5所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型E LIS A的方法,其特征在 于,B YG作为模型蛋白优化酶标第二抗体及纳米微球偶联浓度条件,得到酶标抗体分子浓 度与微球浓度分别为60yg/mL、lmg/mL,每个纳米微球表面修饰酶标第二抗体的数量约48 个。7. 按照权利要求5所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型E LIS A的方法,其特征在 于,微球直径为200nm〇8. 按照权利要求1所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型E LIS A的方法,其特征在 于,电泳电压与时间范围为25-35V和l-5min。9. 按照权利要求1所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型E LIS A的方法,其特征在 于,电泳电压与时间为30v、2min。10. 按照权利要求1所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELI SA的方法,其特征在 于,NP-Ab的浓度为100yg/mL。
【文档编号】G01N33/53GK105891306SQ201610476330
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】申鹤云, 张芳芳
【申请人】北京化工大学
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