一种iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法，通过同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术筛选早期心肌梗死疾病患病人群血清中差异表达的蛋白质，通过对两组标记后的血清样品的质谱结果进行单样本T检验分析，找到6个高表达的蛋白，1个为正常组中高表达，5个为早期心肌梗死疾病组中高表达。其中，在疾病组中Leucine?rich alpha?2?glycoprotein蛋白覆盖度和唯一肽段数最高，通过肽段数据的分析证实其肽段也存在显著差异，经过基因本体功能注释分析发现此蛋白可能与血栓形成等过程相关。本发明方法具有分辨率高、通量大、速度快等优势，为此类疾病蛋白标志物的筛选开辟了一条新的途径。
【专利说明】
一种i TRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物检测技术领域，具体是一种同位素标记相对和绝对定量蛋白质组 学技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 心肌梗死(myocardial infarction MI)即心肌缺血性坏死，为在冠状动脉病变的 基础之上，发生冠状动脉血供急剧减少或中断使得心肌严重而持久的缺血导致心肌坏死。 此疾病具有发病急，不易察觉，病残病死率高等特点。目前心肌梗死患者呈现快速上升趋 势，估计每年有250万例心肌梗死的发生，然而只有5%的患者得到及时合理的救治。因此开 发出一种早期快速的诊断试剂对疾病的早期防治和降低疾病病发率，减少疾病的病残病死 率有着最重要意义。
[0003] 现代临床诊断心肌梗死疾病主要通过肌钙蛋白（CTnl)、肌酸激酶同工酶(CKMB)、 肌红蛋白（Myo)等生化标志物并结合心电图和影像学等证据。但这些生化标志物仅在病发 时才能表现出异常，而在疾病早期并无明显变化。因此，寻找新的早期诊断标志物可以提前 对此疾病进行防治，减少此类疾病的发生和发展。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法，以解 决上述【背景技术】中提出的问题。
[0005] 本发明首次通过同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)蛋白质组学技术筛选在心肌梗死疾病中的差异表达的 蛋白质，为此类疾病标志物的筛选开辟了一条新的途径，为开发心肌梗死疾病的早期诊断 试剂提供重要理论依据。
[0006]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 一种iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法，包括以下步骤： (1) 取正常组与心肌梗死疾病组血清，组内随机合并，将合并后样品使用去人血清高丰 度柱依次去除各组高丰度蛋白质，低丰度蛋白质组分超滤浓缩后，进行蛋白质定量，将制备 好的蛋白质样品进行分装，_80°C保存备用； (2) 取2组8个蛋白质样本各取250yg，各组加入等体积的蛋白质裂解液，沸水浴4~ 6min，冷却至室温;加入200yL尿素缓冲液混匀，转入10kd超滤离心管，离心14~16min;加入 200yL尿素缓冲液离心14~16min，弃滤液;加入100此碘乙酰胺缓冲液，600rpm振荡lmin，避 光室温25~35min，离心9~1 lmin;加入100iiL尿素缓冲液，离心9~1 lmin重复2次;加入100ii L标记缓冲液，离心9~1 lmin，重复2次;加入40iiL胰蛋白酶缓冲液，600rpm振荡lmin，37°C 16~18h;换新收集管，离心9~1 lmin，取滤液，OD28Q肽段定量； (3) 取等量的肽段进行同位素标记，标记方案如下:正常组1-113，正常组2-114，正常组 3-115,正常组4-116,疾病组1-117,疾病组2-118,疾病组3-119,疾病组4-121; (4) 分别取所有标记样品合并，合并样品进行离子交换色谱柱分级，收集穿流及洗脱， 根据离子交换色谱柱色谱图合并，冻干后C18脱盐柱脱盐； (5) 样品采用纳升流速高效液相系统进行分离，上样量为5yL，缓冲液:A液为0.1 %甲酸 水溶液，B液为0.1 %甲酸乙腈水溶液，乙腈为84%，色谱柱以95 %的A液平衡;样品由自动进 样器上样到上样柱，再经分析柱分离，流速为400nL/min，相关液相梯度如下：0~lOOmin，B 液线性梯度从0~35% ;100~108min，B液线性梯度从35~100% ;108~120min，B液维持在 100%;样品经毛细管高效液相色谱分离后用质谱仪进行质谱分析，分析时长120min，检测 方式正离子，母离子扫描范围300~1800m/z，一级质谱分辨率70000at m/z 200,进入离子 阈值:3e6，一级最大灌注时间20ms，扫描范围数量:1，动态排除时间：40.0 s; 多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集:每次全扫描后采集10个碎片图谱 (MS2scan)，MS2碎裂方式:高能碰撞裂解，分离度窗口 ： 2m/z，二级质谱分辨率：17500at m/z 200，微扫描：1，二级最大灌注时间：60ms，碰撞能量:27eV; (6) 将得到的数据，进行数据处理。
[0007] 作为本发明进一步的方案:所述步骤(2)中，所述尿素缓冲液为8M尿素、150mM三羟 甲基氨基甲烷-盐酸的混合物，pH为8.0。
[0008] 作为本发明进一步的方案:所述步骤(2)中，所述碘乙酰胺为50mM碘乙酰胺溶液。 [0009]作为本发明再进一步的方案:所述步骤(2)中，所述胰蛋白酶缓冲液为5yg胰蛋白 酶溶解于40yL的标记缓冲液。
[0010] 本发明的原理为：通过同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)蛋白质组学技术筛选早期心肌梗死疾病 患病人群血清中差异表达的蛋白质。通过对两组标记后的血清样品的质谱结果进行单样本 T检验分析，找到6个高表达的蛋白（ratio>2)，1个为正常组中高表达，5个为早期心肌梗死 疾病组（以下简称疾病组）中高表达。其中，在疾病组中Leucine-rich a lpha-2-glycoprotein蛋白覆盖度和唯一肽段数最高，通过肽段数据的分析证实其肽段也存在显著 差异。经过基因本体功能注释分析发现此蛋白可能与血栓形成等过程相关。
[0011] 与现有技术相比，本发明的有益效果是:具有分辨率高、通量大、速度快等优势，为 此类疾病蛋白标志物的筛选开辟了一条新的途径。
【附图说明】
[0012]图1为实施例1中正常组与疾病组定量比值分布； 图2为实施例1中Leucine-rich &]^1^-2-815^(^1'(^6；[11蛋白鉴定得到的17个肽段中 vFSNGADLSGVTEEAPLk肽段的二级质谱图； 图3为实例1中Leucine-rich alpha-2-glycoprotein蛋白鉴定到的肽段在正常组与疾 病组中比值分布图。
【具体实施方式】
[0013]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0014]实施例1血清蛋白质样品的制备 本实施例中所使用的去人血清高丰度柱(Agilent H-14)购自安捷伦公司;二硫苏糖醇 (DTT)、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)均购自伯乐公司。
[0015]本实施例使用Agilent H-14依次去除样品中存在的高丰度蛋白质，并通过超滤浓 缩的方法对低丰度蛋白质组分进行浓缩。具体如下： 取正常组与心肌梗死疾病组（以下简称疾病组)血清各35例，组内随机合并成4例。将合 并后样品使用Agilent H-14依次去除各组高丰度蛋白质，低丰度蛋白质组分超滤浓缩后， Bradf ord蛋白定量试剂盒(伯乐)进行蛋白质定量。制备好的蛋白质样品进行分装，-80 °C保 存备用。
[0016] 实施例2运用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术进行正常组与心肌梗死 疾病组差异表达蛋白质的筛选 本实施例中所使用尿素(urea)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、碘乙酰胺（IAA)购自伯乐公 司；胰蛋白酶（Trypsin)购自Sigma公司；标记试剂盒iTRAQ Reagent_8plex Multiplex Kit 购自AB SCIEX公司；离子交换色谱仪为AKTA Purifier 100,购自GE Healthcare;色谱柱为 Polysulfoethyl 4.6x100mm column(5ii，20〇A)，购自PolyLCInc公司；脱盐柱使用C18脱盐 柱，购自 Sigma ;分析软件使用Proteome Discovererl ? 4( thermo)，ProteomicsTools (Version:3?0?5) 〇
[0017]取实施例1得到的2组8个蛋白质样本，结合FASP酶解和质谱技术进行正常组与疾 病组间的差异蛋白质的筛选，具体如下： 将实施例1中2组8个蛋白质样本各取250yg并同时进行如下操作：各组加入等体积的 SDT裂解液，沸水浴5min，冷却至室温。加入200yL尿素缓冲液（8M Urea，150mM Tris-HCl pH8.0)混匀，转入10kd超滤离心管，离心14000g 15min。加入200yl尿素缓冲液离心14000g 15min，弃滤液。加入1 OOlil碘乙酰胺缓冲液，600rpm振荡lmin，避光室温30min，离心14000g 10min。加入100yl尿素缓冲液，离心14000g 10min重复2次。加入100此标记缓冲液，离心 14000g 10min重复2次。加入40yl胰蛋白酶缓冲液（5yg胰蛋白酶in 40此标记缓冲液）， 600印111振荡1111；[11，37<€16-1811。换新收集管，离心1400(^10111；[11，取滤液，0028()肽段定量。 [0018] 按照ABI公司说明书取等量肽段（lOOyg)进行同位素标记，实施例1标记方案如表 1〇
[0019] 表1实施例1的同位素标记方案
分别取实施例1中所有标记样品合并，合并样进行离子交换色谱柱(SCX)分级，收集穿 流及洗脱fraction约30份，根据SCX色谱图合并成10份，冻干后C18脱盐柱(Sigma)脱盐。
[0020] 样品采用纳升流速高效液相系统Easy nLC进行分离，上样量为5yL。缓冲液:A液为 0.1 %甲酸水溶液，B液为0.1 %甲酸乙腈水溶液（乙腈为84 % )。色谱柱以95 %的A液平衡。样 品由自动进样器上样到上样柱thermo scientific EASY column(2cm*100iim 5ym-C18)，再 经分析柱thermo scientific EASY column(75iim*100mm 3ym-C18)分离，流速为400nl/ min。相关液相梯度如下:0~100min，B液线性梯度从0~35% ; 100~108min，B液线性梯度从 35~100 % ; 108~120min，B液维持在100 %。样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。分析时长:120min，检测方式:正离子，母离子扫描范围：300 ~1800m/z，一级质谱分辨率：70000at m/z 200，进入离子阈值：3e6，一级最大灌注时间 20ms，动态排除时间：40.0 s。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集:每次全扫 描(full scan)后采集10个碎片图谱(MS2scan)，二级质谱分辨率：17500at m/z 200,微扫 描：1，二级最大灌注时间：60ms，碰撞能量:27eV。
[0021 ] 数据处理使用的数据库为Uniprot数据库(uniprot_human. fasta)，搜库软件为 Proteome Discovererl .4(thermo)，结果过滤参数为:肽段最大错配率< 0.01。搜库结果的 定量分析如下：抽提肽段报告离子峰强度值信息，并以各标签通道值的中位数对信号强度 进行归一化处理。肽段定量结果为参考样品所在标签的信号强度值与其他标签的信号强度 值的比值。蛋白质定量结果为鉴定肽段定量结果的中位数。最终定量结果再以各标签比值 中位数进行归一化处理，以消除实验中人为因素引入的上样量误差。
[0022] 本实施例中对实施例1中的样品总共鉴别出了546个蛋白质，差异表达蛋白质有97 个，在正常组中高表达的为54中蛋白质，在疾病组中高表达的为43个。通过正常组和疾病组 的比值取Logs对数分布直方图（附图1)可以看出，有82.23%的蛋白质数据分布于±0.26之 间(0.8~1.2倍之间）。在实施例1中样品的质谱结果中，每组各个样品与对应的比较组的均 值做比值，通过Pearson软件做相关性分析。相关系数R见表2。通过表2的结果可以看出，正 常组与疾病组生物重复组内的相关性系数均在0.5以上。
[0023] 表2实施例1中每组各个样品与对应的比较组的均值做比值的相关性分析
在实施例1中差异表达的97个蛋白质中，高表达(ratio>2)的蛋白有6个，1个为正常组 高表达，5个为疾病组高表达。其中，Leucine-rich alpha-2-glycoprotein蛋白覆盖度和唯 一肽段数最高，分别为50%和17条。数据库检索结果蛋白表见表3。各个肽段信号值与相应 的内参的比值的分布图如附图3,正常组与疾病组肽段完全分开。将疾病组各自肽段信号值 与对应正常组肽段的各组的强度值均值的比值进行单样本T检验分析，p值均达到显著水平 (p<0.05)，Leucine_rich alpha-2-glycoprotein蛋白肽段表见表4〇 [0024] 表3蛋白鉴定表(ratio>2)
[0025]表4Leucine_rich alpha-2-glycoprotein肽段鉴定表（P01009)
综上所述，在实施例1实验中，正常组与疾病组蛋白质变化趋势分析结果发现82.23% 以上蛋白变化倍数在0.8~1.2倍之间；组内三次生物学重复实验的相关系数R值均在0.5以 上，说明本次实验数据的可靠和严谨。在高表达的6个蛋白中，Leucine-rich alpha-2-glycoprotein蛋白覆盖度和唯一肽段数最高。对此蛋白所检测到的肽段数据分析证实其肽 段数据也存在显著的差异。通过基因本体功能注释分析发现此蛋白可能与血栓形成等过程 相关。
[0026]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论 从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
【主权项】
1. 一种iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 取正常组与心肌梗死疾病组血清，组内随机合并，将合并后样品使用去人血清高丰 度柱依次去除各组高丰度蛋白质，低丰度蛋白质组分超滤浓缩后，进行蛋白质定量，将制备 好的蛋白质样品进行分装，_80°C保存备用； (2) 取2组8个蛋白质样本各取250yg，各组加入等体积的蛋白质裂解液，沸水浴4~ 6min，冷却至室温;加入200yL尿素缓冲液混匀，转入IOkd超滤离心管，离心14~16min;加入 200yL尿素缓冲液离心14~16min，弃滤液;加入IOOyL碘乙酰胺缓冲液，600rpm振荡Imin，避 光室温25~35min，离心9~I Imin;加入IOOyL尿素缓冲液，离心9~I Imin重复2次;加入100μ L标记缓冲液，离心9~I Imin，重复2次;加入40yL胰蛋白酶缓冲液，600rpm振荡Imin，37 °C 16 ~18h;换新收集管，离心9~I Imin，取滤液，OD28Q肽段定量； (3) 取等量的肽段进行同位素标记，标记方案如下：正常组1-113,正常组2-114,正常组 3-115,正常组4-116,疾病组1-117,疾病组2-118,疾病组3-119,疾病组4-121; (4) 分别取所有标记样品合并，合并样品进行离子交换色谱柱分级，收集穿流及洗脱， 根据离子交换色谱柱色谱图合并，冻干后C18脱盐柱脱盐； (5) 样品采用纳升流速高效液相系统进行分离，上样量为5yL，缓冲液:A液为0.1 %甲酸 水溶液，B液为0.1 %甲酸乙腈水溶液，乙腈为84%，色谱柱以95 %的A液平衡;样品由自动进 样器上样到上样柱，再经分析柱分离，流速为400nL/min，相关液相梯度如下：0~IOOmin，B 液线性梯度从0~35% ;100~108min，B液线性梯度从35~100% ;108~120min，B液维持在 100%;样品经毛细管高效液相色谱分离后用质谱仪进行质谱分析，分析时长120min，检测 方式正离子，母离子扫描范围300~1800m/z，一级质谱分辨率70000at m/z 200,进入离子 阈值:3e6，一级最大灌注时间20ms，扫描范围数量:1，动态排除时间：40.0 s; 多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集:每次全扫描后采集10个碎片图谱 (MS2Scan)，MS2碎裂方式:高能碰撞裂解，分离度窗口 ： 2m/z，二级质谱分辨率：17500at m/z 200，微扫描：I，二级最大灌注时间：60ms，碰撞能量:27eV; (6) 将得到的数据，进行数据处理。2. 根据权利要求1所述的iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法，其特征在于， 所述尿素缓冲液为8M尿素、150mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸的混合物，pH为8.0。3. 根据权利要求1所述的iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法，其特征在于， 所述步骤(2)中，所述碘乙酰胺为50mM碘乙酰胺溶液。4. 根据权利要求1所述的iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法，其特征在于， 所述步骤(2)中，所述胰蛋白酶缓冲液为5yg胰蛋白酶溶解于40yL的标记缓冲液。
【文档编号】G01N30/02GK105891314SQ201610133697
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月9日
【发明人】陈薇, 阮宏强, 王健, 孙晓斌
【申请人】上海中科新生命生物科技有限公司