慢性肾小球肾炎唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法
【专利摘要】本发明公开了一种慢性肾小球肾炎唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，包括以下步骤：样品收集；样品预处理；纳米磁珠活化；唾液样品上样；纳米磁珠洗脱；数据采集；数据分析；建立诊断模型。本发明运用液态芯片结合MALDI?TOF?MS技术对慢性肾小球肾炎患者与正常对照组的睡液蛋白质进行表达谱检测，从唾液蛋白质组初步筛选出可用于慢性肾小球肾炎病证结合诊断的具有特异性的生物标记物，探索并建立了相关病证结合的诊断模型。该方法与传统的疾病生物标志物相关的检测方法相比较，具有无创伤性、操作简便、快捷、敏感性及特异性高等特点，其筛选出的生物标志物对于准确快速地疾病诊断、证候鉴别、预后判断均具有重要的临床意义。
【专利说明】
慢性肾小球肾炎唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法
技术领域
[0001] 本发明属于蛋白质谱应用技术领域，具体地说，涉及一种慢性肾小球肾炎唾液蛋 白指纹图谱分子诊断模型建立方法。
【背景技术】
[0002] 慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis，CGN)是临床上的常见病和多发 病，以不同程度蛋白尿、血尿、水肿和高血压为基本临床表现，起病隐匿，病程迀延，患者可 伴有不同程度的慢性肾功能减退，并最终发展为慢性肾衰竭。患者年龄跨度较大，早期诊断 对疾病的早期预防和治疗有重要意义。
[0003] 蛋白质组学(proteomics)是研究一种细胞、组织或完整的生物体所拥有的全套的 蛋白质，在蛋白组层次进行的生命科学研究，应用于疾病研究，可以绘制蛋白质图谱，寻找 疾病特异性蛋白，并能提供治疗药物的候选靶点，为药物研制提供依据。唾液是人体不可缺 少的一种重要体液，血液成分如多种激素、氨基酸、电解质、免疫球蛋白、肌酐等均可通过毛 细血管壁的唾液血液屏障进入唾液，作为人体体液的一部分，其成分含量的变化，受体内种 种病理生理变化的影响。相比血清及组织检测手段，唾液检测具有很多优点，容易采集、样 本需要量较小、成本低、易于储存和运输，对病人无侵入性，此外，唾液中生物标记物检测对 疾病诊断具有很强的敏感性和特异性。因此，运用唾液检测辅助诊断临床疾病将成为一种 新趋势。国外多项研究显示唾液可作为区分肿瘤的良、恶性的生物标记物。唾液作为一种成 分复杂、具有多种生物学功能的重要体液，唾液中独特、丰富的蛋白质成分毫无疑问是潜在 的肿瘤及疾病的理想的生物标记。
[0004] 目前在恶性肿瘤方向上的蛋白质组学研究大多针对血清分析，而对于常见恶性肿 瘤患者的唾液蛋白质检测尚未普及。由于唾液是血液的超滤成分，血液中的许多物质在唾 液中也同样存在，唾液可以反映血液中各种分子水平的变化。目前恶性肿瘤的确诊多属于 癌症晚期，而早期检测诊断手段有待开发研究，唾液蛋白质的检测成为一种新趋势。
[0005] 因此，提供一种诊断模型简便、快速、标本用量少，灵敏度高，特异性好的慢性肾小 球肾炎唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型的建立方法，就成为该技术领域急需解决的技术难 题。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决现有慢性肾小球肾炎检测技术方法复杂，灵敏度低，特异 性差，检测时间长，标本用量大的问题，提供了一种慢性肾小球肾炎唾液蛋白指纹图谱分子 诊断模型建立方法。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种慢性肾小球肾炎唾液蛋白指纹图谱分 子诊断模型建立方法，包括以下步骤：
[0008] (1)样品收集；
[0009] (2)样品预处理:收集的唾液样品在2h内置于转速3000r/min的4°C低温离心机离 心lOmin，并按照50iU/管分装于冻存管(EP管），置于-80°C冰箱冷冻保存备用；
[0010] ⑶纳米磁珠活化；
[0011] (4)唾液样品上样:④取5yl唾液样品，加10yl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入 185yl的Wash Buffer稀释(唾液最终上样量为2.5yl);⑤向含有活化纳米磁珠的PCR管加入 lOOiil处理好的唾液样品（注意避免产生气泡），室温孵育30min，置于磁铁上孵育lmin，去除 上清液;⑥再往PCR管加入100yl的Wash Buffer，洗脱5min，并置于磁铁上孵育lmin，去除上 清液;⑦再重复步骤⑥一次，以洗脱更干净，去除杂质，获得较纯的目的蛋白；
[0012] (5)纳米磁珠洗脱:每个PCR管加入10yl的Elution Buffer，洗脱5min(不能少于 5min)，放置于磁铁上孵育lmin，取5yl上清液移至另一个PCR管中，并加入5yl的CHCA饱和溶 液充分混匀，吸取2iU混合溶液加样到Au芯片上，风干，然后上机读取芯片，收集数据；
[0013] (6)数据采集；
[0014] (7)数据分析；
[0015] (8)建立诊断模型：用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用决策树算法计算 出多个变量(m/z蛋白质质谱峰)变化对两样本的判别价值，确定最佳的诊断模型。
[0016]进一步的，步骤（1)所述样品收集方法为:慢性肾小球肾炎组和正常对照组在取材 前一天晚上临睡前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天晨起后漱口前采用 非刺激性唾液采集方式空腹取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，收集到的唾液置 于冰浴预冷的50ml具塞离心管内，每个临床病例共采集唾液样品2-3毫升，将每个装有唾液 样本的所述离心管置于冰盒里，4°C保存。
[0017] 进一步的，步骤(3)所述纳米磁珠活化方法为:①取WCX纳米磁珠50iil加入到200iil 的PCR管，磁铁上孵育lmin(注意避免由于孵育时间过长导致磁珠结块），去除上清液;②再 加入100lil的Wash Buffer洗脱5min，在磁铁上孵育lmin，去除上清液;③重复步骤②一次， 重复是为了洗脱更干净，最好洗脱2次，这样质谱检测受到干扰的可能性会更少。
[0018]进一步的，步骤(6)所述数据采集方法为:采用质谱仪读取芯片信息，设置激光强 度为190,灵敏度为5,收集数据的质荷比范围为2000~25000m/z，信号收集位置40~60,平 均每点收集20次，收集总点为100次;数据采集前，用已知All-in-one多肽标准芯片校正仪 器，激光离子流为0.5。
[0019] 进一步的，步骤（7)所述数据分析方法为：所有原始数据先用Proteinchip Software3.2.1做总离子强度及分子量校正，使其达到均一;对位于2000~25000m/z峰值， 用Biomarker Wizard软件过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，以10 %为 最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，T检验比较慢性肾小球肾炎组和正常对照组唾液 蛋白质质谱数据（由Biomarker Wizard3.0软件完成），找出2组之间表达差异有统计学意义 的蛋白质峰。
[0020] 进一步的，步骤(7)中，设置P<0.01，所述慢性肾小球肾炎组和正常对照组之间具 有统计学意义的差异表达蛋白质峰有224个，其中11个差异显著的代表性蛋白质峰如下：
[0022]与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
[0023] 1)本发明液态芯片结合MALDI -T0F-MS技术对慢性肾小球肾炎患者与正常对照组 的睡液蛋白质进行表达谱检测，从唾液蛋白质组初步筛选出可用于慢性肾小球肾炎病证结 合诊断的具有特异性的生物标记物，探索并建立了相关病证结合的诊断模型。
[0024] 2)本发明筛选出224个具有统计学意义(P<0.05)的差异蛋白峰，选择质荷比(m/ z)为7101.90Da和2616.91Da两个蛋白质峰进行建模，识别率为93.02%，预测能力91.11 %。 临床回代检验结果表明，该诊断模型的准确率为80.68% (71/88)，灵敏度为81.40% (35/ 43)，特异度为80.00% (36/45)。说明该模型对慢性肾小球肾炎的诊断效率优良，灵敏度高、 特异性强。
[0025] 3)本发明的方法与传统的疾病生物标志物相关的检测方法相比较，具有无创伤 性、操作简便、快捷、敏感性及特异性高等特点，其筛选出的生物标志物对于准确快速地疾 病诊断、证候鉴别、预后判断均具有重要的临床意义。
[0026] 4)本发明的研究结果已显示出良好的应用前景，值得进一步深入研究并在临床推 广转化。
[0027] 当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【附图说明】
[0028] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0029] 图1为本发明实施例中慢性肾小球肾炎组与正常对照组蛋白质代表性图谱；
[0030] 图2为本发明实施例中7101.90和2616.91两个差异蛋白质峰机建立的诊断模型 图。
【具体实施方式】
[0031] 以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用 技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0032] 实施例
[0033] 1研究对象
[0034]本研究共采集88例唾液样本，其中45例正常对照者为健康体检正常者，其余均为 住院病人，经过肾脏组织病理检查确诊为慢性肾小球肾炎。
[0035] 2诊断标准
[0036]慢性肾小球肾炎的疾病诊断标准按照文献相关标准进行，均经肾脏组织病理检查 确诊。
[0037] 纳入标准:符合慢性肾小球肾炎诊断标准;无并发症;无肾功能不全。
[0038] 排除标准：排除口腔局部及唾液腺的炎症、肿瘤及先天性疾病；排除舍格伦综合 征、囊性纤维化病;排除其他系统严重并发疾病。
[0039] 3研究分组
[0040]慢性肾小球肾炎患者43例，男30例，女13例；正常对照者45例，男27例，女18例。纳 入病例基本资料。
[0041 ] 4实验方法
[0042] 4.1主要仪器和试剂
[0043] 弱阳离子交换型（WCX)纳米磁珠、Wash Buffer、Elution Buffer、U9裂解液及 MALDI-TIF-MS(蛋白指纹图谱仪I型），均为湖州赛尔迪生物医药科技有限公司产品;PBSII-c型蛋白质芯片阅读仪，为美国Ciphergen公司产品；高速台式低温离心机(Eppendorf公 司）；-80 °C 冰箱(Harris公司）；dH20(HPLC级）、CHCA为Sigma公司产品。
[0044] 4.2样品收集
[0045] 取材前一天晚上嘱患者临睡前清水漱口三次(漱口以后不再进任何食物和药物）， 第二天晨起后漱口前空腹取材，取材时间为清晨六点至八点。患者在前5min内的唾液自然 吞下，然后将无菌的唾液管棉球含入口中，时间约为10_20min，当口腔里棉球的唾液积聚至 一定量后，将棉球吐回50毫升经过预先冰浴预冷的具塞离心管内，每个临床病例共采集唾 液样品2-3毫升，并将每个装有唾液样本的离心管置于冰盒里，4°C低温保存。
[0046] 4.3样品处理
[0047] 收集的唾液全部在2h内置于转速3000r/min的4°C低温离心机离心10min，并按照 50yl/管分装于冻存管(EP管），置于-80°C冰箱冷冻保存备用。实验时取出标本，常温解冻。 [0048] 4.4纳米磁珠活化
[0049] ①取WCX纳米磁珠50yl加入到200yl的PCR管，在磁铁上孵育lmin(注意避免由于孵 育时间过长导致磁珠结块），去除上清液;②再加入l〇〇yl的Wash Buffer洗脱5min，在磁铁 上孵育lmin，去除上清液;③再往PCR管加入lOOyl的Wash Buffer洗脱5min，在磁铁上孵育 lmin，去除上清液，即重复步骤②一次。重复是为了洗脱更干净，去除杂质，最好洗脱2次，这 样质谱检测受到干扰的可能性会更少。
[0050] 4.5唾液样品洗脱上样
[0051 ] ①每个唾液样品取5yl，加10yl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185yl的Wash Buffer稀释（唾液最终上样量为2.5yl);②向含有活化磁珠的PCR管加入100yl处理好的唾 液样品（注意避免产生气泡），室温孵育30min，置于PCR管磁铁上孵育lmin，去除上清液;③ 再往PCR管加入100yl的Wash Buffer，洗脱5min，并置于PCR管磁铁上孵育lmin，去除上清 液;④重复步骤③一次，以洗脱更干净，去除杂质，获得较纯的目的蛋白。
[0052] 4.6纳米磁珠洗脱
[0053] 每个PCR管加入10yl的Elution Buffer，洗脱5min(不能少于5min)，放置于PCR管 磁铁上孵育lmin，取5yl上清液移至另一个PCR管中，并加入5yl的CHCA饱和溶液充分混匀， 吸取2iU混合溶液加样到Au芯片上，风干，然后上机读取芯片，收集数据。
[0054] 4.7数据收集
[0055]采用质谱仪读取芯片信息，设置激光强度为190,灵敏度为5,收集数据的质荷比范 围为2000~25000m/z，信号收集位置40~60,平均每点收集20次，收集总点为100次，每次试 验数据采集前，均用已知A11-in-one多肽标准芯片校正仪器，激光离子流为0.5。
[0056] 4.8生物信息学分析
[0057] 所有原始数据先用Proteinchip Software3.2.1做总离子强度及分子量校正，使 其达到均一;对位于2000~25000m/z峰值，用Biomarker Wizard软件过滤噪音。设置初始的 噪音过滤值为5,二次信噪比为2,以10%为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，T检验 比较慢性肾小球肾炎组和正常对照组唾液蛋白质质谱数据（由B i omarke r W i z ard 3.0软件 完成），找出2组之间表达差异有统计学意义的蛋白质峰；
[0058] 4.9建立诊断模型
[0059] 用Biomarker Pattern Software 5.0.2米用决策树算法计算出多个变量(m/z蛋 白质质谱峰)变化对两样本的判别价值，确定最佳的筛选模型，即诊断模型。
[0060] 5 结果
[00611 5.1各组年龄、性别的比较结果
[0062]表1西医疾病年龄、性别构成分析
[0064]表1显示:经统计学分析，各组性别与年龄分布均无显著性差异(P>0.05)。
[0065] 5.2慢性肾小球肾炎组与正常对照组比较结果
[0066]正常对照组与慢性肾小球肾炎组两组样本共88例，对所有的样本检测质谱图进行 分析比较，两个组共得到蛋白质峰为410个，其中224个统计差异显著的蛋白峰(P〈0.05)(见 表2)，选择质荷比（m/z)为7101.905和2616.913两个蛋白质峰进行建模（图2)，识别率为 93.02%，预测能力 91.11%。
[0067]表2正常对照对照组与慢性肾小球肾炎组的差异峰结果
[0069] 图1为慢性肾小球肾炎组与正常对照组蛋白质代表性图谱，图中纵坐标为峰强度 (蛋白相对含量），横坐标为蛋白质质荷比(m/z)。
[0070] 用Biomarker Pattern Software 5.0.2米用决策树算法计算出多个变量(m/z蛋 白质质谱峰）变化对两样本的判别价值，确定最佳的筛选模型（图2 )，最终选定m/z为 7101.905Da和2616.913Da两个蛋白质峰建立正常对照组与慢性肾小球肾炎组的判别模型， 该模型的灵敏度和特异度分别为81.40 % (35/43 )，特异度为80.00 % (36/45 )，见表3。
[0071] 如图2所示，当满足条件以下条件之一者:①m/z 7101.90彡0.41且m/z 2616.91彡 0.76,②m/z 7101.90彡0.91且m/z 2616.91>0.76,③m/z 7101.90>0.91且m/z 2616.91〉 5.06提示为肾炎组；当满足条件以下条件之一者：①m/z 2616.91彡0.76且m/z 7101.90〉 0.41且m/z 7101.90彡0.91，②m/z 2501.26彡14.31且m/z 4779.95彡8.82、m/z 3140.39> 3.09,③m/z 7101.90>0.9且m/z 2616.9K5.06提示为正常组。M:质谱峰相对强度。
[0072] 将正常对照组与慢性肾小球肾炎组进行临床回代检验，验证诊断模型准确率、灵 敏的和特异性，验证结果见表3。
[0073] 表3正常对照组与慢性肾小球肾炎组临床回代检验结果
[0075]如表3所示，临床回代检验结果表明，43例慢性肾小球肾炎患者中有35例被准确检 出为慢性肾小球肾炎，45例正常对照组中有36例被准确检出为非慢性肾小球肾炎。结果表 明，该诊断模型的准确率为80.68% (71/88)，灵敏度为81.40% (35/43)，特异度为80.00% (36/45)。说明该模型对慢性肾小球肾炎的诊断效率优良，灵敏度高、特异性强。
[0076]本发明运用液态芯片结合MALDI-T0F-MS技术对慢性肾小球肾炎患者与正常对照 组的睡液蛋白质进行表达谱检测，从唾液蛋白质组初步筛选出可用于慢性肾小球肾炎病证 结合诊断的具有特异性的生物标记物，探索并建立了相关病证结合的诊断模型。该方法与 传统的疾病生物标志物相关的检测方法相比较，具有无创伤性、操作简便、快捷、敏感性及 特异性高等特点，其筛选出的生物标志物对于准确快速地疾病诊断、证候鉴别、预后判断均 具有重要的临床意义。本发明的技术方案为慢性肾小球肾炎的早期诊断及症候鉴别开辟了 新的途径，同时为中医微观辨证学的研究和发展开启了新的思路和研究领域。
[0077]如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术 人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不 以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"为 一开放式用语，故应解释成"包含但不限定于"。"大致"是指在可接收的误差范围内，本领域 技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续 描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非 用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0078]还需要说明的是，术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的 包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确 列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情 况下，由语句"包括一个……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还 存在另外的相同要素。
[0079]上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明 并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、 修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识 进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发 明所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种慢性肾小球肾炎唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，包括 以下步骤： (1) 样品收集； (2) 样品预处理：收集的唾液样品在2h内置于转速3000r/min的4°C低温离心机离心 lOmin，并按照50μ1/管分装于冻存管，置于-80°C冰箱冷冻保存备用； (3) 纳米磁珠活化； (4) 唾液样品上样:④取5μ1唾液样品，加1 ΟμL的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μ 1的Wash Buffer稀释;⑤向含有活化纳米磁珠的PCR管加入100μΙ处理好的唾液样品，室温 孵育30min，置于磁铁上孵育Imin，去除上清液;⑥再往PCR管加入100μΙ的Wash Buffer，洗 脱5min，并置于磁铁上孵育Imin，去除上清液;⑦再重复步骤⑥一次，以洗脱更干净，获得较 纯的目的蛋白； (5) 纳米磁珠洗脱:每个PCR管加入10μ1的Elution Buffer，洗脱5min，放置于磁铁上孵 育lmin，取5μ1上清液移至另一个PCR管中，并加入5μ1的CHCA饱和溶液充分混匀，吸取2μ1混 合溶液加样到Au芯片上，风干，然后上机读取芯片，收集数据； (6) 数据采集； (7) 数据分析； (8) 建立诊断模型:采用决策树算法计算出多个变量变化对两样本的判别价值，确定诊 断模型。2. 如权利要求1所述的慢性肾小球肾炎唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，步骤(1)所述样品收集方法为:慢性肾小球肾炎组和正常对照组在取材前一天晚 上临睡前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天晨起后漱口前采用非刺激性 唾液采集方式空腹取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，收集到的唾液置于冰浴预 冷的50ml具塞离心管内，每个临床病例共采集唾液样品2-3毫升，将每个装有唾液样本的所 述离心管置于冰盒里，4°C保存。3. 如权利要求2所述的慢性肾小球肾炎唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，步骤(3)所述纳米磁珠活化方法为:①取WCX纳米磁珠50μ1加入到200μ1的PCR管， 在磁铁上孵育Imin，去除上清液;②再加入100μΙ的Wash Buffer洗脱5min，在磁铁上孵育 Imin，去除上清液;③重复步骤②一次。4. 如权利要求3所述的慢性肾小球肾炎唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，步骤(6)所述数据采集方法为:数据采集前，用多肽标准芯片校正仪器，激光离子 流为〇. 5;采用质谱仪读取芯片信息，设置激光强度为190，灵敏度为5，收集数据的质荷比范 围为2000~25000m/z，信号收集位置40~60,平均每点收集20次，收集总点为100次。5. 如权利要求4所述的慢性肾小球肾炎唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，步骤(7)所述数据分析方法为:所有原始数据先做总离子强度及分子量校正，使 其达到均一;对位于2000~25000m/z峰值，过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪 比为2,以10%为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，T检验比较慢性肾小球肾炎组和 正常对照组唾液蛋白质质谱数据，找出2组之间表达差异有统计学意义的蛋白质峰。6. 如权利要求5所述的慢性肾小球肾炎唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，所述步骤(7)中，设置P<0.01，所述慢性肾小球肾炎组和正常对照组之间具有统 计学意义的差异表达蛋白质峰有224个，其中11个具有显著差异的代表性蛋白质峰如下：
【文档编号】G01N27/62GK105891315SQ201610209716
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月6日
【发明人】吴正治, 曹美群, 孙珂焕, 黄飞娟, 袁媛
【申请人】深圳市老年医学研究所, 吴正治