一种检测或者鉴别羊绒和/或羊毛的方法
【专利摘要】本发明属于纤维检测领域，涉及一种鉴别羊绒和/或羊毛的方法，具体地，涉及一种基于质谱技术检测或者鉴别羊绒和/或羊毛的方法。本发明建立的基于质谱技术检测纤维蛋白质的鉴别羊绒和羊毛的方法特异性好、灵敏度高，能够应用于纺织行业蛋白质纤维的检测。本发明的方法简单易操作，鉴别时间短，一般在6小时左右，结果准确度高，能达到99.5％的准确度，该方法成本相比DNA法低很多。
【专利说明】
一种检测或者鉴别羊绒和/或羊毛的方法
技术领域
[0001] 本发明属于纤维检测领域，涉及一种鉴别羊绒和/或羊毛的方法，具体地，涉及一 种基于质谱技术检测或者鉴别羊绒和/或羊毛的方法。
【背景技术】
[0002] 羊绒是珍贵的特种动物纤维，由于受到动物生存环境的特殊要求的影响，使得羊 绒成为稀有纤维，其纺织品具有轻薄柔软、保暖性好、舒适贴身、美观高雅等优良性能，比细 羊毛的市场价格高出8-10倍。而今用羊毛掺杂假冒羊绒的不法行为日渐盛行，严重损害了 消费者的利益，所以运用科学的方法精准地鉴别羊绒和羊毛就显得意义重大。
[0003] 目前，依据纤维表面形态结构的不同进行判别，仍是鉴别动物纤维的主要手段，如 光学显微镜法等。这种方法主要依赖检验者的经验，主观性比较强。另外随着羊毛纤维剥 鳞、拉伸等先进技术的发展，根据纤维表面结构不同的光学显微镜法存在很大局限性。
[0004] DNA法亦是目前鉴别羊绒、羊毛纤维的一种可行方法。但羊绒和羊毛都属于蛋白质 纤维，基本组成都是角蛋白，毛干中只含有微量线粒体DNA，并且纤维存放时间较长易于使 DNA发生降解，毛绒经过加工处理也会使DNA受到很大破坏，这些都是毛绒DNA法鉴别面临 的难题。
[0005] 目前，尚需要开发新的高灵敏度和准确度的羊绒和/或羊毛的检测或者鉴别方 法，并发现能够用于羊绒和/或羊毛的检测或者鉴别特征标志物。
【发明内容】
[0006] 本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种检测或者鉴别羊绒和/或 羊毛的方法。本发明人惊奇地发现，本发明的方法特异性好、灵敏度高。本发明人还发现了 用于检测或者鉴别羊绒和/或羊毛的特征峰质荷比以及氨基酸序列。由此提供了下述发 明：
[0007] 本发明的一个方面涉及一种检测或者鉴别羊绒和/或羊毛的方法，包括将样品进 行质谱检测的步骤；具体地，为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测。
[0008] 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS)操作简单，敏感度高， 采用了被称为"软电离"的电离方式，能产生质荷比很大的稳定的分子离子，对分子量达到 30万道尔顿的分子能进行准确质谱分析，且误差率可精确到十万分之一，而且该方法需要 的的样品量很少，只需l-2pmol，而且非常快速，每一次质谱分析只需要数分钟。MALDI-T0F MS的基本原理是样品先与基质形成共结晶，当接受紫外激光照射时，因样品被包裹在基质 中，激光光束的能量优先被基质的发色团吸收，从而保护了样品。接着这些基质迅速蒸发为 气相，将样品分子带入气相。这时，受激的基质分子将质子转移给样品分子，使样品离子化， 形成带低电荷的碎片离子，然后在电场得以加速，这些形成的碎片离子直接进入飞行时间 质量分析仪，测量碎片离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。此飞行时间 同碎片离子的值成反比，即值越高，飞行时间越短，最终获得碎片离子的质量/电荷指纹图 谱。
[0009] 根据本发明任一项所述的方法，其中，扫描范围m/z为1900-2900和/或 2350-2750 和 / 或 2080-2250 ;优选地，为 1900-2900 和 / 或 2350-2750 ;更优选地，为 2350-2750。
[0010] 本发明人发现，MALDI-TOF MS鉴别羊绒、羊毛，扫描范围m/zl900-2900、 2350-2750、2080-2250,都有特征峰而且可以推测其氨基酸序列，得到特征蛋白质片段，对 羊绒、羊毛进行区分。其中扫描范围m/z 2350-2750,特征峰较多，此扫描范围最适合用来鉴 别羊绒、羊毛。
[0011] 根据本发明任一项所述的方法，其中，检测的特征峰m/z :为选自如下的任意1种、 2种、3种或4种：
[0012] 2691. 3、2637. 3、2466. 1 和 2664. 5。
[0013] 对本领域技术人员而言，在已知质荷比的情况下，完全能够推算出氨基酸相应的 序列，例如结合常用蛋白质数据库（如NCBI)的检索、酶切位点以及附图1-2所示的肽链指 纹谱图。也可委托本领域的技术服务机构。
[0014] 质谱用于鉴别羊绒特征峰位置：m/z :2691. 3、2637. 3、2466. 1，对应的氨基酸序列 分别是：
[0015] YSCQLNQVQSLIVNVESQLAEIR(SEQ ID N0 :1)、
[0016] YSCQLSQVQSLIVSVESQLAEIR(SEQ ID NO :2)、
[0017] YSSQLAQMQGLIGSGESQLAEIR(SEQ ID NO ：3)〇
[0018] 鉴别羊毛特征峰位置及其氨基酸序列：m/z :2664. 5,氨基酸序列：
[0019] YSCQLSQVQSLIVNVESQLAEIR(SEQ ID NO ：4)〇
[0020] 如果检测到上述特征峰m/z 2691. 3、2637. 3和2466. 1中的任意1个、2个或3个， 则证明样品中存在羊绒。反之，如果这3个特征峰均未检测到，则说明样品中不存在羊绒。
[0021] 如果检测到特征峰m/z :2664. 5,则证明样品中存在羊毛。反之，如果未检测到该 特征峰，则说明样品中不存在羊毛。
[0022] 如果检测到上述特征峰m/z 2691. 3、2637. 3和2466. 1中的任意1个、2个或3个， 同时还检测到特征峰m/z :2664. 5,说明样品中既存在羊绒，也存在羊毛。
[0023] 根据本发明任一项所述的方法，其中，在质谱检测之前，还包括对羊绒和/或羊毛 样品进行处理，得到粗角蛋白样品的步骤。
[0024] 根据本发明任一项所述的方法，其中，所述处理包括清洗、去羊毛脂和蛋白质提取 的步骤。
[0025] 所述清洗（洗毛）为用阴离子洗涤剂（十二烷基苯磺酸钠）加助剂（碳酸钠）洗 毛，并烘干。洗涤剂：5-10g/L，优选6g/L。助剂：3-7g/L，优选4g/L。35摄氏度将洗涤剂加 入水中，混合均匀后升温至60摄氏度，加入羊毛，搅拌并保持温度为60摄氏度，10分钟后加 入助剂，继续搅拌10分钟，自然冷却至室温，大量三重蒸馏水洗涤即可。
[0026] 所述去羊毛脂可以通过超声波清洗机进行。在本发明的一个实施方案中，使用超 声波清洗机，仅以清水清洗，功率400W，频率25kHz，时间2min/次，T = 50摄氏度，涮洗5 次，能较好脱去羊毛脂。
[0027] 所述蛋白质提取包括加入蛋白质溶胀剂、二硫键还原剂和巯基保护剂的步骤。具 体地，所述蛋白质溶胀剂为尿素；所述二硫键还原剂选自巯基乙醇，巯基乙酸和二 硫苏糖醇；所述巯基保护剂选自十二烷基硫酸钠、碘乙酰胺和鼠李糖醇。
[0028] 在本发明的一个实施方案中，浴比1 : (15-25)，5-8mol/L尿素、0? 1-0. 3mol/L的 碳酸氢铵、0. 5-1. 5mol/L的二硫苏糖醇溶液，35-40°C，处理20-40min ;再冷却至室温，再加 入碘乙酰胺 〇? 5-1. 5mol/L，20-40min〇
[0029] 在本发明的一个实施方案中，浴比1 : 20,7mol/L尿素、0. 2mol/L的碳酸氢铵、 lmol/L的二硫苏糖醇（DTT)溶液，37°C，处理30min ;再冷却至室温，再加入碘乙酰胺lmol/ L，30min〇
[0030] 根据本发明任一项所述的方法，其还包括对得到的粗角蛋白样品进行酶处理的步 骤；具体地，用胰蛋白酶处理。在本发明的一个实施方案中，胰蛋白酶2. 5mg/ml，37 °C，过 夜。优选地，还包括对酶处理产物进行透析和浓缩的步骤；具体地，所述透析通过使用分子 量为25000-65000的透析袋进行。
[0031] 用还原剂将角蛋白分子中的二硫键还原成巯基，得到可溶蛋白。还原剂一般为 巯基乙醇，巯基乙酸和二硫苏糖醇（DTT)等。还原得到的物质溶解性不大，需加入 蛋白质溶胀剂如尿素，它可拆开分子间氢键，减小分子间作用力，提高溶解度；同时还原得 到的巯基因性质活泼极易被氧化，所以优选地使用保护剂来保护，可采用十二烷基硫酸钠 (SDS)或碘乙酰胺或鼠李糖醇来保护巯基。还可用金属硫化物如硫化钠来做还原剂，使二硫 键断裂；也可用盐酸胍使肽链充分展开，官能团完全暴露，再使溶胀剂还原提取。此方法所 用试剂比较温和，对肽链破坏程度小，获得角蛋白平均分子量在25000-65000。
[0032] 胰蛋白酶取自动物胰脏，作用于碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其它氨基 酸的氨基所形成肽键。在本发明的一个实施方案中，酶处理角蛋白溶液工艺是：胰蛋白酶 2. 5mg/ml，37°C，过夜。
[0033] 本发明人在研究中发现，相对于常规的蛋白质提取方法，通过本发明的处理方法 得到的角蛋白样品的碎片少，分子量分布集中，更有利于质谱分析和鉴别。
[0034] 本发明还涉及一种基于质谱技术检测纤维蛋白质的鉴别羊绒和/或羊毛的方法， 所述方法包括：还原方法提取样品的角蛋白；对样品的角蛋白进行酶处理；用质谱仪对经 酶处理的角蛋白进行检测，得到样品的质谱指纹图谱；根据特征峰的蛋白质分子量和/或 其氨基酸序列鉴别羊绒和/或羊毛。
[0035] 本发明的另一方面涉及选自如下的任意1种、2种、3种或4种特征峰m/z在检测 或者鉴别羊绒和/或羊毛中的应用：
[0036] 2691. 3、2637. 3、2466. 1 和 2664. 5。
[0037] 本发明的再一方面涉及一种分离的蛋白质片段或多肽片段，其氨基酸序列选自如 下：
[0038] YSCQLNQVQSLIVNVESQLAEIR(SEQ ID N0 :1)、
[0039] YSCQLSQVQSLIVSVESQLAEIR(SEQ ID NO :2)、
[0040] YSSQLAQMQGLIGSGESQLAEIR(SEQ ID NO :3)、
[0041] YSCQLSQVQSLIVNVESQLAEIR(SEQ ID NO ：4) 〇
[0042] 本发明的再一方面涉及一种检测或者鉴别羊绒和/或羊毛的方法，包括检测本发 明中所述的任意1种、2种、3种或4种氨基酸序列的步骤。
[0043] 如果检测到上述SEQ ID NO : 1-3中的任意1个、2个或3个氨基酸序列，则证明样 品中存在羊绒。反之，如果这3个氨基酸序列均未检测到，则说明样品中不存在羊绒。
[0044] 如果检测到SEQ ID N0 :4,则证明样品中存在羊毛。反之，如果未检测到该氨基酸 序列，则说明样品中不存在羊毛。
[0045] 如果检测到上述SEQ ID N0 :1-3中的任意1个、2个或3个氨基酸序列，同时还检 测到SEQ ID N0 :4,说明样品中既存在羊绒，也存在羊毛。
[0046] 根据检测到的SEQ ID N0 :1-3中的任意1个、2个或3个氨基酸序列的含量，和/ 或SEQ ID N0 :4所示氨基酸序列的含量，还可以定量待测样品中羊绒和/或羊毛的含量。
[0047] 对本领域技术人员而言，上述蛋白质片段或多肽片段的氨基酸序列可以采用本领 域技术人员知悉的所有现有技术检测，例如抗体技术、氨基酸测序等等。所述抗体技术可以 将上述蛋白质片段或多肽片段作为抗原，制得单克隆或多克隆抗体。抗体的制备技术为免 疫学或生物学公知的技术。
[0048] 本发明的再一方面涉及一种抗体，其特异性结合本发明任一项所述的分离的蛋白 质片段或多肽片段；具体地，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
[0049] 本发明的再一方面涉及本发明中所述的任意1种、2种、3种或4种氨基酸序列在 检测或者鉴别羊绒和/或羊毛中的应用。
[0050] 本发明中，所述羊绒，具体地，为山羊绒。在本发明的一个实施方案中，所述山羊绒 为西藏山羊绒和/或土耳其山羊绒。在本发明的一个实施方案中，所述羊毛为陇南细羊毛 和/或陇南粗羊毛。
[0051] 发明的有益效果
[0052] 本发明建立的基于质谱技术检测纤维蛋白质的鉴别羊绒和羊毛的方法特异性好、 灵敏度高，能够应用于纺织行业蛋白质纤维的检测。
[0053] 本发明的方法简单易操作，鉴别时间短，一般在6小时左右，结果准确度高，能达 到99. 5%的准确度，该方法成本相比DNA法低很多。同时，本发明的方法准确度高于已有 的显微镜观察方法，具有应用于司法鉴定、各种纠纷的潜力，特别是当现有手段不足以鉴别 时，本发明的方法将大显身手。
【附图说明】
[0054] 图1 :质谱扫描范围m/zl900-2900下，羊绒和羊毛的肽链指纹谱图。
[0055] 图2 :质谱扫描范围m/z2350-2750下，羊绒和羊毛的肽链指纹谱图。
【具体实施方式】
[0056] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。
[0057] 实施例1 :角蛋白样品的制备
[0058] 1 ?试验材料
[0059] 陇南细羊毛、陇南粗羊毛，北京清河毛纺厂提供。
[0060] 西藏山羊绒、土耳其山羊绒，中国纤检局提供。
[0061] 将陇南细羊毛、陇南粗羊毛、西藏山羊绒、土耳其山羊绒编号，分别为羊毛1、羊毛 2、羊绒3、羊绒4。
[0062] 2?主要试剂
[0063] DTT、碘乙酰胺、胰蛋白酶均为优级纯，SIGMA-ALDRICH公司产品。
[0064] 尿素、碳酸氢铵均为分析纯，北京化工厂。
[0065] 3?主要仪器与设备
[0066] 电子天平、恒温水浴锅、超声波清洗器。
[0067] 4?实验方法
[0068] (1)洗毛
[0069] 用阴离子洗涤剂（十二烷基苯磺酸钠）加助剂（碳酸钠）洗毛，并烘干。
[0070] 洗涤剂：6g/L。
[0071] 助剂：4g/L。
[0072] 35摄氏度将洗涤剂加入水中，混合均匀后升温至60摄氏度，加入羊毛，搅拌并保 持温度为60摄氏度，10分钟后加入助剂，继续搅拌10分钟，自然冷却至室温，大量三重蒸馏 水洗涤即可。
[0073] (2)去羊毛脂
[0074] 超声波清洗机，不加洗剂和助剂，仅以清水清洗，功率400W，频率25kHz，时间 2min/次，T = 50摄氏度，涮洗5次，能较好脱去羊毛脂。
[0075] (3)溶解羊绒羊毛
[0076] 分别取经去羊毛脂的细羊毛（甘肃陇南），粗羊毛（甘肃陇南），羊绒（西藏），羊 绒（土耳其）样品各10mg，并编号为1、2、3、4号。
[0077] 配制8mol/L的尿素溶液和0. 2mol/L的碳酸氢铵溶液、lmol/L的二硫苏糖醇溶液， 以及lmol/L的碘乙酰胺溶液（半胱氨酸和组氨酸的烷基化试剂，保证蛋白质样品完全变性 并保持还原状，用于多肽测序以及酶抑制剂）。
[0078] 把1、2、3、4号样品分别按浴比1 : 20放于二硫苏糖醇/尿素/碳酸氢铵溶液中。 二硫苏糖醇、尿素、碳酸氢铵溶液在溶液中的浓度分别是lmol/L、8mol/L、0. 2mol/L。
[0079] 1、2、3、4号样品分别置于恒温水浴，37度，30min-lh
[0080] I 冷却
[0081] 丨分别加入lmol/L碘乙酰胺溶液
[0082] 丨恒温 30min
[0083] 丨分别加入胰蛋白酶25mg
[0084] 丨恒温37度，过夜
[0085] 第二天得到4份粗角蛋白溶液，经过过滤，透析（分子量为25000-65000的透析 袋）和浓缩得到角蛋白溶液。
[0086] 用于下面的实施例2。
[0087] 实施例2 :供试材料中羊绒、羊毛的基于质谱抟术检测纤维蛋白质鉴别
[0088] 1 ?实验样品
[0089] 实施例制备的陇南细羊毛、陇南粗羊毛、西藏山羊绒、土耳其山羊绒的角蛋白溶 液，编号分别是羊毛1、羊毛2、羊绒3、羊绒4。
[0090] 2?实验仪器
[0091] AXIMA Performance MALDI-TOF MS (日本岛津公司）。
[0092] 3?实验方法和参数
[0093] (1)将提取的不同毛绒角蛋白溶液，经过胰蛋白酶处理。
[0094] (2)通过质谱选择不同扫描范围m/z 1900-2900、2350-2750条件下进行检测。
[0095] 4?实验结果
[0096] 得到羊绒和羊毛的肽链指纹谱图，如图1、图2。
[0097] 由图1-2可见，两种羊绒在m/z :2691. 3、2637. 3、2466. 1，都有特征峰可以进行鉴 另IJ ;两种羊毛在m/z :2664. 5,都有特征峰可以进行鉴别。
[0098] 尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
【主权项】
1. 一种检测或者鉴别羊绒和/或羊毛的方法，包括将样品进行质谱检测的步骤；具体 地，为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，扫描范围m/z为1900-2900和/或2350-2750和 / 或 2080-2250 ;优选地，为 1900-2900 和 / 或 2350-2750 ;更优选地，为 2350-2750。3. 根据权利要求1所述的方法，其中，检测的特征峰m/z :为选自如下的任意1种、2种、 3种或4种： 2691. 3、2637. 3、2466. 1 和 2664. 5。4. 根据权利要求1所述的方法，其中，在质谱检测之前，还包括对羊绒和/或羊毛样品 进行处理，得到粗角蛋白样品的步骤。5. 根据权利要求5所述的方法，其中，所述处理包括清洗、去羊毛脂和蛋白质提取的步 骤；具体地，所述蛋白质提取包括加入蛋白质溶胀剂、二硫键还原剂和巯基保护剂的步骤。6. 根据权利要求5所述的方法，其还包括对得到的粗角蛋白样品进行酶处理的步骤； 具体地，用胰蛋白酶处理；优选地，还包括对酶处理产物进行透析和浓缩的步骤；具体地， 所述透析通过使用分子量为25000-65000的透析袋进行。7. 选自如下的任意1种、2种、3种或4种特征峰m/z在检测或者鉴别羊绒和/或羊毛 中的应用： 2691. 3、2637. 3、2466. 1 和 2664. 5。8. -种分离的蛋白质片段，其氨基酸序列选自如下： YSCQLNQVQSLIVNVESQLAEIR、 YSCQLSQVQSLIVSVESQLAEIR、 YSSQLAQMQGLIGSGESQLAEIR、 YSCQLSQVQSLIVNVESQLAEIR。9. 一种检测或者鉴别羊绒和/或羊毛的方法，包括检测权利要求8中所述的任意1种、 2种、3种或4种氨基酸序列的步骤。10. 权利要求8中所述的任意1种、2种、3种或4种氨基酸序列在检测或者鉴别羊绒和 /或羊毛中的应用。
【文档编号】G01N27/64GK105891319SQ201410670874
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月20日
【发明人】龚*
【申请人】龚*