一种舒洛地特组分精细结构分析检测方法

文档序号:10532942阅读:694来源:国知局
一种舒洛地特组分精细结构分析检测方法
【专利摘要】本发明公布了一种舒洛地特组分精细结构检测方法,包括:(1)肝素组分结构解析:硫酸软骨素ABC酶酶解硫酸皮肤素后进行肝素组分完整糖链分析,再经肝素酶I部分酶解后进行肝素糖链分析,或经肝素酶I、II、III全酶解后进行肝素二糖分析;(2)肝素组分特征基团结构解析:肝素酶I酶解肝素后经P10柱进行寡糖分离收集,然后用凝胶G25脱盐柱脱盐后用质谱进行肝素特征基团结构解析;(3)硫酸皮肤素组分结构解析:用亚硝酸钠降解肝素组分后,再用硫酸软骨素ABC酶酶解硫酸皮肤素,进行硫酸皮肤素二糖分析。本发明分析准确、重现性好,可改进现有理化检测分析手段的不足。
【专利说明】
一种舒洛地特组分精细结构分析检测方法 一.
技术领域
[0001] 本发明涉及一种多组分产品舒洛地特各组分精细结构分析方法,属于多组分生化 原料药分析技术领域。 二.
【背景技术】
[0002] 舒洛地特是一种新型天然糖胺聚糖,从猪肠黏膜提取精制。含有两个主成分,其作 用原理不同而协同增效,具有抗凝、溶栓、抗心血管疾病、降血脂、保护肾脏、治疗糖尿病并 发症等作用。与同类药肝素相比,舒洛地特可口服,生物利用度高,副作用小,具有更长的半 衰期以及较低的凝血作用和出血参数,因而近年来备受关注,国内许多厂家也处于积极的 研发仿制阶段。
[0003] 糖胺聚糖为长链不分支的杂多糖,具有羧基与硫酸酯基,其基本单位是由己糖醛 酸和氨基己糖组成的二糖,再重复聚合为糖胺聚糖。舒洛地特主要由肝素钠和硫酸皮肤素 两种糖胺聚糖组分组成。由于糖胺聚糖具有多分散性、结构不均一性、硫酸化程度不一致 性、残基数量多变性、糖链长度不同等特点使得糖胺聚糖的结构解析非常复杂。糖胺聚糖自 身组成复杂,舒洛地特为两种糖胺聚糖的混合物,且其中的肝素组分经过了一系列的加工 处理,使得舒洛地特的结构更加错综复杂,为舒洛地特的结构分析及其仿制药的研制开发 带来了巨大挑战。
[0004] 目前报道的舒洛地特各组分检测方法主要为琼脂糖凝胶电泳法,此方法为理化检 测法,精密度不够理想,无法通过此方法确定舒洛地特具体的组分及精细结构。 三.

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于改进现有分析技术手段的不足,从而提供一种较为先进的舒洛 地特组分精细结构的分析方法,采用高效液相色谱及质谱的检测方法进行。本发明具有分 析准确,重现性好的特点。
[0006] 本发明的目的可以通过下述技术方案实现:1)针对舒洛地特含有肝素和硫酸皮 肤素两种组分,首先选择性的降解其中一种组分,使其转化为单一组分,然后通过多种手段 对该单一组分进行详细解析,从而确定其精细结构。2),肝素组分解析:用硫酸软骨素ABC 酶降解硫酸皮肤素,对肝素组分进行结构解析,包括完整糖链分析(见附图1)、肝素酶I部 分酶解后糖链分析(见附图2)、肝素酶I、II、III全酶解后二糖分析(见附图3)。肝素组 分特征基团解析步骤如下:首先用肝素酶I适度降解肝素组分,再用Bio-Gel P10自装凝胶 柱进行寡糖分离并依次收集各组分(见附图4),最后用交联葡聚糖凝胶G25自装脱盐柱分 别脱盐后(见附图5),用质谱对各组分精细结构进行解析(见附图6)。硫酸皮肤素组分解 析:先用亚硝酸钠降解肝素组分,然后用硫酸软骨素ABC酶酶解硫酸皮肤素,进行硫酸皮 肤素二糖分析(见附图7)。
[0007] 本发明的测定方法如下步骤所示:
[0008] 1. 1硫酸软骨素ABC酶酶解步骤
[0009] 100 y 1样品+100 y 1软骨素ABC酶+800 y 1 Tris,混匀,置于37°C水浴中反应4h, 灭活,过滤后进样。
[0010] 1. 2酶解后肝素组分完整糖链分析条件
[0011] 色谱柱:TSK 3000SWxl (7. 8mm*30cm)
[0012] 流动相:0.77%乙酸铵+0.02%叠氮钠
[0013] 流速:0? 4ml/min
[0014] 柱温:3(TC
[00彳5] 进样体积:20yl
[0016] 检测器:示差折光检测器
[0017] 1. 3肝素酶I部分酶解步骤
[0018] 20 y 1样品+70 y 1乙酸钙溶液(pH = 7. 0) +100 y 1肝素酶I溶液(pH 7. 0磷酸二 氢钠溶液溶解),混匀,置于25°C水浴中反应24h,灭活,过滤后进样。
[0019] 部分酶解糖链分析条件
[0020] 色谱柱:Waters Spherisorb S5 SAX (4. 0*250mm)
[0021] 流动相:A-NaH2P04(0 . 04% ) ;BNaH2P04(0 . 04% )+NaC104(14% )
[0022] 流速:0? 45ml/min
[0023] 柱温:35°C
[0024] 进样体积:10 yl
[0025] 检测器:紫外检测器
[0026] 波长:234nm [0027] 流动相梯度如下:
[0028]
[0029] 1. 4肝素酶I、II、III完全酶解步骤
[0030] 20 y 1样品+70 y 1乙酸钙溶液(pH = 7. 0)+100 y 1肝素酶I、II、III混合溶液 (pH 7. 0磷酸二氢钠溶液溶解),混匀,置于25 °C水浴中反应48h,灭活,过滤后进样。
[0031] 肝素基本二糖单位分析条件同1. 3部分酶解糖链分析条件
[0032] 1. 5部分酶解步骤同1. 3肝素酶I部分酶解步骤
[0033] 1.6Bio_Gel P10自装凝胶柱分离寡糖条件
[0034] 色谱柱:Bio_Gel P10自装凝胶柱
[0035] 流动相:1. Omol. L 1氯化钠
[0036] 流速:0? 4ml/min
[0037] 进样体积:lml
[0038] 检测器:紫外检测器
[0039] 波长:232nm
[0040] 1. 7交联葡聚糖凝胶G25自装脱盐柱脱盐条件
[0041] 色谱柱:交联葡聚糖凝胶G25自装脱盐柱
[0042] 流动相:超纯水
[0043] 流速:0? 9ml/min
[0044] 进样体积:lml
[0045] 检测器:紫外检测器
[0046] 波长:215nm
[0047] 1. 8质谱解析条件
[0048] 色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C 18(5 ym,0. 5 X 250mm)毛细柱
[0049] 流动相 A :15mmol. L 1 三丁胺水溶液(pH = 7. 0)
[0050] 流动相 B :15mmol. L 1 三丁胺,75% 乙腈溶液(pH = 7. 0);
[0051] 流速:10lil/min
[0052] 洗脱梯度:0 ~5min,20% B ;5 ~65min,20 ~60% B。
[0053] 质谱条件为:喷雾电压:+3. 6kV ;喷雾气流速:0. 5L/min ;扫描质量范围:900~ 3000 〇
[0054] 2. 1亚硝酸钠降解步骤
[0055] 取样品溶液500 y 1,加lmol. L 1盐酸溶液250 y 1混合,加入250mg/ml的亚硝酸 钠溶液50 y 1,
[0056] 轻轻混匀,并在室温放置40min,加入lmol. L 1氢氧化钠溶液200 y 1终止反应。
[0057] 2. 2DS二糖单位分析条件
[0058] 色谱柱:Waters Spherisorb S5 SAX (4. 0*250mm)
[0059] 流动相:A---超纯水(盐酸调pH至3. 5) ;B---lmol. L 1氯化钠(盐酸调pH至3. 5)
[0060] 流速:1.0ml/min 柱温:35°C进样体积:20 y 1
[0061] 检测器:紫外检测器波长:240nm流动相梯度如下:
[0062] 四.【附图说明】 图1 :舒洛地特肝素组分完整糖链色谱图 图2 :舒洛地特肝素组分部分酶解糖链色谱图 图3 :舒洛地特肝素组分全酶解二糖色谱图 图4 :舒洛地特肝素组分部分酶解P10分析寡糖色谱图 图5 :舒洛地特肝素寡糖脱盐色谱图 图6 :舒洛地特肝素寡糖总离子流色谱图 图7 :舒洛地特硫酸皮肤素组分全酶解二糖色谱图。
【主权项】
1. 一种进行舒洛地特组分精细结构确定的分析方法,包含对硫酸皮肤素及肝素组分的 酶解、分离,最后采用高效液相色谱或液质联用检测方法进行肝素组分及硫酸皮肤素组分 结构分析,其特征在于: 肝素组分结构分析:先用硫酸软骨素 ABC酶对硫酸皮肤素组分进行特异性酶解得到肝 素组分,其次用肝素酶I进行部分酶解,得到肝素寡糖及部分二糖;或用肝素酶I、II、III进 行完全酶解得到二糖后进行肝素组分结构分析; 肝素组分特征基团结构解析:首先用肝素酶I轻度降解肝素组分,再用Bio-Gel PlO自 装凝胶柱进行寡糖分离并依次收集各组分,最后用交联葡聚糖凝胶G25自装脱盐柱分别脱 盐后,用质谱对肝素各组分精细结构进行解析; 硫酸皮肤素组分解析:先用亚硝酸钠降解肝素,得到硫酸皮肤素组分,然后用硫酸软骨 素 ABC酶酶解硫酸皮肤素,进行其二糖结构分析。2. 根据权利要求1所述的一种舒洛地特组分精细结构确定的分析方法,其特征在于: (1) 前处理方式:硫酸软骨素 ABC酶酶解硫酸皮肤素组分,酶解温度37°C,酶解时间为 4h ;肝素酶部分酶解(单独用肝素酶I或III酶解)的酶解温度为25°C,酶解时间为24h ; 肝素酶全酶解(肝素酶I、II、III混合酶解)的酶解温度为25°C,酶解时间为48h ; 亚硝酸钠降解肝素组分:取浓度为l〇mg/ml的样品溶液500 μ 1,加 lmol. L 1盐酸溶液 250 μ 1混合,加入250mg/ml的亚硝酸钠溶液50 μ 1,轻轻混勾,并在室温放置40min,加入 lmol. L 1氢氧化钠溶液200 μ 1终止反应; (2) Bi〇-Gel PlO自装凝胶柱分离寡糖条件:色谱柱=Bio-Gel PlO自装凝胶柱;流动 相:1. Omol. L 1氯化钠溶液;流速:0. 4ml/min ;进样体积:1ml ;检测器:紫外检测器;检测波 长:232nm ; (3) 交联葡聚糖凝胶G25自装脱盐柱脱盐条件:色谱柱:交联葡聚糖凝胶G25自装脱 盐柱;流动相:超纯水;流速:〇. 9ml/min ;进样体积:1ml ;检测器:紫外检测器;检测波长: 215nm〇3. 根据权利要求1所述的一种舒洛地特组分精细结构确定的分析方法,其特征在于: 酶解后肝素组分结构分析高效液相色谱检测条件: (1) 完整糖链分析检测条件:色谱柱为TSK 3000SWxl (7. 8mm*30cm);流动相为0. 77% 乙酸铵溶液(含〇.〇2%叠氮钠溶液);流速为0.41]11/1]1丨11;柱温为30°(: ;进样体积为20以1; 检测器为示差折光检测器;检测依据为以酶解标样的保留时间为定性依据来检测待测样品 的酶解产物; (2) 肝素酶I部分酶解后糖链分析检测条件:色谱柱为Waters Spherisorb S5SAX (4. 0*250mm);流动相 A 为 0. 04% 的 NaH2PO4溶液,流动相 B 为 0. 04% 的 NaH 2P04-14% 的NaClO4溶液;流速为0. 45ml/min ;柱温为35°C;进样体积为10 μ 1 ;检测器为紫外检测器, 检测波长为234nm ;采用梯度洗脱方式; (3) 肝素酶I、II、III全酶解后二糖分析检测条件同(3)-②检测条件。4. 根据权利要求1所述的一种舒洛地特组分精细结构确定的分析方法,其特征在于: 肝素组分特征基团结构质谱解析条件:色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18 (5 μπι, 0· 5X250mm)毛细柱;流动相A :15mmol. L 1三丁胺水溶液(pH = 7· 0),流动相B :15mmol. 1^三丁胺,75%乙腈溶液(?!1 = 7.0);流速:1(^1/1^11;洗脱梯度:0~51^11,20%8;5~ 65min,20~60% B ;质谱条件为:喷雾电压:+3. 6kV ;喷雾气流速:0. 5L/min ;扫描质量范 围:900 ~3000。5.根据权利要求1所述的一种舒洛地特组分精细结构确定的分析方法,其特 征在于:硫酸皮肤素二糖结构高效液相色谱检测条件:色谱柱:Waters Spherisorb 353厶乂(4.0*250臟);流动相4:超纯水(盐酸调?!1至3.5),流动相8:1臟〇1丄 1氯化钠(盐 酸调pH至3. 5);流速:1.0ml/min ;柱温:35°C ;进样体积:20 μ 1 ;检测器:紫外检测器;检 测波长:240nm ;采用梯度洗脱方式。
【文档编号】G01N30/02GK105891343SQ201410758914
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月6日
【发明人】田立华, 曹红光, 李颖颖, 王建强, 苗伟, 赵永强, 阎冬明, 祁静
【申请人】烟台东诚药业集团股份有限公司
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