一种胶束电动毛细管电泳法测定γ-氨基丁酸含量的方法
【专利摘要】本发明涉及一种胶束电动毛细管电泳法测定γ?氨基丁酸含量的方法，属于色谱分析技术领域，包括有如下步骤：(1)石英毛细管柱的选择及预处理：(2)电泳分析条件：(3)绘制γ?氨基丁酸标准曲线：(4)样品衍生：(5)γ?氨基丁酸的定量分析：与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明的有益效果：本发明采用了毛细管胶束电泳法胶束电动毛细管电泳(MECC)，加入十二烷基磺酸(SDS)及β?环糊精作为胶束，并加入有机改性异丙醇试剂，使γ?氨基丁酸快速与其他游离氨基酸得到快速简单高效分离，并可以在30min时间内检测出γ?氨基丁酸。
【专利说明】
一种胶束电动毛细管电泳法测定丫 -氨基丁酸含量的方法
技术领域
[0001] 本发明属于色谱分析技术领域，尤其涉及一种胶束电动毛细管电泳法测定Y -氨 基丁酸含量的方法。
【背景技术】
[0002] y_氨基丁酸是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，它是一种天然存在的 非蛋白组成氨基酸，具有极其重要的生理功能，它能促进脑的活化性，健脑益智，抗癫痫，促 进睡眠，美容润肤，延缓脑衰老机能，能补充人体抑制性神经递质，具有良好的降血压功效。 促进肾机能改善和保护作用。抑制脂肪肝及肥胖症，活化肝功能。每日补充微量的Y _氨基 丁酸有利于心脑血压的缓解，又能促进人体内氨基酸代谢的平衡，调节免疫功能。
[0003] y-氨基丁酸属强神经抑制性氨基酸，具有镇静、催眠、抗惊厥、降血压的生理作 用。它是抑制性神经递质（Inhibitory Neurotransmitter)，可以抑制动物的活动，减少能 量的消耗。T -氨基丁酸作用于动物细胞中的GABA受体，GABA受体是一个氯离子通道，GABA 的抑制性或兴奋性是依赖于细胞膜内外的氯离子浓度的，GABA受体被激活后，导致氯离子 通道开放，能增加细胞膜对氯离子通透性，使氯离子流入神经细胞内，引起细胞膜超极化， 抑制神经细胞元激动，从而减少动物的运动量。它是通过减少动物的无意识运动，来减少能 量消耗，从而达到促生长的目的。y-氨基丁酸能促进动物胃液和生长激素的分泌，从而提 高生长速度和采食量;能兴奋动物的采食中枢，从而增加采食量。
[0004] y-氨基丁酸(GABA)是一种非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统内重要的 氨基酸类神经递质，具有促进脑细胞代谢、改善肝脏、肾脏功能、促进乙醇代谢、降血脂和防 止肥胖等作用。y-氨基丁酸的测定方法大多采用纸层析法、比色法、高效液相色谱法 (HPLC)，但是否还有其它的定量检测方法适用于y -氨基丁酸的定量检测还有待研究。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种利用胶束电动 毛细管电泳法对Y _氨基丁酸的定量检测方法，该方法不仅能够使Y _氨基丁酸快速地与其 他游离氨基酸得到快速简单高效的分离而且还可以同时对其他游离氨基酸进行定性定量。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该胶束电动毛细管电泳法测定 y -氨基丁酸含量的方法，其特征在于:包括有如下步骤：
[0007] (1)石英毛细管柱的选择及预处理：
[0008] (2)电泳分析条件：
[0009] (3)绘制y -氨基丁酸标准曲线：以y -氨基丁酸标准样品的浓度和峰面积为坐标 绘制y-氨基丁酸标准曲线；
[0010] ⑷样品衍生：
[0011] (5) y-氨基丁酸的定量分析，其特征在于:所述步骤(2)中的电泳分析条件中：缓 冲液 pH=8 ? 0~10、60~801111]1〇1/]^硼砂-40~601]11]1〇1/]^十二烷基硫酸钠-20~301]11]1〇1/1^-环 糊精-质量浓度为1 %~5 %的异丙醇的混合物，缓冲液预冲洗lOmin，进样方式为0.3~ 0.6psi压力进样，进样时间4~7s，正向电压为10~25kv，毛细管柱温20~30°C，检测波长为 214nm〇
[0012] 进一步地，所述步骤（1)中石英毛细管柱的选择及预处理:选用未涂层的50cmX75 Mi石英毛细管柱；所述石英毛细管柱先依次用甲醇冲洗lOmin，蒸馏水冲洗5min，lmol/ LNaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10-15min;每次进样前， 用蒸馏水及运行缓冲液先后冲洗2min;运行缓冲液及样品溶液均用0.22wii微孔针头过滤器 过滤；所述运行缓冲液为：pH=9.5、40mmol/L硼砂-50mmol/L十二烷基硫酸钠-3Ommol/L0-环糊精-体积浓度为3%的异丙醇的混合物。
[0013] 进一步地，所述步骤（2)中缓冲液为60mmol/L硼砂-60mmol/L十二烷基硫酸钠-20mmol/U3-环糊精-质量浓度为3 %的异丙醇的混合物。
[0014]进一步地，步骤(4)中样品衍生的衍生剂为20mmol/L芴甲氧羰酰氯，衍生方法为取 待处理样品lml加入等量的衍生剂，混匀，2min后加入lml正戊烷，混匀静置，分层后取下清。 [0015] 进一步地，步骤(5)中y-氨基丁酸的定量分析为:取待处理样品，经过步骤(4)的 衍化处理后，按照步骤(2)进样，获氨基丁酸吸收峰面积，便可根据步骤(3)的标准曲线 得到y -氨基丁酸对应的质量浓度，便可对样品中的y -氨基丁酸定量。
[0016] 进一步地，所述步骤(3)中所述y-氨基丁酸标准曲线是以y-氨基丁酸标准样品 的浓度和峰面积为坐标绘制y -氨基丁酸标准曲线，为y = 41142x+214664。
[0017] 进一步地，所述步骤(4)中衍生剂的配制方法为:准确称取芴甲氧羰酰氯0.5174g， 以乙晴为溶剂，定容至l〇〇ml。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有如下优点:本发明的有益效果:胶束电动毛细管电泳 (MECC)具有以下特点：1、电渗流呈扁平流型，大大减小了径向的速度梯度;2、毛细管柱的细 管径以其极高的散热效率减小了由高电场强度引起的热效应;3、SDS形成的胶束为动态结 构，传质速度很快;4、MECC与其他方法相比质量检测限极低，样品用量仅仅为nL级，试剂消 耗也很少;5、本发明采用了毛细管胶束电泳法胶束电动毛细管电泳(MECC)，加入十二烷基 磺酸(SDS)及环糊精作为胶束，并加入有机改性异丙醇试剂，使y-氨基丁酸快速与其他 游离氨基酸得到快速简单高效分离，并可以在30min时间内检测出Y-氨基丁酸。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明实施例1的毛细管电泳色谱(缓冲液为40mmol/L硼砂-20mmol/L十二 烷基硫酸钠-20_1〇1/〇3-环糊精-体积浓度为3%的异丙醇）；
[0020] 图2为本发明实施例1的毛细管电泳色谱(缓冲液为40mmol/L硼砂-40mmol/L十二 烷基硫酸钠-30_1〇1/〇3-环糊精-体积浓度为3%的异丙醇）；
[0021] 图3为本发明实施例1的毛细管电泳色谱(缓冲液为40mmol/L硼砂-60mmol/L十二 烷基硫酸钠-4〇!11111 〇1/1^-环糊精-体积浓度为3%的异丙醇）；
[0022]图4为本发明实施例1的毛细管电泳色谱(缓冲液为60mmol/L硼砂-20mmol/L十二 烷基硫酸钠-30_1〇1/〇3-环糊精-体积浓度为3%的异丙醇）；
[0023]图5为本发明实施例1的毛细管电泳色谱(缓冲液为60mmol/L硼砂-40mmol/L十二 烷基硫酸钠-4〇!11111〇1/1^-环糊精-体积浓度为3%的异丙醇）；
[0024]图6为本发明实施例1的毛细管电泳色谱(缓冲液为60mmol/L硼砂-60mmol/L十二 烷基硫酸钠-20_1〇1/〇3-环糊精-体积浓度为3%的异丙醇）；
[0025]图7为本发明实施例1的毛细管电泳色谱(缓冲液为60mmol/L硼砂-60mmol/L十二 烷基硫酸钠-20_1〇1/〇3-环糊精-体积浓度为3%的异丙醇）；
[0026]图8为本发明实施例1的毛细管电泳色谱(缓冲液为80mmol/L硼砂-40mmol/L十二 烷基硫酸钠-20_1〇1/〇3-环糊精-体积浓度为3%的异丙醇）；
[0027] 图9为本发明实施例2的氨基丁酸标准曲线。
【具体实施方式】
[0028] 以下通过结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
[0029] 实施例1
[0030] (1)缓冲体系的选择
[0031] 缓冲体系及浓度直接影响离子的迀移和分离。本发明考察了毛细管分离y -氨基 丁酸的各个缓冲体系的组分如表1，以确定最佳组分：
[0032] 表 1
[0035]通过结合图1~8所示，由于8号缓冲液呈乳状无法进行电泳，故略去图8,从图1上 看，1号体系分离出来的峰杂乱，且峰值过低，无法进行有效分离；从图2上看，2号体系在 lOmin出现多峰交错，且在16min有两峰无法完全分离；从图3上看，3号体系在12.5,14及 26min出现多峰交错;从图4上看，4号体系出峰过快，导致目标无法完全分离;从图5上看，5 号体系在lOmin左右有个别难以分离的峰;从图6上看，6号体系完全分离;从图7上看，7号体 系基本完成分离就在牛磺酸和缬氨酸有些许交错;从图8上看，8号体系峰较好，较为突出， 但其出峰太少估计部分氨基酸重叠。由此可见6号为最佳分离体系，并且本体系在硼砂浓度 60mmol/L，SDS浓度为60mmol/L，糊精浓度在20mmol/L之间都可得到分离。
[0036] (2)有机溶剂的选择
[0037]在MECC的分离中，有机溶剂的加入能改变引起电渗流的偶电层，使电渗流减小，扩 大流出窗口，使整个峰容量增加，并影响溶质在胶束和流动相之间的分配系数，提高分离效 率。如果不加有机溶剂，疏水溶质将和胶束几乎同一时间流出。我们选择甲醇、异丙醇、乙醇 不同有机溶剂加入缓冲体系中试验。（a)当不加有机溶剂时，有效成分响应值较低，噪音较 大。（C)加入乙醇，峰前沿较严重，而且峰型较宽。（d)加入甲醇时，前沿现象仍然存在，改观 并不明显。(b)加入异丙醇，峰对称性较好，而且有合适的响应值，故选择加入异丙醇。
[0038] (3)有机溶剂浓度的影响
[0039] 选择异丙醇浓度分别为1%，3%、5%试验，当加入异丙醇量超过5%时，检测失败； 加入异丙醇量为3%时分离效果较好，当加入异丙醇量为1%并为出现明显改观。
[0040] (4)pH值对迀移时间的影响
[0041] pH值能影响电动色谱中带电组分迀移的速度。我们选择硼砂缓冲体系为电泳缓冲 液，综合考虑了 pH为8.0,8.5,9.0,9.5,10检测其分离效果，发现pH在9.0及9.5时分离效果 较佳，其中以9.5分离效果最好。选择pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的磷酸-303缓冲溶液 测定样品的迀移时间。结果表明，当缓冲溶液的pH值较小时，分离时间较长;pH小于6.0时峰 型不好，前沿现象较严重；因为电渗受pH的限制，它的净胶束速度与pH有关，pH=5时，净胶 束速度接近于零；当pH〈5时，电渗很小，如果它小于胶束泳流的速度，则净流动方向将会发 生变化，pH=5左右，组分的迀移精度极差，因此通常不采用这种模式。缓冲溶液的pH值较大 时，分离时间较短，峰又出现拖尾;当缓冲溶液的pH值在9.5时，峰型较好，分离效果也较好。 因此，本发明将缓冲溶液的pH值控制在9.5。
[0042] (5)十二烷基硫酸钠(SDS)浓度的影响
[0043]在胶束毛细管电泳中，将离子型表面活性剂SDS加入到缓冲液中，当SDS浓度达到 一定值时，表面活性剂的单体就结合在一起，形成球体型的胶束。具有不同疏水性的中性粒 子与胶束的相互作用不同，从而达到分离。（疏水性强的作用力就大，留在胶束相中的时间 就长，因胶束相的绝对速度很小，因此组分的保留时间就长，反之，组分较多的停留在缓冲 液中按电渗的速度移动，保留时间较短。）当SDS浓度超过其临界胶束浓度时，则分子缔合形 成胶束，根据样品与SDS胶束作用程度不同达到分离的目的。在分离电压20kv，异丙醇3%， pH9.5，改变SDS浓度分别为20，40，60，80mmol/L。实验证明，SDS浓度在40-60mmol/l时分离 效果较佳，当浓度达到80mm 〇l/l时其极易结晶导致体系不稳定。
[0044] (6)电压的选择
[0045] 电压作为分离的动力，在分离中起着重要的作用，当缓冲液为60mmol/L硼砂-60mmol/L十二烷基硫酸钠-2Ommol/L0-环糊精-体积浓度为3 %的异丙醇的混合物，3 %异丙 醇，pH9.5时，考查样品在10、15、20、25kv电压下的分离情况，当电压大于25kv时，分离时间 缩短，分离度降低，且基线不稳定。电压低于15kv时，分离时间较长，实验中选择20kv最为理 想。
[0046] 实施例2
[0047] y-氨基丁酸标准曲线绘制:对O.Olg/mly-氨基丁酸标准品进行稀释并检测制作 其标准曲线并检验其精度与重现性，对浓度为0.2mg/ml连续进样3次测定，按毛细管电泳分 析条件的最优进样条件为:75wii的进样柱，缓冲液为60mmol/L的硼砂，缓冲液pH为9.5，加压 20kv的条件进样，以Y-氨基丁酸吸收峰面积(y)对应质量浓度(x)绘制得到标准曲线(如图 9)，由实验得其标准曲线为y = 0.000252X，在检测浓度为0.083~4.166ug/ml，呈线性关系， 所能检测出的最低浓度为〇. 〇8ug/ml。
[0048] 其中还计算了峰面积和保留时间的相对标准偏差RSD，考察该本方法的重复性和 测定精确度，积分面积RSD分别为0.91% ;保留时间的RSD分别为1.1%。说明该方法重复性 与精确度都较好。
[0049] 实施例3 [0050]样品检测
[0051]应用利用内标法检测三疣梭子蟹不同组织部位的GABA含量，发现GABA含量（如表 1)：
[0053]由上表1可以看出神经中的GABA含量极高，远高于其他部位，GABA具有神经调控供 能故其在神经中的含量最高。
【主权项】
1. 一种胶束电动毛细管电泳法测定γ -氨基丁酸含量的方法，包括有如下步骤： (1) 石英毛细管柱的选择及预处理： (2) 电泳分析条件： (3) 绘制γ-氨基丁酸标准曲线：以γ-氨基丁酸标准样品的浓度和峰面积为坐标绘制 γ-氨基丁酸标准曲线； (4) 样品衍生： (5) γ-氨基丁酸的定量分析，其特征在于:所述步骤(2)中的电泳分析条件中：缓冲液 ρΗ=8 · O~10、60~80臟〇1凡硼砂-40~601111]1〇1/1^十二烷基硫酸钠-20~301111]1〇1/1^-环糊精-质量浓度为1 %~5 %的异丙醇的混合物，缓冲液预冲洗IOmin，进样方式为0.3~0.6psi压 力进样，进样时间4~7s，正向电压为10~25kv，毛细管柱温20~30°C，检测波长为214nm。2. 根据权利要求1所述的胶束电动毛细管电泳法测定γ-氨基丁酸含量的方法，其特征 在于所述步骤（1)中石英毛细管柱的选择及预处理:选用未涂层的50cmX75ym石英毛细管 柱;所述石英毛细管柱先依次用甲醇冲洗IOmin，蒸馏水冲洗5min，lmol/L NaOH溶液冲洗 30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10-15min;每次进样前，用蒸馏水及运行 缓冲液先后冲洗2min;运行缓冲液及样品溶液均用0.22μπι微孔针头过滤器过滤;所述运行 缓冲液为:pH=9.5、40mmol/L硼砂_50mmol/L十二烷基硫酸钠-3Ommol/L0-环糊精-体积浓 度为3%的异丙醇的混合物。3. 根据权利要求1所述的胶束电动毛细管电泳法测定γ-氨基丁酸含量的方法，其特征 在于所述步骤(2)中缓冲液为60mmol/L硼砂-60mmol/L十二烷基硫酸钠-2Ommol/L0-环糊 精-质量浓度为3%的异丙醇的混合物。4. 根据权利要求1所述的胶束电动毛细管电泳法测定γ -氨基丁酸含量的方法，其特征 在于步骤(4)中样品衍生的衍生剂为20mmol/L芴甲氧羰酰氯，衍生方法为取待处理样品Iml 加入等量的衍生剂，混匀，2min后加入1ml正戊烷，混匀静置，分层后取下清。5. 根据权利要求1所述的胶束电动毛细管电泳法测定γ-氨基丁酸含量的方法，其特征 在于步骤(5)中γ-氨基丁酸的定量分析为：取待处理样品，经过步骤(4)的衍化处理后，按 照步骤(2)进样，获γ-氨基丁酸吸收峰面积，便可根据步骤(3)的标准曲线得到γ-氨基丁 酸对应的质量浓度，便可对样品中的γ -氨基丁酸定量。6. 根据权利要求1所述的胶束电动毛细管电泳法测定γ-氨基丁酸含量的方法，其特征 在于所述步骤(3)中所述γ -氨基丁酸标准曲线是以γ -氨基丁酸标准样品的浓度和峰面积 为坐标绘制γ -氨基丁酸标准曲线，为y = 41142x+214664。7. 根据权利要求4所述的胶束电动毛细管电泳法测定γ -氨基丁酸含量的方法，其特征 在于所述步骤(4)中衍生剂的配制方法为:准确称取芴甲氧羰酰氯0.5174g，以乙晴为溶剂， 定容至100ml。
【文档编号】G01N27/447GK105891347SQ201610156549
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月18日
【发明人】卢少坤, 王春琳, 李荣华, 母昌考, 宋微微
【申请人】宁波大学