抗生素类药物原料中毒性杂质dmap的检测方法
【专利摘要】本发明公开了抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方法，将抗生素类药物原料溶解稀释并离心后得到的上清液，通过高效液相色谱?四级杆串联线性离子肼质谱，从而检测出抗生素类药物原料毒性杂质DMAP的含量，所述高效液相色谱的流动相为乙酸铵水溶液和乙腈溶液的混合液，所述四级杆串联线性离子肼质谱对DMAP检测的母离子为质荷比(m/z)122.7、子离子为质荷比(m/z)107.1。本发明选用的该对离子对样品检测无干扰，且响应最高。选用该流动相可以增长目标化合物在色谱柱上的保留时间，使检测结果更稳定。本发明操作简单、结果可靠，可实现抗生素类药物原料中DMAP残留量的快速、低成本检测、检测灵敏度可达到0.50mg/kg。
【专利说明】
抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方法
技术领域
[0001]本发明属于分析测试领域，具体涉及抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方 法。
【背景技术】
[0002] 4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine，DMAP)，分子式如图1所示，是近年来 广泛用于化学合成的新型高效催化剂，可用于酰化，烷基化，醚化，酯化及酯交换等多种有 机合成反应的催化，对提高收率有极其明显的效果。国内化学制药行业已成功将其应用于 乙（丙)酰螺旋霉素、多尼培南、美罗培南等抗生素类原料药的生产中，改善了工艺条件，并 取得良好的经济和社会效益。但是，DMAP本身具有高毒性、刺激性，可损伤眼睛、皮肤、呼吸 系统、消化道、神经系统等，危害人体健康。我国药典中规定原料药中DMAP的限量为10.0 mg/ kg.因此，检测并控制抗生素类药物中DMAP的含量，对于保障抗生素类药物的使用安全性具 有至关重要的作用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于：提供抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方法，实现抗 生素类药物原料中DMAP残留量的快速、低成本检测。
[0004] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0005] 抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方法，将抗生素类药物原料溶解稀释并 离心后得到的上清液，通过高效液相色谱_四级杆串联线性离子肼质谱，从而检测出抗生素 类药物原料毒性杂质DMAP的含量，所述高效液相色谱的流动相为乙酸铵水溶液和乙腈溶液 的混合液，所述四级杆串联线性离子肼质谱对DMAP检测的母离子为质荷比(m/z)122.7、子 离子为质荷比(m/z) 107.1。
[0006] 本发明选用的该对离子对样品检测无干扰，且响应最高。选用该流动相可以增长 目标化合物在色谱柱上的保留时间，使检测结果更稳定。
[0007] 本发明操作简单、结果可靠，可实现抗生素类药物原料中DMAP残留量的快速、低成 本检测。同时，本方法的检测灵敏度可达到0.50mg/kg，且方法的精密度和回收率均能满足 DMAP的检测要求。
[0008] 优选的，所述高效液相色谱的色谱柱选用Thermo Syncronis HILIC(Thermo)，规 格为 2.1 X 150mm，5iim〇
[0009] 优选的，所述高效液相色谱的样品进样量为5 ± 0 . lyL，柱温为30 ± 1 °C，流速： 0?3mL/min〇
[0010] 优选的，抗生素类药物原料的稀释剂为水。
[0011] 优选的，所述乙酸铵水溶液的浓度为1 OmM，所述乙酸铵水溶液用乙酸调pH至4.0。 乙酸铵盐浓度和酸碱性(pH值）的调节，增加DMAP在色谱柱上的保留时间，以便能呈现出较 好的色谱峰型。
[0012] 优选的，乙酸铵水溶液和乙腈溶液的体积为3:7，所述流动相的进样量为5 ±0. ly L。在该流动相条件下，DMAP的保留时间适中，且色谱峰的稳定性较好。
[0013] 优选的，所述四级杆串联线性离子肼质谱的电离模式为正离子电喷雾(ESI + )，多 反应离子监测(MRM)模式。
[0014]优选的，所述四级杆串联线性离子肼质谱的设置参数为：
[0016]优选的，抗生素类药物原料的前处理方法为，精密称取抗生素类药物原料10.OOmg 至10mL容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度，摇匀后，精密转移lmL至离心管中12000r/ min离心10分钟后，取上清液进样5yL检测。
[0017]优选的，标准曲线的测定方法为，取DMAP标准品，用稀释剂精确配制一系列不同质 量浓度的标准溶液，浓度分别为〇 ? 50ng/mL、5 ? 00ng/mL、7 ? 50ng/mL、10 ? Ong/mL、15 ? Ong/mL、 20.0ng/mL，进样5yL检测；以目标化合物定量离子峰面积(Y)及被测DMAP的质量浓度(X)进 行线性回归，得到回归方程和相关系数，所述回归方程为Y= 1.75328e5X+2.16557e5，相关 系数为0.99829。
[0018] 本发明的有益效果为:本发明利用高效液相色谱-四级杆串联线性离子肼质谱，建 立了抗生素类原料药中DMAP残留量的检测方法。本方法的检测灵敏度可达到0.50mg/kg，且 方法的精密度和回收率均能满足DMAP的检测要求。本发明操作简单、结果可靠，可实现抗生 素类药物原料中DMAP残留量的快速、低成本检测。
【附图说明】
[0019] 图1为DMAP的分子式；
[0020] 图2为空白溶剂的质谱图；
[0021 ]图3为DMAP标准品的质谱图；
[0022] 图4为美罗培南原料药物的质谱图；
[0023] 图5为检测限浓度下DMAP的质谱检测图谱。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图对本发明作进一步说明。
[0025]仪器与试剂
[0026]使用的主要仪器有：U3000型液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司），AB SCIEX5500型四级杆串联线性离子肼质谱仪（QTRAP，美国AB SCIEX公司），Heraeus MultifugeXIR型高速冷冻离心机(美国赛默飞世尔科技有限公司），10-100yL移液器和100-1000此移液器(美国赛默飞世尔科技有限公司），pH计(瑞士梅特乐-托力多公司）。
[0027]使用的主要试剂有:色谱级甲醇(美国阿斯顿化学技术有限公司），色谱级甲酸(美 国R0E科技有限公司），色谱级乙腈(美国阿斯顿化学技术有限公司），分析纯乙酸铵（国药集 团化学试剂有限公司），分析纯乙酸（国药集团化学试剂有限公司），哇哈哈饮用纯净水(杭 州哇哈哈集团有限公司）。
[0028]液相色谱条件
[0029]色谱柱：Thermo Syncronis HILIC(Thermo)规格：2.1 X 150mm，5iim [0030]进样量：5yL 柱温：3(TC 流速:0.3mL/min
[0031] 流动相A: 10mM乙酸铵水溶液(用乙酸调pH至4.0)流动相B:乙腈溶液
[0032] 样品稀释剂:水
[0033] 流动相比例:A:B = 30:70进样量:5此。
[0034]质谱检测条件
[0035]电离模式:正离子电喷雾(ESI + )，多反应离子监测(MRM)模式，4-二甲氨基吡啶质 荷比(M/Z)分别为母离子122.7和子离子107.1的离子进行检测。具体质谱设置参数见下表 1〇
[0036]表1.质谱设定参数
[0039]样品前处理方法
[0040]精密称取原料药样品10.OOmg左右至lOmL容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度， 摇匀后，精密转移lmL至离心管中12000r/min离心10分钟后，取上清液进样5yL检测。
[0041 ] 专属性实验
[0042]空白溶剂:取稀释剂进样5此检测，质谱图如图2所示。
[0043] DMAP专属性溶液的配制（10ng/mL):精密量取浓度为1.00yg/mL的DMAP对照品贮备 液1. OmL，置于10mL容量瓶中，加稀释剂定容至刻度，摇匀，精密量取1. OmL，置于10mL容量瓶 中，用稀释剂定容至刻度，摇匀，即得DMAP专属性溶液。配制好的专属性溶液进样5yL检测， 质谱图如图3所示。
[0044] 原料药样品专属性溶液的配制:精密称取抗生素类代表药物美罗培南原料药样品 10.03mg，置于10mL容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度，摇匀后，精密转移lmL至离心管 中12000r/min离心10分钟后，取上清液进样5yL检测，质谱图如图4所示。
[0045] 精密度实验
[0046] 配制好的DMAP专属性溶液重复进样6次，考察检测方法的精密度，实验结果见表2。 [0047]表2.精密度实验结果
[0050]定量限及检测限
[00511用稀释剂逐步稀释DMAP专属性溶液，配置成浓度为0.5ng/mL的溶液作为DMAP的定 量限(L0Q)溶液;配置浓度为0.2ng/mL的溶液作为DMAP的检测限(L0D)溶液，并对定量限的 稳定性进行考察，具体实验结果见表3和图5。
[0052]表3. DMAP的检测限及定量限检测结果
[0054] 标准曲线的测定
[0055] 取DMAP标准品储备液，用稀释剂精确配制一系列不同质量浓度的标准溶液，浓度 分别为〇 ? 50ng/mL、5 ? 00ng/mL、7 ? 50ng/mL、10 ? Ong/mL、15 ? 0ng/mL、20 ? Ong/mL，进样5yL 检 测。以目标化合物定量离子峰面积(Y)及被测DMAP的质量浓度(X)进行线性回归，得到回归 方程和相关系数，结果见表4。
[0056] 表4. DMAP标准曲线检测结果
[0058]加标回收率
[0059]样品空白对照样品的配制：精密称定美罗培南样品3份各10.0 2 m g、10.01 m g、 10.01mg〇
[0060] LOQ浓度(0.50ng/mL)加标样品的配制：精密称定美罗培南样品各10.02、10.01、 lO.Olmg，置于10mL容量瓶中，用定量限溶液溶解并定容至刻度，摇匀，精密转移lmL至离心 管中，12000转/分钟离心10分钟后取上清液，作为样品溶液组1。
[0061 ]样品100 %限度(10.0ng/mL)加标样品的配制:精密称定美罗培南供试品各10.01、 10.01、 10.02mg，置于1 OmL容量瓶中，用100 %线性溶液溶解并定容至刻度，摇匀，精密转移 lmL至离心管中，12000转/分钟离心10分钟后取上清液，作为样品溶液组2。
[0062]样品150 %限度（15.0ng/mL)加标样品的配制:精密称定美罗培南供试品各10.02、 10.02、 10.Olmg，置于1 OmL容量瓶中，用150%线性溶液溶解并定容至刻度，摇匀，精密转移 lmL至离心管中，12000转/分钟离心10分钟后取上清液，作为样品溶液组3。
[0063]空白样品对照样品及样品组1、组2、组3各进样5此检测，记录DMAP的峰面积，计算 其测得量及加样回收率，具体实验结果见表5，检测回收率范围为86.36~100.70 %。
[0064]表5美罗培南中DMAP加标回收率的检测结果
[0066] 实际样品的检测结果
[0067] 精密称取抗生素类代表药物美罗培南、多尼培南及厄他培南钠原料药物各10.0 mg 左右，分别置10mL容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度，摇匀后，精密转移lmL至离心管中 12000r/min离心10分钟后，取上清液进样5yL。利用建立的方法测定这三种原料药中DMAP的 含量，具体检测结果见表6。
[0068] 表6实际原料药物中DMAP的含量检测结果
[0071] 结论
[0072] 本发明利用高效液相色谱-四级杆串联线性离子肼质谱，建立了抗生素类原料药 中DMAP残留量的检测方法。药典中规定原料药中DMAP的限量为10.0mg/kg，本方法的检测灵 敏度可达到0.50mg/kg，且方法的精密度和回收率均能满足DMAP的检测要求。本发明操作简 单、结果可靠，可实现抗生素类药物原料中DMAP残留量的快速、低成本检测。
[0073] 上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对发明保护范围 的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需 要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方法，其特征是，将抗生素类药物原料溶 解稀释并离心后得到的上清液，通过高效液相色谱-四级杆串联线性离子肼质谱，从而检测 出抗生素类药物原料毒性杂质DMP的含量，所述高效液相色谱的流动相为乙酸铵水溶液和 乙腈溶液的混合液，所述四级杆串联线性离子肼质谱对DMP检测的母离子为质荷比122.7、 子呙子为质荷比107.1。2. 如权利要求1所述的抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方法，其特征是，所述 高效液相色谱的色谱柱选用Thermo Syncronis HILIC，规格为2· IX 150mm，5ym。3. 如权利要求1所述的抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方法，其特征是，所述 高效液相色谱的样品进样量为5 ± 0.1 yL，柱温为30 ± 1°C，流速:0.3mL/min。4. 如权利要求1所述的抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方法，其特征是，抗生 素类药物原料的稀释剂为水。5. 如权利要求1所述的抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方法，其特征是，所述 乙酸铵水溶液的浓度为IOmM，所述乙酸铵水溶液用乙酸调pH至4.0。6. 如权利要求1所述的抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方法，其特征是，乙酸 铵水溶液和乙腈溶液的体积为3:7，所述流动相的进样量为5 ±0. lyL。7. 如权利要求1所述的抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方法，其特征是，所述 四级杆串联线性离子肼质谱的电离模式为正离子电喷雾，多反应离子监测模式。8. 如权利要求1所述的抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方法，其特征是，所述 四级杆串联线性离子肼质谱的设置参数为：9. 如权利要求1所述的抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方法，其特征是，抗生 素类药物原料的前处理方法为，精密称取抗生素类药物原料10.0 Omg至IOmL容量瓶中，用稀 释剂溶解并定容至刻度，摇匀后，精密转移ImL至离心管中12000r/min离心10分钟后，取上 清液进样5yL检测。10. 如权利要求1所述的抗生素类药物原料中毒性杂质DMAP的检测方法，其特征是，标 准曲线的测定方法为，取DMAP标准品，用稀释剂精确配制一系列不同质量浓度的标准溶液， 浓度分别为O · 50ng/mL、5 · 00ng/mL、7 · 50ng/mL、10 .Ong/mL、15 · 0ng/mL、20 · Ong/mL，进样 5yL 检测；以目标化合物定量离子峰面积Y及被测DMAP的质量浓度X进行线性回归，得到回归方 程和相关系数，所述回归方程为Y= 1.75328e5X+2.16557e5，相关系数为0.99829。
【文档编号】G01N30/02GK105891348SQ201610187483
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月29日
【发明人】王珊珊, 宁凡盛, 赵汝松, 苑金鹏, 陈跃
【申请人】山东省分析测试中心