一种同时检测中药注射剂中多种真菌毒素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种同时检测中药注射剂中多种真菌毒素的方法，通过样品干燥、提取、离心处理后上清液干燥、复溶、经固相萃取柱后进行淋洗、洗脱、收集洗脱液、干燥再进行复溶、过滤后进入液质联用仪进行定性或定量检测。本发明在银杏叶注射液、刺五加注射液、黄芪注射液、血塞通粉针等品种中验证了方法的线性、灵敏度、回收率、精密度及重现性，结果表明本发明检测方法的上述指标均良好。本发明方法为首次应用于中药注射剂中多种真菌毒素的检测与分析，具有快速、简便、适用性广等特点，对于控制中药注射剂的风险、提高患者的用药安全性具有重要的意义。
【专利说明】
一种同时检测中药注射剂中多种真菌毒素的方法
技术领域
[0001] 本发明属于中药检测领域，涉及一种同时检测中药注射剂中多种真菌毒素的方 法，具体涉及采用液相色谱串联质谱法测定中药注射剂中10种真菌毒素的方法，
【背景技术】
[0002] 中药注射剂作为传统医药理论与现代生产工艺相结合的产物，在心脑血管、肿瘤、 呼吸道等疾病治疗中一直发挥着极其重要的作用。从上世纪四十年代问世以来，中药注射 剂的生产工艺愈加规范科学，有效性也在使用中得到了验证和肯定，然而在近年来的临床 使用中，随着不良反应的日益暴露，其安全性已经成为业内目前最为关心的问题。
[0003] 目前我国仅对少数中药材中黄曲霉毒素进行了限量，我国《药用植物及制剂外经 贸绿色行业标准》中规定中成药及药材中黄曲霉毒素Bl<5iig ? kgH;2010年版中国药典规 定陈皮、僵蚕、胖大海、酸枣仁、桃仁五种药材需要检测黄曲霉毒素，规定黄曲霉毒素出不得 过5yg ? kg一S黄曲霉毒素出、82、61、62总量不得过10辟*1^一1。
[0004] 药材从生长、采集、贮存以及加工过程中均可能污染各种真菌并产生真菌毒素。中 药注射剂的生产原料大多为中药材及其提取物，一旦原材料受到真菌毒素的污染，常规的 方法一般无法将其彻底去除，往往会不可避免的污染注射剂成品。
[0005] 如果人们摄入的中药被真菌毒素污染，则非但不能达到防病治病的效果，反而可 能深受其害。虽然真菌毒素残留作为痕量外源性有毒有害物质一般不表现出急性毒性，但 通常有较强的蓄积性，致癌、致畸、致突变作用明显，并且由于使用中药的人大多患有疾病 或者体质虚弱，抵抗力不如健康人群，加之中药注射剂独特的给药方式，真菌毒素造成的危 害可能更为严重。
[0006] 由于中药注射剂往往基质复杂，且含有很多如表面活性剂等成型用辅料，加之真 菌毒素种类繁杂，含量通常为ng级，这样的特点要求检测方法必须灵敏度高，对多种毒素尽 可能同时做出分析，以节省时间、成本和提高结果的全面性、可靠性。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种同时检测中药注射剂中多种真菌毒素的方法，该方法 先对注射剂样品进行提取净化处理，然后采用液相色谱串联质谱法测定样品中多种真菌毒 素的含量。
[0008] 本发明通过以下步骤实现：
[0009] (1)取适量中药注射剂液体或固体样品，进行干燥;干燥方法为氮气吹干、冷冻干 燥或旋蒸中的任意一种；
[0010] (2)加入提取溶剂，进行提取;提取溶剂为80 %~100 %乙臆-水溶液(v/v )，提取方 式为振荡、祸旋、超声中的任意一种；
[0011] (3)提取后，进行离心处理，取部分上清液进行干燥；
[0012] (4)将干燥后的样品用纯水或低浓度有机溶剂的水溶液进行复溶;复溶用低浓度 有机溶剂为0.1%~5%乙腈-水溶液&八)或0.1%~20%甲醇-水溶液&八）；
[0013] (5)复溶液缓慢通过已活化好的固相萃取柱，然后用水或PBS溶液或低浓度有机溶 剂水溶液进行淋洗;固相萃取柱为Waters HLB多功能柱；
[0014] (6)以适量洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液;洗脱剂为甲醇、乙腈、酸化甲醇、酸化乙 腈中的任意一种；
[0015] (7)将洗脱液进行干燥，并用30%乙腈溶液溶解，过滤，进入液质联用仪进行定性 或定量检测;检测方法为同位素内标稀释法。
[0016] 所述的中药注射剂为银杏叶注射液、丹红注射液、银杏达莫注射液、参麦注射液、 丹参川芎嗪注射液、醒脑静注射液、血栓通注射液、川芎嗪注射液、疏血通注射液、康艾注射 液、参芪扶正注射液、香菇多糖注射液、艾迪注射液、炎琥宁注射液、痰热清注射液、喜炎平 注射液、血必静注射液、舒血宁注射液、刺五加注射液、黄芪注射液、双黄连注射液或血塞通 粉针。
[0017] 所述的真菌毒素是黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、 赭曲霉毒素A、霉酸酸、T2毒素、玉米赤霉稀酮、玉米赤霉稀醇、呕吐毒素。
[0018] 注射剂通常分为水针和粉针两种，成品的生产实际上是原药材的提取纯化过程， 然而，大量的有效成分、色素及药用辅料对于痕量的毒素测定来说，仍存在着严重的基质干 扰，大量预实验表明，直接稀释进样或稀释后通过固相萃取柱的方法，检测效果均不理想， 因此，本发明将干燥后的样品先进行提取，以期达到更好的净化效果。
[0019] 提取溶剂的选择尤为重要，适合提取溶剂的选择原则是，对有效成分等有着较小 溶解性的同时，对毒素有着良好的溶解性。通过对多种注射剂品种及真菌毒素的基质效应 及提取效率的考察，高浓度的乙腈溶液成为了理想的选择，加入后，能沉淀大部分杂质，显 著提高检测的灵敏度。
[0020] 在固相萃取柱的选择上，本发明比较了Romer Mycosep226和Waters HLB柱对多种 真菌毒素的回收效果，结果发现，Romer Mycosep226对0TA的回收率极低，而Waters HLB柱 对各毒素的回收率均较高，故最终选择Waters HLB柱。
[0021] 本发明方法中色谱分离采用反相色谱柱，比较了Waters BEH-C18色谱柱（100* 2.10mm，1.7mi)'Waters BEH-C8色谱柱（100*2.10mm，1.7wn)、Kinetex 1.7yXB-C18 100A柱 三种色谱柱，分离效果均良好。
[0022] 本发明分别在三台液质仪（日本SMMADZU LCMS-8030、日本SMMADZU LCMS-8050、 加拿大IONIC 3Q 120)上考察了通用性，结果表明，即使在灵敏度及抗干扰能力较差的 LCMS-8030液质仪上，方法学各指标也都能达到要求。
[0023]本发明在银杏叶注射液、刺五加注射液、黄芪注射液、血塞通粉针等品种中验证了 本发明方法的线性、灵敏度、回收率、精密度及重现性，结果表明本发明检测方法的上述指 标均良好。本发明方法为首次应用于中药注射剂中多种真菌毒素的检测与分析，具有快速、 简便、适用性广等特点，对于控制中药注射剂的风险、提高患者的用药安全性具有重要的意 义。
【附图说明】
[0024] 图1为混合对照品溶液的总离子流图，图中1 .G2，2 ? G1，3 ? B2，4 ? B1，5 ? 0TA，6 ? T2， 7.MPA，8.ZAN，9.ZEN，10.D0N〇
[0025] 图2为加标供试品溶液的总离子流图，图中1 ? G2，2 ? G1，3 ? B2，4 ? B1，5 ? OTA，6 ? T2， 7.MPA，8.ZAN，9.ZEN，10.D0N〇
[0026] 图3为供试品溶液的总离子流图。
【具体实施方式】
[0027] 本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0028] 实施例1
[0029] 1、实验仪器与试剂
[0030]液相色谱-串联质谱仪：日本SMMADZU岛津公司液相色谱一串联三重四极杆串联 质谱仪^^一8050，配有电喷雾离子源(￡31);111^柱((^13@，3(^，6011^);微孔滤膜(30八八-114,0.22_，上海安谱科学仪器有限公司）。氮气吹干仪（N-EVAPTM112型，美国 Organomation Associates，Inc公司）；分析天平（BS2202/TE-612-L/CP225D型电子天平，德 国Sartorius公司）；超声波清洁器(KQ-500E型）；高速祸旋仪(WH-861型Vortex Shaker，上 海华利达公司）
[0031]甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水。黄曲霉毒素混合对照品溶液(美国SUPELC0公司 批号：LB80734黄曲霉毒素 GhGi 浓度分别为 0 ? 3μg/ml、1 ? 0μg/ml、0 ? 3μg/ml、1 ? Oyg/ ml)、赭曲霉毒素A(美国R0MER公司批号S11263Z浓度100μg/ml)、T-2毒素（J&K公司批号： LHA0M26浓度100μg/ml)、霉酚酸（美国R0MER公司批号L13331A浓度100μg/ml)、玉米赤霉烯 酮(美国R0MER公司批号S10404Z)、玉米赤霉烯醇(美国R0MER公司批号S10207Z)、脱氧雪腐 镰刀菌烯醇(FLuka公司提供，批号：SZE8150XV)。5种同位素内标均购自于美国R0MER公司： 13C-B1 (批号 I13202A 浓度 0.5邱/1111)、13(：-(^^(批号1130846浓度10辟/1111)、13(：-12(批号 I13022T 浓度 25μg/ml)、13C-ZEN(批号 I12505B 浓度 25μg/ml)、13C-D0N(批号 I13084A 浓度 25 μg/ml)。银杏叶注射液样品购自杭州市场。
[0032] 2实验方法
[0033] 2.1色谱及质谱条件
[0034] 2.1.1色谱条件
[0035] Waters BE1H-C18色谱柱（100*2 ? 10mm，1 ? 7ym);流动相为甲醇(B)_5mmol/L醋酸铵 (A)，梯度洗脱（此处百分比为有机相B相）：0~6min，25% ;6~8min，70%~95% ;8~ 8.51^11，95%~100%;8.5~9.5111111，100%;9.5~9.6，100%~25% ;9.6~12111111，25%。流 速:0.3mL ? min-1;柱温40°C ;进样量1此，结果见附图1。
[0036] 2.1.2质谱条件
[0037] 质谱检测采用正负两种离子模式，进行多反应监控模式(MRM)检测。黄曲霉毒素等 15种真菌毒素质谱条件见表1。
[0038]表1. 15种真菌毒素的质谱参数
[0040] 2.2对照品及供试品溶液的配制
[0041 ] 2.2.1对照品溶液的制备
[0042]将10种毒素溶解后以特定比例混合，于40°C下氮气吹干，用30%乙腈复溶，配制成 含有黄曲霉毒素B2、G2为15ng/mL，黄曲霉毒素B1、G1、赭曲霉毒素A、T-2毒素、霉酚酸为 50ng/mL，玉米赤霉稀酮、玉米赤霉稀醇为250ng/mL，脱氧雪腐镰刀菌稀醇为lyg/mL的混合 对照品工作液。将5种毒素内标溶液以特定比例混合，以30%乙腈稀释成混合内标工作液 (13081、1300了八、130了2、13(：-2￡113(：-〇0咐农度分别为4〇1^/11^、4〇1^/11^、4〇1^/11^、 200ng/mL、800ng/mL)。
[0043] 使用30 %乙腈进行稀释，配成一系列的对照品溶液_20°C下避光保存。
[0044] 2.2.2供试品溶液的制备
[0045]量取相当于生药量2g的银杏叶注射液，置于50ml离心管中，加入混合内标工作液 100ul，混匀，于50°C下氮吹至近干，精密加入90%乙睛10ml，超声提取30min，提取完成后， 12000rm离心10min，移取上清液5ml，于45°C氮气吹干，用乙腈500yL复溶后加水稀释至 25ml，涡旋混匀，待上样。
[0046] 提取稀释液缓慢通过已用3ml甲醇和3ml水活化的HLB柱，流速约lmL/min，加入roS 缓冲液5mL淋洗，静置30min后，用含0.2 %甲酸的乙腈5ml洗脱，收集洗脱液，于45°C下氮气 吹干，加入30 %乙腈溶液lml，超声30s，涡旋lmin，通过0.22mi微孔滤膜即得。
[0047] 3实验结果
[0048] 3.1方法学考察
[0049] 3.1.1线性关系
[0050]以同位素内标工作液（浓度为40ng/ml)50ul分别加入至6个进样瓶中，氮气吹干 后，取混合对照品工作液，以30%乙腈稀释成6个不同浓度的对照品溶液(浓度分别为1、2、 5、10、20、50即/111〇，超声10 8，涡旋11^11，进入液质联用检测，以色谱峰峰面积以)为纵坐标， 进样浓度(X，ng ? mL-1)进行线性回归。线性范围及回归方程见表2,3。
[0051 ]表2.线性系列混合对照品溶液浓度表
[0054]表3. 10种毒素线性实验结果
[0056] 3.1.2仪器精密度
[0057]取线性3号样品，平行进样6次，计算其相对标准偏差，结果见表4，表明仪器精密度 良好，达到检测要求。
[0058]表4. 10种毒素的精密度结果
[0061 ] 3.1.3回收率
[0062]银杏叶注射液移取相当于2g药材的样品，一式6份，按低、中、高三种浓度水平分别 精密加入加样回收率用混合对照品溶液(黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄 曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、T-2毒素、霉酚酸、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮及呕吐毒素），按照 拟订方法制备供试品溶液并测定含量，计算加样回收率，结果见表5及附图2,表明回收率试 验结果良好。
[0063]表5.银杏叶注射液10种真菌毒素的回收率试验结果
[0065] 3.1.4定量限
[0066] 取低浓度回收率的供试品溶液测定信噪比，以信噪比10:1计算方法定量限。
[0067]表6. 10种真菌毒素在银杏叶注射液中的定量限
[0070] 3.1.5银杏叶注射液检测结果
[0071]采用本方法对30份银杏叶注射液样品进行了 10种真菌毒素的同时检测。结果表 明：绝大多数样品中毒素检测结果为阴性，结果见附图3,仅在10号样品中分别检出2.41iig/ kg的OTA和4?95yg/kg的MPA。
【主权项】
1. 一种同时检测中药注射剂中多种真菌毒素的方法，其特征在于，通过以下步骤实现： (1)取中药注射剂液体或固体样品，进行干燥； ⑵加入提取溶剂，进行提取;提取溶剂为80 %~100 %乙臆-水溶液(v/v); (3) 提取后，进行离心处理，取上清液进行干燥； (4) 将干燥后的样品用纯水或低浓度有机溶剂的水溶液进行复溶，低浓度有机溶剂为 0· 1 %~5%乙腈-水溶液(v/v)或0.1%~20%甲醇-水溶液(v/v); (5) 复溶液缓慢通过已活化好的固相萃取柱，然后用水或PBS溶液或低浓度有机溶剂水 溶液进行淋洗； (6) 用洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液； (7) 将洗脱液进行干燥，并用30%乙腈溶液溶解，过滤，进入液质联用仪进行定性或定 量检测。2. 根据权利要求1所述的一种同时检测中药注射剂中多种真菌毒素的方法，其特征在 于，所述的真菌毒素是黄曲霉毒素 Bl、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 Gl、黄曲霉毒素 G2、赭曲霉 毒素 A、霉酸酸、T2毒素、玉米赤霉稀酮、玉米赤霉稀醇、呕吐毒素。3. 根据权利要求1所述的一种同时检测中药注射剂中多种真菌毒素的方法，其特征在 于，所述的中药注射剂为银杏叶注射液、丹红注射液、银杏达莫注射液、参麦注射液、丹参川 芎嗪注射液、醒脑静注射液、血栓通注射液、川芎嗪注射液、疏血通注射液、康艾注射液、参 芪扶正注射液、香菇多糖注射液、艾迪注射液、炎琥宁注射液、痰热清注射液、喜炎平注射 液、血必静注射液、舒血宁注射液、刺五加注射液、黄芪注射液、双黄连注射液或血塞通粉 针。4. 根据权利要求1所述的一种同时检测中药注射剂中多种真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步骤(1)中干燥方法为氮气吹干、冷冻干燥、旋蒸中的任意一种。5. 根据权利要求1所述的一种同时检测中药注射剂中多种真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步骤(2)中提取方式为振荡、涡旋、超声中的任意一种。6. 根据权利要求1所述的一种同时检测中药注射剂中多种真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步骤(5)中固相萃取柱为Waters HLB多功能柱。7. 根据权利要求1所述的一种同时检测中药注射剂中多种真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步骤(6)中洗脱剂为甲醇、乙腈、酸化甲醇、酸化乙腈中的任意一种。8. 根据权利要求1所述的一种同时检测中药注射剂中多种真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步骤(7)中检测方法为同位素内标稀释法。
【文档编号】G01N30/06GK105891373SQ201610407940
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】陈勇, 李劲, 吴永江, 刘雪松, 栾连军, 王龙虎
【申请人】浙江大学