试剂盒及其应用

文档序号:10533077阅读:933来源:国知局
试剂盒及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种检测试剂盒及其应用,属于生物检测领域。所述试剂盒包括有效量的抗犬瘟热病毒单克隆抗体1、2和有效量的犬副流感病毒单克隆抗体3、4,以及对抗原抗体反应进行检测的检测试剂;单克隆抗体1、2以及单克隆抗体3、4分别能与犬瘟热病毒、犬副流感病毒同时发生抗原抗体反应。本发明的试剂盒能有效检测上述两种病毒及其抗原,当使用酶反应检测时,其敏感性与PCR相当,当使用胶体金进行检测时,其敏感性优于商业上获得的同类产品。本发明还提供了该试剂盒在非诊断目的方面的应用。CCTCC No: C201520120151125 CCTCC No: C201520220151125
【专利说明】
试剂盒及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物检测领域,涉及试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 犬痕热病毒(Canine distemper virus,Q)V)属于副粘病毒科麻疹病毒属,是单链 负链不分节段的RNA病毒,可引起犬和其他肉食动物如狐、狼、貂、综熊等发生犬瘟热(俗称 狗瘟或麻疹)。犬瘟热于1905年首次报道,是世界范围内广泛发生的一种犬的急性、高接触 性传染病,易继发细菌和其他病毒的混合感染或继发感染,发病率高达80%,康复后易出现 麻痹、抽搐、癫痫发作等后遗症。
[0003] 犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)又称副流感病毒5型 (Parainfluenza virus 5),属于副粘液病毒亚科副粘病毒属,是单股负链RNA病毒。该病毒 呈世界性分布,可感染各种年龄、性别的犬科动物,特别是幼龄犬,主要通过病犬的眼分泌 物、唾液、呼吸道分泌物等散播,经呼吸道途径感染,通过损坏犬的上呼吸道组织,引起干 咳、尖咳、鼻塞等症状,严重者会引起犬的支气管炎和支气管肺炎,并给其它病原体的感染 创造条件。
[0004] 犬腺病毒(canine adenovirus,CAV)是腺病毒科哺乳动物腺病毒属中致病性最强 的一种病毒,危害了我国的养犬业和皮毛动物养殖业,每年都会造成巨大的经济损失。犬腺 病毒有2个血清型,其中,犬腺病毒I型(CAV-1)又称犬传染性肝炎病毒(infectious canine hepatitis virus,ICHV),既可引起犬传染性肝炎(以肝小叶中心坏死,肝实质细胞和皮质 细胞核内出现包涵体和出血时间长为特征的急性败血性传染病),又可引起狐狸脑炎,临床 症状以呕吐、腹痛、腹泻、体温升高、突然死亡为特征,是重要的传染病;犬腺病毒n型(CAV-2)引起犬传染性喉气管炎及肺炎症状,临床特征表现为持续性高热、咳嗽、浆液性至粘液性 鼻漏、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎等呼吸道症状,从临床发病情况统计,该病多见于半年以 下的幼犬,可造成全窝或全群幼犬咳嗽。
[0005] 犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型和/或犬腺病毒n型主要引发犬的呼吸 道感染,所引发的疾病常常混合感染和继发感染。随着人们所养的犬越来越多,这几种病毒 所造成的经济损失越严重。因此,亟需研发能实现犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒的 检测方法。
[0006] 目前,检测这几种病毒的方法包括病毒分离鉴定和血清检查,但操作过程繁琐、耗 时过长;PCR/RT-PCR检测,但需要专门的仪器和专业的操作人员,这些方法均不适合基层或 现场快速检测。现有技术也有各自单一的胶体金检测试纸条,但价格昂贵或检测灵敏度低。 因而,亟需研制一种能简单、快速、准确、同时检测这几种病毒的装置及检测方法。

【发明内容】

[0007] 为了解决现有技术的不足,本发明提供了一种检测试剂盒,该试剂盒可简单、快 速、灵敏度高并同时检测出至少犬瘟热病毒、犬副流感病毒这两种病毒。
[0008] 本发明涉及一种试剂盒,所述试剂盒包括有效量的抗犬瘟热病毒单克隆抗体1、2, 有效量的抗犬副流感病毒单克隆抗体3、4,还包括对抗原抗体反应进行检测的检测试剂,其 中,所述单克隆抗体1为抗犬瘟热病毒单克隆抗体6E11,所述单克隆抗体2为抗犬瘟热病毒 单克隆抗体1G5;所述抗犬副流感病毒单克隆抗体3、4分别选自4F3B6、4C9D6、5B4C9、4G7F4 中的两种,且所述抗犬副流感病毒单克隆抗体3、4能与犬副流感病毒同时发生抗原抗体反 应。
[0009] 本发明还涉及所述试剂盒检测样品中病毒的方法,所述检测方法包括:(1)将检测 样品与所述单克隆抗体1、2,所述单克隆抗体3和4进行接触,(2)检测所述单克隆抗体1、2, 所述单克隆抗体3和4与样品中病毒的反应;其中,所述检测方法步骤(1)中的所述单克隆抗 体1、所述单克隆抗体3固定在固相上,所述固相优选为微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝酸纤 维素膜中的任一种;其中,所述方法步骤(2)中所述反应可通过酶显色、胶体金、荧光、化学 发光中的任一种方法进行测定。
[0010] 本发明还涉及所述试剂盒在用于非诊断目的的犬瘟热病毒、犬副流感病毒检测中 的应用,其应用过程简单、快速并且灵敏度高。
【附图说明】
[0011] 图1为单克隆抗体6E11、1G5的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定图,其中泳道M为蛋白 Marker;泳道1为单克隆抗体1G5,包括上端的重链和下端的轻链;泳道2为单克隆抗体6E11, 包括上端的重链和下端的轻链。
[0012] 图2为酶免疫层析检测试纸条的侧向示意图,图2(1)为固定了两种单克隆抗体酶 免疫层析检测试纸条侧向示意图,图2(2)为固定了三种单克隆抗体酶免疫层析检测试纸条 侧向示意图,图2(3)为固定了四种单克隆抗体酶免疫层析检测试纸条侧向示意图,图中:硝 酸纤维素膜1、酶标垫2、底物垫3、吸水垫4、展开液垫5、检测线6、质控线7、底物缓冲液槽8、 底物缓冲液9、支撑物10、检测样品11。
【具体实施方式】
[0013]以下,对本发明的实施方式进行说明。
[0014] 本发明涉及一种试剂盒,所述试剂盒包括有效量的抗犬瘟热病毒单克隆抗体1、2 和有效量的抗犬副流感病毒单克隆抗体3、4,以及对抗原抗体反应进行检测的检测试剂;其 中,所述单克隆抗体1为抗犬瘟热病毒单克隆抗体6E11,所述单克隆抗体2为抗犬瘟热病毒 单克隆抗体1G5;以及所述抗犬副流感病毒单克隆抗体3、4分别选自4F3B6、4C9D6、5B4C9、 4G7F4中的两种,且所述抗犬副流感病毒单克隆抗体3、4能与犬副流感病毒同时发生抗原抗 体反应。
[0015] 术语"单克隆抗体"是指获自基本上同源的抗体群的抗体,即组成该群体的抗体个 体都相同,除了可能存在少量可能的自发突变。因此,修饰语"单克隆"是指该抗体的性质不 是离散抗体的混合物。优选地,所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合 抗体、犬源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物,也包括抗体片段和含有抗 原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因 子,因而,这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、犬源化抗体以及抗体的功能等同 物和同源物,也包括含有抗原结合结构域的任何多肽,无论是天然的还是合成产生的。抗体 的实例是免疫球蛋白亚型(如186,18£,1811,18〇和184)及其亚型亚类;也可以是包含抗原结 合结构域的片段如?813、8〇?¥、?¥、(^13、?(1 ;和双链抗体((113130(1168)。融合至另一多肽的、包 含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在 EP. A. 0120694和EP. A. 0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰,可用DNA重组技术来产 生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋 白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区, 参见EP.A. 184187,GB2188638A或EP.A. 239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细 胞进行遗传突变或其它改变,这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发 明的"单克隆抗体"也可用杂交瘤方法制得,因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本 领域技术人员熟知的常规手段,如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增 得到,因而也可用重组DNA方法,可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体 中。最后,在适合本发明抗体表达的条件下,培养转化所得的宿主细胞,然后本领域技术人 员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接 在一起的多肽链几何体,称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别 (同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的 可变区和三个不同的恒定区,轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区 (不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
[0016]术语"重链可变区"是指一种多肽,其长度为110至125个氨基酸,其氨基酸顺序相 应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样,术语"轻链可变 区"是指一种多肽,其长度为95至115个氨基酸,其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从 轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓,在本发明所具体 公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上,可以通过常规基因工程 和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰,获得其活性片段或保 守性变异体,而仍能够保持与相应病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性 片段或保守性变异体。
[0017]术语"有效量"当理解为"诊断有效量"时是指能够利用本发明所述单克隆抗体有 效检测样品中是否存在犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型或犬腺病毒n型的量。根 据已知的免疫化学检测方法,本领域技术人员能够知晓,所用单克隆抗体的量随采用的具 体免疫检测方法的不同而不同,根据公知文献的教导,本领域技术人员知晓如何选择适当 的本发明所述单克隆抗体用量,以用于诊断样品中是否存在犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬 腺病毒I型或犬腺病毒n型。本领域技术人员知晓,适当地该试剂盒中还应当包括适当的载 体,缓冲液/剂,和用于检测所产生信号的试剂及使用说明书。本发明所述试剂盒有效检测 样品中是否存在犬痕热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型或犬腺病毒n型的量时所米用的 检测方法可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫 检测、荧光免疫检测、免疫色谱法及类似检测方法。
[0018]本发明的抗犬瘟热病毒单克隆抗体6E11是由小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌产 生,小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株由犬瘟热病毒CVCC AV299株抗原免疫小鼠后,取其脾细胞, 与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经筛选制得;小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株(Hybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0,strain 6E11)保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号 为CCTCC No:C2015202,保藏地址为中国武汉?武汉大学,保藏时间为2015年11月25日。
[0019] 本发明的抗犬瘟热病毒单克隆抗体1G5是由小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株分泌产生, 小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株由犬瘟热病毒CVCC AV299株抗原免疫小鼠后,取其脾细胞,与 Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经筛选制得;小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株(Hybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0, strain 1G5)保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC No :C2015201,保藏地址为中国武汉?武汉大学,保藏时间为2015年11月25日。
[0020] 单克隆抗体4?386、扣906、58扣9、467?4公开于犬副流感病毒的分离及单克隆抗体 的制备.岑皓.扬州大学硕士学位论文,2007。
[0021] 作为本发明的一种实施方式,所述单克隆抗体3为抗犬副流感病毒单克隆抗体 4F3B6、所述单克隆抗体4为抗犬副流感病毒单克隆抗体4C9D8。
[0022] 作为本发明的一种实施方式,所述试剂盒进一步含有有效量的抗犬腺病毒I型单 克隆抗体5、6,和/或有效量的抗犬腺病毒II型单克隆抗体7、8,其中,所述抗犬腺病毒I型单 克隆抗体5、6分别选自0849、63、02、112、2£10-112中的两种,且所述抗犬腺病毒1型单克隆抗 体5、6能与犬腺病毒I型同时发生抗原抗体反应;所述抗犬腺病毒II型单克隆抗体7为Santa 公司的anti-CAV-2-Santa、单克隆抗体8为4H1-A7。
[0023] 单克隆抗体C8、E9公开于抗犬I型腺病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定.李 晓叶,刘颖,蓝田丰等.中国农学通报,2011,27(11): 31-34;单克隆抗体G3、C2、H2公开于抗 犬I型腺病毒单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立.李晓叶.吉林大学硕士学位论文, 2011;单克隆抗体2E10-H2购自Veterinary Medical Research&Development Inc.。
[0024] 单克隆抗体4H1-A7购自Veterinary Medical Research&Development Inc.,单克 隆抗体 anti-CAV-2-Santa 购自 Santa公司。
[0025] 作为本发明的一种实施方式,所述单克隆抗体5为抗犬腺病毒I型单克隆抗体G3, 所述单克隆抗体6为抗犬腺病毒I型单克隆抗体E9。作为本发明的一种实施方式,所述单克 隆抗体1、3、5、7的含量各自分别为25-1000μg/ml,所述单克隆抗体2、4、6、8的含量各自分别 为 50-2000iig/ml。
[0026] 作为本发明的一种实施方式,所述试剂盒进一步包括洗涤液、稀释液、底物显色 液、终止液、阴性对照、阳性对照。
[0027] 作为本发明的一种实施方式,所述单克隆抗体1、单克隆抗体3固定于固相上,所述 固相包括微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝酸纤维素膜。作为本发明的一种实施方式,所述单 克隆抗体1、单克隆抗体3、单克隆抗体5和/或单克隆抗体7固定于固相上,所述固相包括微 滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝酸纤维素膜。
[0028] 作为本发明的一种实施方式,所述对抗原抗体反应进行检测的检测试剂包括酶显 色检测试剂、胶体金检测试剂、荧光检测试剂、化学发光检测试剂或同位素检测试剂。
[0029] 作为本发明的一种实施方式,所述试剂盒包括胶体金检测试纸条,所述胶体金检 测试纸条包括底板,所述底板具有第一端和第二端,并且沿所述第一端向第二端的方向,所 述底板上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述金标垫上含有胶体金 标记的所述单克隆抗体2、胶体金标记的所述单克隆抗体4,所述硝酸纤维素膜上有两条检 测线和一条质控线,所述检测线依次固定有单克隆抗体1、单克隆抗体3,所述质控线上有羊 抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
[0030]作为本发明的一种优选实施方式,所述试剂盒还包括有效量的抗犬腺病毒I型单 克隆抗体5、6和/或有效量的抗犬腺病毒II型单克隆抗体7、8,所述胶体金检测试纸条包括 底板,所述底板具有第一端和第二端,并且沿所述第一端向第二端的方向,所述底板上依次 有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述金标垫上是含有胶体金标记的所述 单克隆抗体2、胶体金标记的所述单克隆抗体4、胶体金标记的所述单克隆抗体6和/或胶体 金标记的单克隆抗体8,所述硝酸纤维素膜上有三条或四条检测线和一条质控线,所述检测 线依次固定有单克隆抗体1、单克隆抗体3、单克隆抗体5和/或单克隆抗体7,所述质控线上 有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
[0031]作为本发明的一种实施方式,所述试剂盒包括缓冲液供应单元和酶免疫层析检测 试纸条;所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸条;所述酶免疫 层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1),所述酶免疫层析检测试纸条在纵向上依次包括底 物供应区、样品供应区、检测区;所述底物供应区包括底物垫(3),其上吸附有干燥的酶底 物,所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触,当所述缓冲液供应单元向所述酶免疫层析检 测试纸条供给缓冲液,所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液 供应单元的远端迀移;所述样品供应区包括酶标垫(2),其上吸附有酶标记的所述单克隆抗 体2、所述单克隆抗体4,所述酶底物能与所述单克隆抗体2、所述单克隆抗体4上标记的酶产 生显色反应,所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触,所述单克隆抗体2、所述单克隆抗体4 溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迀移;以及所述检 测区依次固定化有所述单克隆抗体1、所述单克隆抗体3;其中,所述缓冲液供应单元包括展 开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮,所述底物缓冲液(9)放置于底 物缓冲液槽(8)中,所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方,按下所述按钮可将所述 展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中;所述检测区包括检测线(6)、质控线(7),其中,所述质控线 (7)较检测线(6)更远离所述样品供应区,在所述检测线(6)分别固定化有所述单克隆抗体 1、所述单克隆抗体3,在所述质控线(7)固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗,且吸附在酶标 垫(2)上的所述酶标记的单克隆抗体2、单克隆抗体4分别对于固定在检测线(6)的所述单克 隆抗体1、所述单克隆抗体3而言是过量的;所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在所述支撑物 (10)上,支撑物(10)连接所述缓冲液供应单元,底物供应区,样品供应区,检测区以及吸水 垫(4),所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端;以及检测样品(11)加入的位置 为所述酶标垫(2)的位置。
[0032]作为本发明的一种优选实施方式,所述试剂盒还包括有效量的抗犬腺病毒I型单 克隆抗体5、6和/或有效量的抗犬腺病毒II型单克隆抗体7、8;所述试剂盒包括缓冲液供应 单元和酶免疫层析检测试纸条;所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检 测试纸条;所述酶免疫层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1 ),所述酶免疫层析检测试纸条 在纵向上依次包括底物供应区、样品供应区、检测区;所述底物供应区包括底物垫(3),其上 吸附有干燥的酶底物,所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触,当所述缓冲液供应单元向 所述酶免疫层析检测试纸条供给缓冲液,所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1) 上向距所述缓冲液供应单元的远端迀移;所述样品供应区包括酶标垫(2),其上吸附有酶标 记的所述单克隆抗体2、所述单克隆抗体4、所述单克隆抗体6和/或所述单克隆抗体8,所述 酶底物能与所述单克隆抗体2、所述单克隆抗体4、所述单克隆抗体6和/或所述单克隆抗体8 上标记的酶产生显色反应,所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触,所述单克隆抗体2、所 述单克隆抗体4、所述单克隆抗体6和/或所述单克隆抗体8溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜 (1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迀移;以及所述检测区依次固定化有所述单克隆抗 体1、所述单克隆抗体3、所述单克隆抗体5和/或所述单克隆抗体7;其中,所述缓冲液供应单 元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮,所述底物缓冲液(9) 放置于底物缓冲液槽(8)中,所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方,按下所述按钮 可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中;所述检测区包括检测线(6)、质控线(7),其中,所 述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区,在所述检测线(6)分别固定化有所述单 克隆抗体1、所述单克隆抗体3、所述单克隆抗体5和/或所述单克隆抗体7,在所述质控线(7) 固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗,且吸附在酶标垫(2)上的所述酶标记的单克隆抗体2、 单克隆抗体4、所述单克隆抗体6和/或所述单克隆抗体8分别对于固定在检测线(6)的所述 单克隆抗体1、所述单克隆抗体3、所述单克隆抗体5和/或所述单克隆抗体7而言是过量的; 所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在所述支撑物(10)上,支撑物(10)连接所述缓冲液供应单 元,底物供应区,样品供应区,检测区以及吸水垫(4),所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应 单元的最远端;以及检测样品(11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。
[0033] 作为本发明的一种实施方式,所述试剂盒中的所述酶免疫层析检测试纸条包括固 相的硝酸纤维素膜1、含有标记试剂的酶标垫2、底物垫3、吸水垫4、展开液垫5、检测线6、质 控线7、底物缓冲液槽8、底物缓冲液9、支撑物10,其中2属于样品供应区,3属于底物供应区, 5、8属于缓冲液供应单元,6、7属于检测区。检测样品11加入的位置为酶标垫2的位置。所述 检测试纸条固定在塑料外壳中,其上从左到右依次固定展开液垫5、底物垫3、酶标垫2、吸水 垫4。硝酸纤维素膜1粘附在支撑物10的全段;吸水垫4卡在硝酸纤维素膜1的顶端,且与硝酸 纤维素膜1有重叠;酶标垫2位于硝酸纤维素膜1的中段,上面干燥有酶标记的所述单克隆抗 体2、所述单克隆抗体4和/或所述单克隆抗体6;底物垫3卡在硝酸纤维素膜1的底端,其上有 干燥的酶底物。展开液垫5的上端覆盖了底物垫3,且其下端位于底物缓冲液槽8的底端。底 物缓冲液槽8的上面覆盖了一层铝箱纸,以防止底物缓冲液9渗漏,其上有缓冲液按钮,按下 缓冲液按钮可刺破铝箱纸,并将展开液垫5的下端浸入到底物缓冲液9中。检测线6位于硝酸 纤维素膜1的中上端,其上固定化有所述单克隆抗体1。质控线7位于硝酸纤维素膜1的中上 端、检测线6的上游,其上固定化有羊抗鼠二抗。
[0034] 术语"检测样品"包括但不限于动物或患者的眼鼻腔分泌物、动物细胞培养的完整 病毒或裂解病毒液等。
[0035] 本发明还涉及使用所述试剂盒检测样品中病毒的方法,所述方法包括:(1)将检测 样品与所述单克隆抗体1、2,所述单克隆抗体3和4,所述单克隆抗体5、6和/或所述单克隆抗 体7、8进行接触,(2)检测所述单克隆抗体1、2,所述单克隆抗体3和4,所述单克隆抗体5、6 和/或所述单克隆抗体7、8与样品中病毒的反应;其中,所述方法步骤(1)中的所述单克隆抗 体1、所述单克隆抗体3、所述单克隆抗体5和/或所述单克隆抗体7附着在固相上,所述固相 优选为微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝酸纤维素膜中的任一种;其中,所述方法步骤(2)中 所述反应可通过酶显色、胶体金、荧光、化学发光中的任一种方法进行测定。
[0036] 作为本发明的一种实施方式,所述检测方法进一步包括:在所述步骤(1)前,将采 集的微生物拭子插入到样品处理管中,使所述检测样品尽可能溶解在溶液中,将处理后的 检测样品滴加至检测试纸条加样孔中心。
[0037] 作为本发明的一种实施方式,所述检测方法进一步包括:在所述步骤(2)后,10或 30分钟后判定结果:若质控线显色即试验成立,检测线显色即可判为阳性,检测线不显色即 可判为阴性;若质控线未显色即试验不成立,无论检测线是否显色,均判定为无效结果,需 重测。
[0038] 本发明还涉及所述试剂盒在用于非诊断目的的犬瘟热病毒、犬副流感病毒检测中 的应用。
[0039] 本发明还涉及所述试剂盒在用于非诊断目的的犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺 病毒I型和/或犬腺病毒n型检测中的应用。
[0040] 所述非诊断目的包括流行病学分析、对离体组织进行定性和定量检测、表位鉴定 研究以及定性和定量鉴别检验含所述犬瘟热病毒、犬副流感病毒的全病毒抗原的疫苗组合 物中的全病毒抗原,或定性和定量鉴别检验含犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型和/ 或犬腺病毒n型的全病毒抗原的疫苗组合物中的全病毒抗原。
[0041] 作为本发明的一种实施方式,本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体1、2和 有效量的所述单克隆抗体3、4的试剂盒在用于非诊断目的的犬瘟热病毒和犬副流感病毒检 测中的应用。
[0042] 作为本发明的一种实施方式,本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体1、2,有 效量的所述单克隆抗体3、4和有效量的所述单克隆抗体5、6的试剂盒在用于非诊断目的的 犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒I型检测中的应用。
[0043] 作为本发明的一种实施方式,本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体1、2,有 效量的所述单克隆抗体3、4和有效量的所述单克隆抗体7、8的试剂盒在用于非诊断目的的 犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒n型检测中的应用。
[0044] 作为本发明的一种实施方式,本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体1、2,有 效量的所述单克隆抗体5、6和有效量的所述单克隆抗体7、8的试剂盒在用于非诊断目的的 犬痕热病毒、犬腺病毒I型和/或犬腺病毒n型检测中的应用。
[0045] 作为本发明的一种实施方式,本发明提供了包括有效量的所述单克隆抗体1、2,有 效量的所述单克隆抗体3、4,有效量的所述单克隆抗体5、6,和有效量的所述单克隆抗体7、8 的试剂盒在用于非诊断目的的犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型和犬腺病毒n型检 测中的应用。
[0046] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0047]本实施例中所用的磷酸盐缓冲液为pH值7.4的roS,其1L体积配方为:NaCl 8.0g、 KC1 0.2g、Na2HP〇4. 12H20 2.9g、KH2P〇4 0.24g,但该实施方式无论在任何情况下均不构成 对本发明的限定。
[0048]本实施例中以胶体金检测试纸条中的检测线从左到右依次固定单克隆抗体1、3为 胶体金检测试纸条1,固定单克隆抗体1、3、5为胶体金检测试纸条2,单克隆抗体1、3、5、7时 作为胶体金检测试纸条3;以酶免疫层析检测试纸条中的检测线从左到右依次固定单克隆 抗体1、3为酶免疫层析检测试纸条1,固定单克隆抗体1、3、5为酶免疫层析检测试纸条2,固 定单克隆抗体1、3、5、7为酶免疫层析检测试纸条3为例进行阐述,但该实施方式无论在任何 情况下均不构成对本发明的限定。
[0049] 本发明以下所述的实验方法,若无特殊说明,均为常规方法;所述的生物材料,若 无特殊说明,均可从商业途径获得。
[0050] 实施例1抗犬瘟热病毒单克隆抗体的制备、纯化、鉴定及检验
[0051 ] 1.1抗犬瘟热病毒单克隆抗体的制备和纯化
[0052]将犬痕热病毒CVCC AV299株按照Harlow E等(Harlow E,Lane D.Antibodies:a laboratory manual.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998,139-312) 文献的操作方法制备小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株、小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株,并提交保 藏;使用这两种小鼠骨髓杂交瘤细胞株进一步分别制得抗犬瘟热病毒单克隆抗体6E11、抗 犬瘟热病毒单克隆抗体1G5。并分别对单克隆抗体6E1U1G5按照陈丹等(陈丹,孙广瑞,柳增 善.辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用.安徽农业科学,2007,35(26): 8105,8108)的辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化。
[0053] 1.2抗犬瘟热病毒单克隆抗体的鉴定
[0054] 1.2.1单克隆抗体类型和亚类的鉴定
[0055]运用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit并参照说明书对抗体的亚 型进行鉴定。鉴定结果见表1:
[0056]表1各单克隆抗体类型的鉴定
[0058] 注:+表示阳性反应,-表示阴性反应。
[0059]由表1可知,单克隆抗体1G5、6E11重链亚型都为IgGl,轻链类型都为kappa。
[0060] 1.2.2单克隆抗体特异性的鉴定
[0061]按照苏建青(苏建青等,犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及特性鉴定,吉林农业大学 学报,2009,31 (1): 88~92)所提供的方法进行单克隆抗体的特异性鉴定。
[0062]测定结果显示:单克隆抗体1G5、6E11与其他病毒均不发生反应,均是抗犬瘟热病 毒的特异性单克隆抗体。
[0063] 1.3纯化单克隆抗体的检验
[0064] 1.3.1纯化单克隆抗体的外观
[0065] 室温下,肉眼观察可见纯化抗体呈无色澄清状态,未见絮状物沉淀。
[0066] 1.3.2无菌试验
[0067] 采用无菌检验法,取纯化后的单克隆抗体原料接种10mL/管的营养琼脂斜面培养 基、改良马丁培养基和硫乙醇酸盐培养基各2管(接种量为0.5mL/管)。接种后的硫乙醇酸盐 培养基及营养琼脂斜面培养基各一管置于30_35°C培养,另一管于2〇-25°C培养。改良马丁 培养基置于20_25°C培养。同时以无菌生理盐水同法操作做阴性对照。培养14天后均未观察 到培养基中有微生物生长,表明单克隆抗体1G5、6E11原料符合无菌要求。
[0068] 1.3.3单克隆抗体纯度
[0069] 采用SDS-PAGE电泳鉴定,上样量为10yg,检测结果如图2所示。结果表明:单克隆抗 体1G5、6E11的纯度均不低于80%。
[0070] 1.3.4单克隆抗体相对亲和力的测定
[0071]对纯化的单克隆抗体进行其相对亲和力的测定:将纯化开始作倍比稀释,分别加 入包被有⑶V抗原(1: 200倍V/V稀释)的96孔酶标板,同时设阴性血清和空白对照37 °C反应 30分钟,用TOST洗板3次,拍干;每孔加入羊抗鼠IgG-HRP(l: 1 X 104稀释)100此/孔,反应过 后洗涤同上,每孔加入1〇〇此/孔TMB(四甲基联苯胺)底物溶液显色,用2m 〇L/L H2S〇4(50yL/ 孔)终止反应,读取〇D45Qr?值。结果以与包被抗原出现50 %结合时的单克隆抗体的蛋白含量, 即为该株单克隆抗体的相对亲和力。
[0072]以纯化单克隆抗体的稀释度与其相对应的OD45〇M值作图,曲线趋于平坦时的 0D45Q?作为100%,即抗原与单克隆抗体的结合已达到饱和状态。取曲线上50%饱和度所对 应的单克隆抗体浓度,即为该株单克隆抗体的相对亲和力,亲和力越大,所需单克隆抗体的 量越低。计算结果表明:单克隆抗体1G5、6E11的相对亲和力均为1:5120。
[0073] 1.3.5单克隆抗体IPMA效价的测定
[0074]参照刘杉杉(刘杉杉等,猪细小病毒抗体IPMA检测方法的建立及应用,中国兽医科 学,2011,41 (04): 387-391)所述IPMA检测方法,用此方法对两株单克隆抗体进行效价测定。 测定结果表明:单克隆抗体1G5、6E11的IPMA效价均为1:12800。
[0075] 1.4单克隆抗体1G5、6E11可变区序列的测定
[0076] 根据鼠源单克隆抗体的序列特征,设计1G5重链可变区引物序列:
[0077] P1:ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTRT
[0078] P2:CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGA [0079] 设计1G5轻链可变区引物序列:
[0080] P3:ACTAGTCGACATGAGTGTGCYCACTCA [0081 ] P4:CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGAT
[0082]根据鼠源单克隆抗体的序列特征,设计6E11重链可变区引物序列:
[0083] PI:ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTRT
[0084] P2:CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGA [0085] 设计6E11轻链可变区引物序列:
[0086] P3:ACTAGTCGACATGAGTGTGCYCACTCA
[0087] P4:CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGAT
[0088]按照张爱华等(张爱华,闭兰,王志友等.系列鼠抗⑶分子单克隆抗体轻、重链可变 区基因的克隆和序列分析.中国生物制品学杂志,2001,15(2): 65-68)建立的可变区序列测 定方法,通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体6E1U1G5的可变区序列,选取对应的克隆 质粒送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。
[0089]结果:单克隆抗体6E11的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID 如.1、36〇10如.3所示,由其推导的氨基酸序列分别为3£〇10如.2、3£〇10如.4;单克隆 抗体1G5的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No. 7所示,由 其推导的氨基酸序列分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.8。
[0090] 1.5单克隆抗体的配对
[0091] 选择犬瘟热病毒CVCC AV299株病毒液,稀释到102'5TCID5Q/ml,对于不同搭配模式 进行检测,结果见表2:
[0092]表2单克隆抗体搭配检测
[0094] 注:+表示阳性反应,-表示阴性反应。
[0095] 结果显示:除了固相的单克隆抗体6E11与酶标的单克隆抗体1G5检测102 ? 5TCID50/ ml的犬瘟热病毒CVCC AV299株病毒稀释液为阳性,其它搭配检测均为阴性。因而,以单克隆 抗体6E11作为固定抗体、单克隆抗体1G5作为标记抗体进行试验。
[0096]实施例2试剂盒的制备及方法、质量研究及应用
[0097] 2.1试剂盒之胶体金检测试纸条
[0098] 2.1.1试剂盒之胶体金检测试纸条的制备及应用
[0099] 试剂盒包括胶体金检测试纸条、样品处理液(即含2%CHAPS的pH7.4的磷酸盐缓冲 液)、样品处理管、样品保存液,样品保存液(即PH7.4的磷酸盐缓冲液)在样品保存瓶中,其 中胶体金检测试纸条的制备如下:
[0100] 按照中国CN101614737A建立的胶体金制备方法制备胶体金溶液,并分别标记单克 隆抗体2(实施例1制备的抗犬瘟热病毒单克隆抗体1G5,用pH7.4磷酸盐缓冲液稀释至标记 浓度为350iig/ml)、单克隆抗体4(抗犬副流感病毒单克隆抗体4C9D8,标记浓度为400yg/ ml)、单克隆抗体6(抗犬腺病毒I型单克隆抗体E9,标记浓度为450iig/ml)、单克隆抗体8(抗 犬腺病毒II型单克隆抗体4H1-A7,标记浓度为450μg/ml),单克隆抗体1 (实施例1制备的抗 犬瘟热病毒单克隆抗体6E11,固定包被浓度为180iig/ml)、单克隆抗体3(抗犬副流感病毒单 克隆抗体4F3B6,用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释至固定浓度为200iig/ml)、单克隆抗体5(抗犬 腺病毒I型单克隆抗体G3,用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释至固定浓度为220iig/ml)和/或 Santa公司的单克隆抗体7(抗犬腺病毒II型单克隆抗体anti-CAV-2-Santa,用pH7.4的磷酸 盐缓冲液稀释至固定浓度为210μg/ml),以及羊抗鼠二抗(即羊抗鼠IgG,购自Sigma公司)喷 涂固定在硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线,将该硝酸纤维素膜和浸润有胶体金标 记的单克隆抗体2、单克隆抗体4、单克隆抗体6和/或单克隆抗体8的金标垫用塑料外壳包装 起来,做成胶体金检测试纸条。
[0101] 其中,当检测线固定的单克隆抗体从左到右依次为单克隆抗体1、3时作为胶体金 检测试纸条1;当检测线固定的单克隆抗体从左到右依次为单克隆抗体1、3、5时作为胶体金 检测试纸条2;当检测线固定的单克隆抗体从左到右依次为单克隆抗体1、3、5、7时作为胶体 金检测试纸条3。
[0102] 检测时,将样品与样品处理液混合,将2-3滴(约80yl)混合液滴加于胶体金检测试 纸条的加样孔处,同时迅速按下缓冲液按钮,静置30分钟后在检测试纸条的检测区观察记 录结果。结果判定标准:若质控线显色即试验成立,检测线显色即可判为阳性,检测线不显 色即可判为阴性;若质控线未显色即试验不成立,无论检测线是否显色,均则判定为无效结 果,需重测。
[0103] 2.1.2胶体金检测试纸条的质量研究
[0104] 灵敏度检验:将犬瘟热病毒CVCC AV299株(购自北京普天同创生物科技有限公司) 病毒液105'5TCID 5Q做梯度稀释,稀释后的浓度依次为他气他^他允他^如^将犬副流 感病毒Cornell株(源自Nobivaf)病毒液 1〇6'5tcid5〇作梯度稀释,稀释浓度依次为1〇4'5、 10 4'Q、103'5、103' Q、102'5;将犬腺病毒 I 型 H株(参见中国专利 CN101914502A)病毒液 106'qTCID50 作梯度稀释,稀释浓度依次为1〇3'5、1〇3'1〇2' 5、1〇2'1〇1'5;将犬腺病毒11型426株(即 Toronto A26/61 株或ATCC VR-800株,参见文献Darai G,Rosen A,DepI-Hs H,Flugel RM.Characterization of the DNA of canine adenovirus byrestriction enzyme analysis. Intervirology,1985,23(1) :23_28)病毒液 105'QTCID5〇做浓度稀释,稀释度依次 为104' ()、103'5、103'()、10 2'5、102'()。然后分别用胶体金检测试纸条1、2、3对各病毒进行检测,以 确定胶体金检测试纸条1、2、3对各种病毒的检测下限。结果表明:胶体金检测试纸条1、2、3 对⑶V的检测下限均为10 2'5TCID5Q/ml,胶体金检测试纸条1、2、3对CPIV的检测下限均为 10 3'5TCID5Q/ml,胶体金检测试纸条2、3对CAV-1的检测下限均为10 3'5TCID5Q/ml (针对CAV-1 的检测在l〇2'6TCID5Q/ml检测结果为阴性,因此尽管其在10 3'2TCID5Q/ml含量时检测结果为 阳性,仍将检测下限定为l〇 3'5TCID5Q/ml),胶体金检测试纸条3对CAV-2的检测下限为 10 3-0TCID5〇/ml〇
[0105] 特异性测定:用胶体金检测试纸条1、2、3分别检测犬源其它病毒,包括犬细小病 毒、狂犬病毒、犬支气管败血波氏杆菌,结果均为阴性,说明试纸条1、2、3特异性均良好。
[0106] 重复性试验:分别取胶体金检测试纸条1、2、3,每批各抽15条,分别检测试纸条上 检测线固定单克隆抗体对应的靶标病毒溶液各5次,如胶体金检测试纸条1检测CDV、CPIV, 结果:各相应样品检测均为阳性,且试纸条间显色强度一致,表明重复性良好。
[0107] 保存期研究:分别将胶体金检测试纸条1、2、3按照以下要求进行检测,将三个连续 批号试纸条分别于37°C放置6天后进行热稳定性试验;将试纸条在2-8°C分别存放6个月、9 个月、12个月和15个月,进行试纸条的实时稳定性试验。对不同保存条件的试纸条进行质控 品检验。质控品为病毒含量为10 3'102'101、(:105()/1111的〇^(^〇^¥299株病毒液,病毒含 量含10 4'5、103'5、102' 51'(:105()/1111的〇?1¥(:〇^1611株病毒液,病毒含量为103' 5、102'5、 IOUtCIDm的CAV-1H株病毒液,病毒含量为104'Q、103' Q、102'QTCID5QCAV-2A26株病毒液,重复 检测3次。试纸条1、2、3分别各检测3次的结果均为阳性且同一试纸条间显色强度一致,表明 试纸条1、2、3在37°C条件下保存可贮存6天,在2-8°C规定条件下保存可贮存15月,表明试纸 条的保存期至少均可达12个月。
[0108] 2.1.3样品检测及比对试验
[0109] 将CDV CVCC AV299株、CPIV Cornell株、CAV-1H株、CAV-2A26株用pH7.4磷酸盐缓 冲液配制成10份已知病毒的混合溶液(即样品1-10),分别经实施例2.1.1制备的胶体金检 测试纸条1、2、3进行检测,检测结果见表3-5。
[0110] 将采集的1〇份临床样品(即样品11-20)即微生物拭子(约含样品100mg)插入到样 品处理管中,使样品尽可能溶解在样品处理液(即pH7.4的磷酸盐缓冲液)中,最后使微生物 拭子头这段留于管中;然后将含有临床样品的样品处理管盖子头部折断,滴加2-3滴混匀后 的样品(约80yl)至胶体金检测试纸条加样孔中心;10分钟后在胶体金检测试纸条的检测区 观察,根据结果判定标准记录结果(见表3-5)。
[0111] 同时,将20份样品按照中国专利CN102618666A对CDV、CPIV、CAV-l、CAV-2进行RT-pCR检测,同时分别用Bi 0n0te犬瘟热病毒抗原快速检测试剂盒(购自韩国安捷公司,参照试 剂盒参考说明书进行操作)、犬副流感病毒检测卡(购自上海快灵生物科技有限公司)、犬腺 病毒I型检测卡(购自上海快灵生物科技有限公司)、犬腺病毒n型检测卡(购自上海快灵生 物科技有限公司)进行对比检测,结果见表3-5。
[0112] 表3胶体金检测试纸条1、酶免疫层析检测试纸条1检测及与现有技术比对结果
[0114]表4胶体金检测试纸条2、酶免疫层析检测试纸条2检测及与现有技术比对结果
[0116]表5胶体金检测试纸条3、酶免疫层析检测试纸条3检测及与现有技术比对结果
[0118]
[0119] 注:样品1-10为病毒液,样品11-20为临床样品;"+"表示检测结果为阳性,表示 检测结果为阴性,7"表示临床粪便样品;金标1、2、3依次表示胶体金检测试纸条1、2、3,酶 免1、2、3依次表示酶免疫层析检测试纸条1、2、3。
[0120] 由表3可知:胶体金检测试纸条1可同时检测⑶V、CPIV两种病毒,并且胶体金检测 试纸条1检测CDV的结果略低于RT-PCR的检测结果比,优于韩国安捷CDV试剂盒的检测结果; 检测CPIV的结果也略低于RT-PCR的检测结果,优于上海快灵CPIV检测卡的检测结果。
[0121] 由表4可知:胶体金检测试纸条2可同时检测⑶V、CPIV、CAV-1三种病毒,并且胶体 金检测试纸条2检测CDV的结果与胶体金检测试纸条1的结果相当,略低于RT-PCR的检测结 果,优于韩国安捷试剂盒的检测结果;检测CPIV的结果与胶体金检测试纸条1的结果相当, 略低于RT-PCR的检测结果,优于上海快灵CPIV的检测结果;检测CAV-1的结果略低于RT-PCR 的检测结果,优于上海快灵CAV-1的检测结果。
[0122] 由表5可知:胶体金检测试纸条3可同时检测⑶¥、0?1¥、04¥-1、0六¥-2四种病毒,并 且胶体金检测试纸条3检测CDV的结果与胶体金检测试纸条1、2的结果相当,略低于RT-PCR 检测结果相当,优于韩国安捷试剂盒的检测结果;检测CPIV的结果与胶体金检测试纸条1、2 的结果相当,略低于RT-PCR的检测结果,优于上海快灵CPIV检测卡的检测结果;检测CAV-1 的结果与胶体金检测试纸条2的结果相当,略低于RT-PCR的检测结果,优于上海快灵CVA-1 检测卡的检测结果;检测CAV-2的结果略低于RT-PCR的检测结果,优于上海快灵CVA-2检测 卡的检测结果。
[0123] 2.2试剂盒之酶免疫层析检测试纸条的制备及应用
[0124] 2.2.1试剂盒之酶免疫层析检测试纸条的制备
[0125] 试剂盒包括酶免疫层析检测试纸条、样品处理液(即含2%CHAPS的pH7.4的磷酸盐 缓冲液)、样品处理管、样品保存液,样品保存液(即PH7.4的磷酸盐缓冲液)在样品保存瓶 中,其中酶免疫层析检测试纸条的制备如下:
[0126] 按照中国CN104062430A制备酶免疫层析检测试纸条,先将单克隆抗体2(实施例1 制备的抗犬瘟热病毒单克隆抗体1G5,用pH7.4磷酸盐缓冲液稀释至标记浓度为350iig/ml)、 单克隆抗体4(抗犬副流感病毒单克隆抗体4C9D8,标记浓度为400iig/ml)、单克隆抗体6(抗 犬腺病毒I型单克隆抗体E9,标记浓度为450iig/ml)、单克隆抗体8(抗犬腺病毒II型单克隆 抗体4H1-A7,标记浓度为450iig/ml)分别用辣根过氧化物酶HRP进行标记,将单克隆抗体1 (实施例1制备的抗犬瘟热病毒单克隆抗体6E11,固定包被浓度为180μg/ml)、单克隆抗体3 (抗犬副流感病毒单克隆抗体4F3B6,用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释至固定浓度为200yg/ ml)、单克隆抗体5(抗犬腺病毒I型单克隆抗体G3,用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释至固定浓度 为220邱/1111)和/或单克隆抗体7(抗犬腺病毒11型单克隆抗体 &1^1-04¥-2-3&1^&,用口117.4 的磷酸盐缓冲液稀释至固定浓度为210iig/ml),以及羊抗鼠二抗(即羊抗鼠IgG,购自Sigma 公司)喷涂固定在硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线,将该硝酸纤维素膜和浸润有 酶标记的单克隆抗体2、单克隆抗体4、单克隆抗体6和/或单克隆抗体8的酶标垫用塑料外壳 包装起来,做成酶免疫层析检测试纸条。
[0127] 其中,当检测线固定的单克隆抗体从左到右依次为单克隆抗体1、3时作为酶免疫 层析检测试纸条1,如图2(1)所示;当检测线固定的单克隆抗体从左到右依次为单克隆抗体 1、3、5时作为酶免疫层析检测试纸条2,如图2(2)所示;当检测线固定的单克隆抗体从左到 右依次为单克隆抗体1、3、5、7时作为酶免疫层析检测试纸条3,如图2(3)所示。
[0128] 检测时,将样品与样品处理液混合,将2-3滴(约80yl)混合液滴加于酶免疫层析检 测试纸条的加样孔处,同时迅速按下缓冲液按钮,静置30分钟后在检测试纸条的检测区观 察记录结果。结果判定标准:若质控线显色即试验成立,检测线显色即可判为阳性,检测线 不显色即可判为阴性;若质控线未显色即试验不成立,无论检测线是否显色,均则判定为无 效结果,需重测。
[0129] 2.2.2酶免疫层析检测试纸条的质量研究
[0130] 灵敏度检验:将实施例2.1制备的含CVCC AV299株的不同浓度病毒溶液、含CPIV Cornell株的不同浓度病毒溶液、含CAV-1H株的不同浓度病毒溶液和/或含CAV-2A26株的不 同病毒液的混合溶液,然后分别用酶免疫层析检测试纸条进行检测,分别确定酶免疫层析 检测试纸条1、2、3对各种病毒的检测下限。结果,酶免疫层析检测试纸条1、2、3对CDV的检测 下限均为H^TCIDM/ml;酶免疫层析检测试纸条1、2、3对CPIV的检测下限均为H^TCIDm/ ml;酶免疫层析检测试纸条2、3对CAV-1的检测下限均为lO^TCIDso/ml;酶免疫层析检测试 纸条3对CAV-2的检测下限均为10 2 ? 5TCID5Q/ml。
[0131] 特异性测定:用酶免疫层析检测试纸条1、2、3分别检测犬源其它病毒,包括犬细小 病毒、狂犬病毒、犬支气管败血波氏杆菌,结果均为阴性,说明试纸条1、2、3特异性均良好。
[0132] 重复性试验:取酶免疫层析检测试纸条1、2、3,各抽15条,分别检测试纸条上检测 线固定单克隆抗体对应的靶标病毒溶液各5次,如酶免疫层析检测试纸条1检测CDV、CPIV, 结果,各相应样品检测均为阳性,且试纸条间显色强度一致,表明重复性良好。结果,试纸条 1、2、3的检测结果均为阳性,且显色强度一致,表明重复性良好。
[0133] 保存期研究:分别将酶免疫层析检测试纸条1、2、3按照以下要求进行检测,将三个 连续批号试纸条分别于37°C放置6天后进行热稳定性试验;将试纸条在2-8°C分别存放6个 月、9个月、12个月和15个月,进行试纸条的实时稳定性试验。对不同保存条件的试纸条进行 质控品检验,质控品为病毒含量为10 3'102'5、101、(:105()/1111的〇^(^〇^¥299株病毒液,病 毒含量含1〇 4'5、1〇3'5、1〇2' 51'(:105()/1111的0?1¥0^11611株病毒液,病毒含量为103' 5、102'5、 IOUtCIDm的CAV-1H株病毒液,病毒含量为104'Q、103' Q、102'QTCID5QCAV-2A26株病毒液,重复 检测3次。试纸条1、2、3分别各检测3次的结果均为阳性且同一试纸条间显色强度一致,表明 试纸条1、2、3在37°C条件下保存可贮存6天,在2-8°C规定条件下保存可贮存15月,表明试纸 条的保存期至少均可达12个月。
[0134] 2.2.3样品检测及比对试验
[0135] 将2~3滴(约80yl)实施例2.1制备的20份样品滴加于酶免疫层析检测试纸条的加 样孔处,同时迅速按下缓冲液按钮,静置30分钟后在酶免试纸条的检测区观察,根据结果判 定标准记录各检测结果。
[0136] 由表3可知:酶免疫层析检测试纸条1可同时检测CDV、CPIV两种病毒,并且酶免疫 层析检测试纸条1检测CDV的结果与RT-PCR的检测结果相当,优于胶体金检测试纸条1、2、3 以及韩国安捷试剂盒的检测结果;检测CPIV的结果与RT-PCR的检测结果相当,优于胶体金 检测试纸条1、2、3以及上海快灵CPIV检测卡的检测结果。
[0137] 由表4可知:酶免疫层析检测试纸条2可同时检测⑶V、CPIV、CAV_1三种病毒,并且 酶免疫层析检测试纸条2检测CDV的结果与酶免疫层析检测试纸条1的结果相当,与RT-PCR 的检测结果相当,优于胶体金检测试纸条1、2、3及韩国安捷试剂盒的检测结果;检测CPIV的 结果与RT-PCR的检测结果相当,优于胶体金检测试纸条1、2、3以及上海快灵CPIV检测卡的 检测结果;检测CAV-1的结果与RT-PCR的检测结果相当,优于胶体金检测试纸条2、3以及上 海快灵CPIV检测卡的检测结果。
[0138] 由表5可知:酶免疫层析检测试纸条3可同时检测0^、0?1¥、04¥-1、04¥-2四种病 毒,并且酶免疫层析检测试纸条3检测CDV的结果与酶免疫层析检测试纸条1、2的结果相当, 与RT-PCR的检测结果相当,优于胶体金检测试纸条1、2、3以及韩国安捷试剂盒的检测结果; 检测CPIV的结果与酶免疫层析检测试纸条1、2的结果相当,与RT-PCR的检测结果相当,优于 胶体金检测试纸条1、2、3以及上海快灵CPIV检测卡的检测结果;检测CAV-1的结果与酶免疫 层析检测试纸条2的结果相当,与RT-PCR的检测结果相当,优于胶体金检测试纸条2、3以及 上海快灵CAV-1的检测结果;检测CAV-2的结果与RT-PCR的检测结果相当,优于胶体金检测 试纸条3以及上海快灵CVA-2检测卡的检测结果。
[0139] 综上所述,本发明制备的胶体金检测试纸条、酶免疫层析检测试纸条可同时检测 两种、三种或四种病毒胶体金检测试纸条优于现有技术中的其他胶体金检测试纸,酶免疫 层析检测试纸条与PCR检测灵敏度相当。
[0140]以上所述仅为本发明的具体实施例,本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉 本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案的范围内,当可利用上述揭示的技术内容作 出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据 本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明 技术方案的范围内。
【主权项】
1. 一种试剂盒,所述试剂盒包括有效量的抗犬瘟热病毒单克隆抗体I、2和有效量的抗 犬副流感病毒单克隆抗体3、4,以及对抗原抗体反应进行检测的检测试剂; 其中,所述单克隆抗体1为抗犬瘟热病毒单克隆抗体6E11,所述单克隆抗体2为抗犬瘟 热病毒单克隆抗体1G5;以及 所述抗犬副流感病毒单克隆抗体3、4分别选自4F3B6、4C9D6、5B4C9、4G7F4中的两种,且 所述抗犬副流感病毒单克隆抗体3、4能与犬副流感病毒同时发生抗原抗体反应。2. 根据权利要求1所述试剂盒,其中,所述单克隆抗体3为抗犬副流感病毒单克隆抗体 4F3B6、所述单克隆抗体4为抗犬副流感病毒单克隆抗体4C9D8。3. 根据权利要求1或2所述试剂盒,其中,所述试剂盒进一步含有有效量的抗犬腺病毒I 型单克隆抗体5、6,和/或有效量的抗犬腺病毒Π 型单克隆抗体7、8, 其中,所述抗犬腺病毒I型单克隆抗体5、6分别选自C8、E9、G3、C2、H2、2E10-H2中的两 种,且所述抗犬腺病毒I型单克隆抗体5、6能与犬腺病毒I型同时发生抗原抗体反应;以及 所述抗犬腺病毒Π 型单克隆抗体7为Santa公司的anti-CAV-2-Santa、单克隆抗体8为 4H1-A7; 优选地,所述单克隆抗体5为抗犬腺病毒I型单克隆抗体G3,所述单克隆抗体6为抗犬腺 病毒I型单克隆抗体E9。4. 根据权利要求1~3任一项所述试剂盒,其中,所述单克隆抗体1、3、5、7的含量各自分 别为25-1 OOOμg/ml,所述单克隆抗体2、4、6、8的含量各自分别为50-2000μg/ml。5. 根据权利要求1~3任一项所述试剂盒,其中,所述试剂盒进一步包括洗涤液、稀释 液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照。6. 根据权利要求1~3任一项所述试剂盒,其中,所述单克隆抗体1、单克隆抗体3固定于 固相上,所述固相包括微滴定板、磁颗粒、乳胶颗粒、硝酸纤维素膜;优选地,所述单克隆抗 体1、单克隆抗体3、单克隆抗体5和/或单克隆抗体7固定于固相上,所述固相包括微滴定板、 磁颗粒、乳胶颗粒、硝酸纤维素膜。7. 根据权利要求1~3任一项所述试剂盒,其中,所述对抗原抗体反应进行检测的检测 试剂包括酶显色检测试剂、胶体金检测试剂、荧光检测试剂、化学发光检测试剂或同位素检 测试剂。8. 根据权利要求1~3任一项所述试剂盒,其中,所述试剂盒包括胶体金检测试纸条,所 述胶体金检测试纸条包括底板,所述底板具有第一端和第二端,并且沿所述第一端向第二 端的方向,所述底板上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述金标垫上 含有胶体金标记的所述单克隆抗体2、胶体金标记的所述单克隆抗体4,所述硝酸纤维素膜 上有两条检测线和一条质控线,所述检测线依次固定有单克隆抗体1、单克隆抗体3所述质 控线上有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗; 优选地,所述试剂盒还包括有效量的抗犬腺病毒I型单克隆抗体5、6和/或有效量的抗 犬腺病毒II型单克隆抗体7、8,所述试剂盒的所述金标垫上进一步包括含有胶体金标记的 所述单克隆抗体6和/或胶体金标记的单克隆抗体8,所述硝酸纤维素膜上有三条或四条检 测线,所述检测线依次固定有单克隆抗体1、单克隆抗体3、单克隆抗体5和/或单克隆抗体7。9. 根据权利要求1~3任一项所述的试剂盒,其中,所述试剂盒包括缓冲液供应单元和 酶免疫层析检测试纸条;所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸 条;所述酶免疫层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜(I),所述酶免疫层析检测试纸条在纵向 上依次包括底物供应区、样品供应区、检测区;所述底物供应区包括底物垫(3),其上吸附有 干燥的酶底物,所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜(1)接触,当所述缓冲液供应单元向所述酶 免疫层析检测试纸条供给缓冲液,所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距 所述缓冲液供应单元的远端迀移;所述样品供应区包括酶标垫(2),其上吸附有酶标记的所 述单克隆抗体2、所述单克隆抗体4,所述酶底物能与所述单克隆抗体2、所述单克隆抗体4上 标记的酶产生显色反应,所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触,所述单克隆抗体2、所述 单克隆抗体4溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迀移; 以及所述检测区依次固定化有所述单克隆抗体1、所述单克隆抗体3;其中,所述缓冲液供应 单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮,所述底物缓冲液 (9)放置于底物缓冲液槽(8)中,所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方,按下所述按 钮可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中;所述检测区包括检测线(6)、质控线(7),其中, 所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区,在所述检测线(6)分别固定化有所述 单克隆抗体1、所述单克隆抗体3,在所述质控线(7)固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗,且 吸附在酶标垫(2)上的所述酶标记的单克隆抗体2、单克隆抗体4分别对于固定在检测线(6) 的所述单克隆抗体1、所述单克隆抗体3而言是过量的;所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附在所 述支撑物(10)上,支撑物(10)连接所述缓冲液供应单元,底物供应区,样品供应区,检测区 以及吸水垫(4),所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端;以及检测样品(11)加 入的位置为所述酶标垫(2)的位置; 优选地,所述试剂盒的酶标垫(2),其上吸附有酶标记的所述单克隆抗体2、所述单克隆 抗体4、所述单克隆抗体6和/或所述单克隆抗体8,所述酶底物能与所述单克隆抗体2、所述 单克隆抗体4、所述单克隆抗体6和/或所述单克隆抗体8上标记的酶产生显色反应,所述酶 标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触,所述单克隆抗体2、所述单克隆抗体4、所述单克隆抗体6 和/或所述单克隆抗体8溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的 远端迀移;以及所述检测区依次固定化有所述单克隆抗体1、所述单克隆抗体3、所述单克隆 抗体5和/或所述单克隆抗体7;且吸附在酶标垫(2)上的所述酶标记的单克隆抗体2、单克隆 抗体4、所述单克隆抗体6和/或所述单克隆抗体8分别对于固定在检测线(6)的所述单克隆 抗体1、所述单克隆抗体3、所述单克隆抗体。10.-种根据权利要求1~9任一项所述试剂盒在用于非诊断目的的犬瘟热病毒、犬副 流感病毒检测中的应用;优选地,所述试剂盒在用于非诊断目的的犬瘟热病毒、犬副流感病 毒、犬腺病毒I型和/或犬腺病毒Π 型检测中的应用; 所述非诊断目的包括流行病学分析、对离体组织进行定性和定量检测、表位鉴定研究 以及定性和定量鉴别检验含所述犬瘟热病毒、犬副流感病毒的全病毒抗原的疫苗组合物中 的全病毒抗原,或定性和定量鉴别检验含犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型和/或犬 腺病毒Π 型的全病毒抗原的疫苗组合物中的全病毒抗原。
【文档编号】G01N33/577GK105891491SQ201610221785
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】田克恭, 王莹
【申请人】洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司
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