用于检测α1-微球蛋白(AMG)的胶体金免疫比色法试剂盒及其制备方法
【专利摘要】一种检测或监测α1-微球蛋白(AMG)的胶体金免疫比色法试剂盒及其制备方法，本发明属于体外诊断试剂领域，用于判断个体急性肾损伤的情况是否出现。本方法是以胶体金颗粒为载体，将α1-微球蛋白(以下均简称为AMG)抗体与胶体金颗粒进行偶联，在相应的检测装置内，使样品中的AMG蛋白与偶联后的金颗粒接触，形成抗原-抗体-金复合物，造成金颗粒在检测波长下吸光度的改变，并且吸光度的改变量与AMG蛋白浓度程正相关，进而达到检测样本中AMG蛋白的目的。本试剂盒并且具备较高的分析灵敏度。
【专利说明】用于检测a 1-微球蛋白（AMG)的胶体金免疫比色法试剂盒 及其制备方法 发明领域
[0001] 本发明属于体外诊断试剂领域，具体涉及用于检测a 1-微球蛋白（AMG)的胶体金 免疫比色法试剂盒 技术背景
[0002] a 1-微球蛋白（alpha-1-microglobulin，a 1-MG 或 AMG)是人体内的一种相对 分子量较小的糖蛋白，又称人复合蛋白（humancomplex-Formingprotein，HCprotein)，由 Ekstrom等于20世纪70年代初首先从镉中毒患者的尿液中分离、提纯，因电泳时位于a 1 区带故而得名。近几年来国内外有关a 1-MG的生物学特性、检测及临床应用的研究日益增 多，发现a 1-MG的测定对各种肾脏疾病有重要价值。
[0003] 现代研究表明，a 1-MG是由人体的肝脏和淋巴细胞合成，分子量约为33000道尔 顿的糖蛋白。它由167个氨基酸组成.与人类白细胞抗原HLA-A 11，HLA-B20和HLA-51等 抗原决定簇有交叉反应。
[0004] a 1-MG广泛存在于人体各种体液及淋巴细胞膜表面，血液中的a 1-MG以两种形 式存在，即游离的a 1-MG和与IgA结合的a l-MG(a lMG-IgA)。正常情况下，a lMG-IgA约 占血液中总a 1-MG的40-70%，血液中免疫球蛋白水平对a 1-MG及a lMG-IgA之间的比例 有影响。血液中游离的a 1-MG可自由通过肾小球滤过膜，95%-99%在肾近曲小管重吸收 和代谢，只有微量从终尿排出；而结合型的a 1-MG则不能通过肾小球，其在尿液中的浓度 为零。
[0005] 在现代临床研究中发现，对于原发性肾病患者中，血、尿a 1-MG可以分别作为肾 小球、肾小管早期功能损害的指标。通过监测血、尿a 1-MG的含量，并结合病理学检查发现 a 1-MG在血、尿中的水平与肾功能的恶化有明显的相关性，a 1-MG的含量在反映肾脏病理 变化的过程中具有高度的敏感性。
[0006] 另外在风湿性疾病的检测中a 1-MG也是一个较为重要的指标，由于自身免疫系 统的病变，会造成免疫系统攻击自身脏器，而肾脏最早被累及，对于及时发现自身免疫系统 的疾病，对阻止肾功能的衰竭具有较好的临床意义。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的问题是进一步提高检测人体液样本中AMG蛋白含量的分析灵 敏度，提供一种特异性好，灵敏度高的分析AMG蛋白的胶体金匀相免疫比色试剂盒，可以用 于精确测定体液样本中0_200mg/L的AMG蛋白含量。另外本发明还在于提供一种关于AMG 蛋白检测试剂盒的制备方法。
[0008] 为了解决上述问题，本发明采用胶体金匀相免疫反应法，检测体液样本中的AMG 蛋白含量。标记AMG抗体的胶体金颗粒在540nm处有最大吸收峰，当环境中存在AMG蛋白 时，会形成抗原-抗体-金复合物，而此时540nm处的最大吸收峰将随着样本浓度的升高而 减弱，且660nm处的最大吸收峰将随之增加。通过检测并计算540nm吸光度的减少和660nm 吸光度的增加，与已知浓度的样本相联系，进而形成校准曲线，从而即可达到定量测量体液 样本中AMG蛋白的含量。
[0009] 本发明的主要技术路线如下：
[0010] -种关于AMG检测胶体金匀相免疫检测试剂盒，其主要的目的是用于检测人个体 体液样本中AMG蛋白的含量，本发明试剂盒中主要由用于形成校准曲线的已知AMG蛋白的 校准品（AMG校准品），反应缓冲液试剂（试剂1)，胶体金标记物试剂（试剂2)三部分组成。 其中AMG校准品是由校准品稀释液和AMG蛋白按照一定比例配制成不同浓度梯度，其浓度 范围为〇mg/L-200mg/L，反应缓冲液试剂是由磷酸盐和牛血清白蛋白配制而成的能够提供 本发明所需要的免疫学反应的且具有pH缓冲能力的溶液，胶体金标记物试剂是由金标记 的抗人源AMG蛋白的抗体和悬浮标记物的缓冲液组成。
[0011] 首先，根据试剂盒检测需要制备主吸收峰为450nm± 10nm的胶体金颗粒。
[0012] 其次配制试剂1，其主要组成应为50mM PBS pH8. 0溶液，其中溶解有 PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白等多聚物或生物大分子中的一种物质或两种 及其以上，并且控制pH值应在7. 0-9. 0之间。
[0013] 第三配制试剂2,其主要组成应为50mM PBS pH8. 0溶液，其中溶解有 PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐温20,牛血清白蛋白和Triton X-100等多聚物或生物大分 子中的一种物质或两种及其以上，并且控制pH值应在7. 0-9. 0之间。将标记AMG抗体后的 金颗粒浓缩，并用此步骤配制的溶液复悬。用去离子水或超纯水稀释复悬后胶体金标记物 试剂（试剂2) 50倍后，并以去离子水或超纯水做空白，在540nm± 10nm处的检测吸光度，若 吸光度在〇. 2000Abs-0. 3000Abs的范围内，则认为试剂2中标记AMG抗体的金颗粒浓度合 格，若不符合上述要求，则进一步调整试剂2中金颗粒浓度，直至符合要求。
[0014] 最终使用时，将AMG校准品（或样本），试剂1和试剂2按照一定的比例和次序混 合，检测吸光度的变化，即可反应出样本中待检测的AMG含量。
[0015] 使用本发明方法，具有高灵敏度特性，可以分析AMG含量在200mg/L以下的样本。 本发明可以同时用于检测不同基质的体液样本，如血清，血浆，尿液中AMG蛋白的含量，不 需要对样本或试剂做其它技术处理，包括增加或减少测试样本量，增大或降低试剂1和试 剂2的比例，具备高灵敏度，高特异性，高准确度和良好的重复性等优点，适合于全自动生 化仪，半自动生化仪和紫外-可见光分光光度计使用。
[0016] 本发明主要目的在于提高对于人体液样本中AMG蛋白含量检测的特异性和分析 灵敏度，在本发明中通过控制标记物的反应条件和金颗粒的大小，以及合适的测量条件，从 而达到上述目的。
[0017] 具体而言，本发明可以提供一种高分析灵敏度的AMG检测试剂盒，其主要特性在 于在Omg/L-12. 5mg/L的范围内具备高分析灵敏度，在0mg/L-200mg/L的范围内具备较好的 线性，对于临床诊断而言具有较好的指导意义。其中试剂盒内包含的试剂1、试剂2和校准 品，以体积计算，校准品用量（或待测样本用量）为2uL-10uL，试剂1用量为200uL-250uL， 试剂2用量为50uL-100uL。
[0018] 本发明中所述的金颗粒大小应以最大吸收峰和吸收峰峰宽控制，通过调整氯金酸 与还原剂的比例，使制的胶体金颗粒的最大吸收峰在540nm±20nm范围内，优化条件使得 颗粒大小进一步得到控制，制的的胶体金颗粒的最大吸收峰在540nm± lOnm范围内，进一 步对实验条件优化，制的胶体金颗粒的最大吸收峰在540nm±5nm的范围内，此时胶体金颗 粒大小最为合适。
[0019] 本发明中所阐述的胶体金匀相试剂1和试剂2中，其缓冲液选用PBS缓冲液，pH 值控制在7. 0-9. 0间，进一步通过实验优化缓冲条件，pH值控制在7. 5-8. 5间，AMG蛋白 与标记的抗体反应较为合适，再进一步优化实验条件发现，pH控制在8.0±0.2时，AMG蛋 白与标记的抗体反应最为合适。并且在试剂1中所述的多聚物和生物大分子主要包括 PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白，并在其中加入含量约为0. 1% (质量体积比） 的叠氮钠。试剂2中所述的多聚物和生物大分子PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐温20,牛血 清白蛋白和Triton X-100,并在其中加入含量约为0.1% (质量体积比）的叠氮钠。在试 剂2中，标记后的抗体在试剂2中的含量以吸光度的方式进行控制，即将含有标记物的试剂 2用去离子水或超纯水稀释50倍以后，以去离子水或超纯水做空白（参比），检测540nm下 的吸光度应在〇. 20Abs-0. 25Abs范围内。试剂2中AMG抗体与胶体金的标记依靠金颗粒表 面带电对AMG抗体的吸附而完成。
[0020] 本发明中所叙述的用于检测或监测体液样本中AMG蛋白含量的试剂盒，其中包括 AMG蛋白校准品和校准品稀释液两部分组成。校准品稀释液由PBS缓冲液、牛血清白蛋白和 叠氮钠组成，其中PBS缓冲液控制pH值在7. 0-9. 0之间，优化后的pH控制在8. 0±0. 5,添 加牛血清白蛋白和叠氮钠的量为0. 1% -0. 5% (质量体积比）。校准品由校准品稀释液稀 释 AMG 蛋白纯品制成，含量为 Omg/L，12. 5mg/L，25mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L。
[0021] 本发明中采用胶体金匀相免疫比色法测定样本中的AMG蛋白的含量。标记有颗 粒均一，大小合适金颗粒的AMG抗体，与样本中的AMG蛋白，在缓冲液中形成AMG蛋白-抗 体-金具有三维结构的复合物，从而使原本金颗粒在540nm的吸光度减弱，并且在660nm处 的吸光度加强，通过将这种改变与校准品中已知的AMG蛋白浓度相对应，进而形成检测系 统的校准曲线，当未知AMG蛋白浓度的体液样本以同样的反应模式与标记物反应时，通过 计算上述吸光度的改变，对应校准曲线从而达到定量测量的目的。
【附图说明】
[0022] 图1本发明试剂与对照试剂线性验证结果，以稀释度为横坐标，以检测结果为纵 坐标作图，本发明试剂具有优于同类检测项目试剂盒线性的特点。
[0023] 图2本发明试剂与对照试剂校准曲线实验结果，样本中AMG蛋白含量每变化一个 浓度单位，本发明试剂的吸光度信号变化为对照试剂的约6. 5倍，本发明灵敏度明显优于 对照试剂。
[0024] 图3标记物沉降检测实验结果，本发明试剂标记物在40天内未发生明显沉降。
【具体实施方式】
[0025] 实施例
[0026] 本发明中若不做特殊说明，则表述含量的百分比浓度均表示质量体积比，即 g/100mL
[0027] 实施例1
[0028] AMG校准品的制备
[0029] 用重组人AMG蛋白（DAK0公司）溶于校准品稀释液（牛血清白蛋白0. 5%，叠氮 钠0. 1%，PBS缓冲液pH 8.0)制备出不同浓度梯度的校准品，采用九强AMG胶乳免疫比色 试剂盒检测配制校准品，每个浓度梯度检测3次，取检测结果的平均值，定值为Omg/L (校准 品稀释液，未添加 AMG 蛋白），12. 5mg/L，25mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L。
[0030] 反应缓冲试剂（试剂1)的制备
[0031] 取 80mL 50mM PBS pH8. 0 的缓冲液中加入 PEG6000-200005g，聚蔗糖-400 lg，牛 血清白蛋白〇. 5g，叠氮钠0. lg，最终用相应的缓冲液定容至100mL，并用0. 22um微孔滤膜过 滤，即制成反应缓冲试剂（试剂1)，其中PEG6000-200005 %，聚蔗糖-4001 %，牛血清白蛋白 0. 5%，叠氮钠 0. 1%。
[0032] 胶体金标记物试剂（试剂2)的制备
[0033] 胶体金标记物试剂（试剂2)的制备过程主要分为三部分，即标记物制备，空白缓 冲液的制备，标记物的复悬三个步骤。
[0034] 标记物的制备
[0035] 将市售的氯金酸和柠檬酸三钠溶解，并分别配制成1 %的水溶液，将1L的去离子 水或超纯水煮沸，接着加入10mL的氯金酸溶液保持沸腾约lmin后，加入10mL的柠檬酸三 钠溶液，随着时间的变化溶液再次沸腾，溶液颜色随之由明黄色转变为紫黑色，接着短时间 转为酒红色，之后保持沸腾l〇min后，冷却备用。
[0036] 将制备好的的胶体金溶液用浓度为20 % 1(20)3溶液调整pH值至8. 0后，按比例加 如一定体积的AMG抗体（DAK0公司），充分搅拌lh，即完成抗体的标记过程。
[0037] 抗体标记完成以后，可用10% NaCl溶液检查标记量是否合适，当按照1 : 10的体 积比例加入NaCl溶液后，当不出现黑色沉淀时的抗体最小用量，为最佳标记量。
[0038] 标记物空白缓冲液的制备
[0039] 取 80mL 50mM PBS pH8. 0 的缓冲液中加入 PEG6000-2000020g，聚蔗糖-400 5g，牛血清白蛋白0. 5g，叠氮钠0. lg，吐温20 lg，Triton X-100 lg，最终用相应的缓 冲液定容至100mL，并用0. 22um微孔滤膜过滤，即制成反应缓冲试剂（试剂1)，其中 PEG6000-2000020%，聚蔗糖-400 5%，牛血清白蛋白0.5%，叠氮钠0.1%，吐温20 1%， Triton X-100 1%〇
[0040] 标记物复悬
[0041] 将标记好的胶体金颗粒在6000rpm下离心40min，收集沉淀，之后用上述标记物空 白缓冲液复悬收集的沉淀，并将浓度按照本发明的权利要求（4)将标记物调整至合适的浓 度即可。
[0042] 线性验证
[0043] 1、取一例具有急性肾损伤表象的临床病人血清样本约2mL，向其中加入人源的 AMG蛋白纯品，制得一线性高值样本。
[0044] 2、选用市场上技术较为成熟的AMG蛋白胶乳微球比浊法试剂盒做对照试剂，在东 芝120FR全自动生化仪上录入胶乳比浊法对照试剂盒参数，并用其试剂盒配套校准品校准 其试剂，检测上述高值样本三次，已三次检测结果的均值196mg/L为最终定值结果。
[0045] 3、在东芝120FR全自动生化仪上，录入本发明的实验参数，并用已经校正的校准 品经行试剂校准。
[0046] 4、将上述的线性高值样本用生理盐水做倍比稀释，稀释比例为1/2,1/4,1/8， 1/16,1/32,1/64,与原线性高值样本组成一个梯度样本组。
[0047] 5、用上述对照试剂和本发明的试剂分别检测上述样本，每个试剂每个样本检测三 次，以三次结果均值最终的检测结果，然后比较本发明和再对照试剂的线性，结果表1和图 1所示。
[0048] 表1线性验证结果
[0050] 表1为线性实验结果数据统计，在本发明和对照试剂盒的检测范围内，将高值样 本倍比6次稀释，用对照试剂和本发明试剂分别检测
[0051] 分析灵敏度验证
[0052] 1、选用市场上技术较为成熟的AMG蛋白胶乳微球比浊法试剂盒做对照试剂，在东 芝120FR全自动生化仪上录入胶乳比浊法对照试剂盒参数，并用其试剂盒配套校准品校准 其试剂。
[0053] 2、在东芝120FR全自动生化仪上，录入本发明的实验参数，并用已经校正的校准 品经行试剂校准。
[0054] 3、比较两个试剂在12. 5mg/L以下浓度的校准点吸光度的变化，结果如表2和图2 所示。注：由于对照试剂与本发明试剂的检测原理不相同，所以在绘制图2时将对照试剂吸 光度变化做相反数处理。
[0055] 表2分析灵敏度实验结果
[0056]
[0057] 表2为分析灵敏度实验结果数据统计，实验样分析本发明试剂和对照试剂分析灵 敏度，
[0058] 标记物沉降监测
[0059] 由于标记物溶液为胶体溶液，所以在长时间静止放置后应验证其是否发生颗粒沉 降现象。本例目的在于验证本发明是否会存在标记物沉降现象。
[0060] 1、取两只50mL烧杯，用酸性重铬酸钾浸泡24小时后，用去离子水清洗干净，100°C 烘干处理4h。
[0061 ] 2、将对照试剂盒中的标记物试剂倒入其中一只烧杯中，将本发明试剂标记物倒入 另一只烧杯中，两只烧杯同时搅拌lh。
[0062] 3、用微量移液器在溶液表面2-5mm处分别吸取对照试剂和本发明试剂各60uL，并 用去离子水稀释只至3mL，震荡混合均匀。
[0063] 4、以去离子水作为参比，在540nm处检测两试剂标记物稀释后的吸光度，每个试 剂检测三次，以三次结果的均值，作为最终检测结果。
[0064] 5、将上述两只烧杯封口，2_8°C下静置每隔10天检测一次，重复上述步骤3和步骤 4,对比静置前后吸光度变化，实验结果如表3和图3所示。
[0065] 表3标记物沉降监测实验结果
[0067] 标记物对反应杯污染实验
[0068] 由于标记物溶液为金颗粒胶体溶液，所以会在反应杯表面存在吸附现象。本例在 于验证本发明试剂是否会出现吸附污染现象。
[0069] 取三只洁净的石英比色杯，以空气为参比，分别记录其在540nm处杯空白吸光度。
[0070] 1、用本发明试剂标记物装填比色杯至其3/5高度处，浸泡lh。
[0071] 2、取出标记物后，每只比色杯用去离子水反复清洗10次
[0072] 3、在每只比色杯中装填去离子水至比色杯4/5高度处，每隔lh换水一次，共换水 三次。
[0073] 4、自然晾干比色杯中的水分，以空气为参比，检测每只比色杯在540nm处吸光度。
[0074] 5、对于对照试剂标记物重复上述步骤1至步骤5操作，比较两试剂标记物是否会 对比色杯造成吸附污染，实验结果如表4所示。
[0075] 表4标记物对比色杯污染实验数据
[0076]
[0077] 根据实验结果分析，对照试剂标记物长时间放置于比色杯中会吸附至比色杯表 面，本发明试剂标记物在相同时间内未对比色杯有明显的吸附现象。
【主权项】
1. 一种AMG检测胶体金匀相免疫检测试剂盒，包括AMG校准品，反应缓冲液试剂，胶体 金标记物试剂，其特征在于一种匀相定量检测检体中AMG含量的基于胶体金比色法的体外 诊断试剂。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于AMG校准品是由校准品稀释液和AMG蛋 白按照比例配制成不同浓度梯度，其浓度范围为0mg/L-200mg/L，反应缓冲液试剂是由磷酸 盐与牛血清白蛋白配制而成的具有pH缓冲能力的溶液，胶体金标记物试剂是由金标记的 抗人源AMG蛋白的抗体和悬浮标记物的缓冲液组成。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于胶体金颗粒的主吸收峰为450nm± 10nm。4. 根据权利要求1-3所述的试剂盒，其特征在于反应缓冲液试剂是反应条件的控制性 溶液，包括50mM PBS pH8. 0溶液，PEG6000-20000,聚蔗糖400和牛血清白蛋白等多聚物或 生物大分子中的一种物质或两种及其以上，并且控制反应缓冲液试剂的PH值为7. 0-9. 0。5. 根据权利要求1-3所述的试剂盒，其特征在于胶体金标记物试剂是反应条件的控制 性溶液，包括50mM PBS pH8. 0溶液，PEG6000-20000,聚蔗糖400,吐温20,牛血清白蛋白和 Triton X-100等多聚物或生物大分子中的一种物质或两种及其以上，将标记AMG抗体后的 金颗粒悬浮于此溶液中，并且控制pH值应在7. 0-9. 0之间，组成胶体金标记物试剂。6. 根据权利要求5所述的AMG试剂盒，其特征在于中标记AMG抗体的金颗粒浓度合格 的依据为离子水或超纯水稀释胶体金标记物试剂50倍后，以去离子水或超纯水做空白，其 在540nm± IOnm处的吸光度的范围为0. 2000Abs-0. 3000Abs。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于反应体系溶液组成为校准液或样本、反 应缓冲液试剂和胶体金标记物试剂，其中样本量范围为2uL-20uL，反应缓冲液试剂的体积 应控制在2-10倍于胶体金标记物试剂的体积。8. 制备权利要求1-7任意一项所述的试剂盒，其特征在于AMG蛋白胶体金匀相检测试 剂盒的制备方法，包括以下几个步骤： 1) 将多聚物或生物大分子用去离子水或超纯水溶解，配制成反应缓冲液试剂。 2) 将氯金酸与还原剂按照一定比例混合，随之用去离子水或超纯水加热煮沸，制的主 吸收峰为450nm±10nm的胶体金颗粒。 3) 将待标记的AMG抗体与金颗粒相混合制成标记AMG抗体-金标记物。 4) 将制成的标记物与不含有金颗粒的胶体金标记物试剂按照一定比例混合，制成检测 试剂盒所需要的胶体金标记物试剂 5) 将市售的人源AMG蛋白按照所需浓度梯度，用校准品稀释液配制成浓度在Omg/ L-200mg/L范围内的校准品，用于在仪器上配合反应缓冲液试剂和胶体金标记物试剂形成 校准曲线，以达到定量检测的目的。
【文档编号】G01N33/68GK105891502SQ201510144084
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年3月31日
【发明人】郭成志, 王志新
【申请人】北京科美生物技术有限公司