稻米中四种真菌毒素的同时提取和净化方法
【专利摘要】本发明公开了一种稻米中四种真菌毒素的同时提取和净化方法，包括黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇，采用乙腈∶水为1∶1的提取体系，并在提取体系中加入复合型盐析试剂，所述的复合型盐析试剂包括氯化钠、无水硫酸镁、醋酸?醋酸钠缓冲溶液，采用中性氧化铝作为净化剂。本发明操作简便、高效，样品提取和净化简单，可批量测定，检测时间短，检测成本低，样品提取和净化用到的试剂和耗材均为实验室日常常见耗材，需要的有机试剂和有毒试剂少，大大减少了对操作人员和环境的污染，与液相色谱?串联质谱配置使用可实现稻米中四种毒素的快速、同时检测。
【专利说明】
稻米中四种真菌毒素的同时提取和净化方法
技术领域
[0001]本发明涉及农产品安全检测技术领域，尤其涉及稻米中四种真菌毒素的同时提取和净化方法。
【背景技术】
[0002]真菌毒素是产毒真菌分泌产生的次生代谢产物，对人和动物都有极大危害，农产品中已经发现的真菌毒素有很多，其中国家标准GB 2761-2011限量规定的真菌毒素有:黄曲霉毒素仏、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇四种；目前，国家标准(GBT18979-2003,GBT 5009.209-2008,GBT 23502-2009,GBT 23503-2009)检测方法对四种真菌毒素的提取方法不一样，不能同时提取四种毒素;另外，现有技术中，关于样品提取的方法，大多采用采用乙腈/甲醇:水(84:16或者80:20)的提取体系，而且乙腈或甲醇和水是同时加入的，有机试剂用量远高于水的用量;现行国家标准或者已经公开发表的文献，对于样品中的毒素提取后需要过免疫亲和柱净化并进行浓缩，用免疫亲和柱净化样品主要是去除样品提取溶液中的蛋白质和脂肪酸等杂质，但成本较高。
【发明内容】
[0003]本发明是为了解决现有农产品真菌毒素的提取中耗用较多有机物，环保要求高，以及净化成本高的不足，提供一种有机物用量少，对环境友好，简便、高效，检测的稳定性和精度较高，检测时间短，检测成本低的稻米中四种真菌毒素的同时提取和净化方法。
[0004]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案，稻米中四种真菌毒素的同时提取和净化方法，包括黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇，采用乙腈:水为1:1的提取体系，并在提取体系中加入复合型盐析试剂，所述的复合型盐析试剂包括氯化钠、无水硫酸镁、醋酸-醋酸钠缓冲溶液，采用中性氧化铝作为净化剂。
[0005]作为优选，包括如下步骤:I)取5.0-10.0g粉碎的均匀试样于50mL离心管中，加入10.0-20.0mL水，充分浸湿;2)充分浸湿之后加入10.0-20.0mL乙腈，在摇床上振摇I小时；3)加入5-10g无水硫酸镁、l-2g氯化钠和1.5-3.0mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH = 3.6)，用手剧烈振摇Imin; 4)将离心管溶液以4000转/分速度离心5min，使乙腈和水相分层;5)移取2.0mL上清液，加入10mg中性氧化招，用手剧烈振摇Imin，并以4000转/分速度离心5min; 6)准确吸取1.0mL净化后的上清液，定容至10.0mL，进高效液相色谱-串联质谱仪测定。将稻米粉碎后提取适量的试样(样品)进行测试，本方案提取体系是乙腈:水是50:50，而且水是提前加入的，相比现有的提取体系，本方案的优点一是所用有机试剂少，检测成本低，对环境友好，二是提前加水并充分浸湿样品，有利于增加毒素测定的回收率;复合型的盐析试剂(氯化钠和无水硫酸镁，醋酸-醋酸钠缓冲溶液)，其作用一是氯化钠、无水硫酸镁及酸性的醋酸-醋酸缓冲溶液可以沉淀样品中的主要干扰物质如蛋白质，二是用醋酸让样品中的脂肪酸变为酸性脂肪酸，三是让乙腈与水分层，四是让样品中的真菌毒素分配到乙腈层中，达到完全提取样品中真菌毒素的目的；中性氧化铝用以吸附试样提取液(上层乙腈)中的酸性脂肪酸；用国家标准即用免疫亲和柱净化样品，成本较高，通常测定一个样品中的4个毒素，需要800元以上，本方案的提取、净化方法，检测成本不超过50元，检测效率比过去提高约3倍，整个测定时间约需90分钟/样，而其他传统方法测定四种真菌毒素需要4-5小时。
[0006]作为优选，所述的步骤I中加入的水、步骤2中加入的乙腈与试样的体积质量比均为 2:1。
[0007]作为优选，所述的步骤3中加入的无水硫酸镁和氯化钠的质量比为5:1。
[0008]作为优选，所述的步骤3中加入的乙酸-乙酸钠缓冲溶液的pH值为3.6。
[0009]作为优选，所述步骤5中加入的中性氧化铝与移取上清液的质量体积比为50:1。
[0010]作为优选，所述的步骤6中获得的上清液，用甲醇甲酸混合液定容至10.0mL后用
0.22μπι有机滤膜过滤然后进高效液相色谱-串联质谱仪测定，所述的甲醇甲酸混合液中甲醇与甲酸的比例为40:60，其中甲酸为0.1 %甲酸溶液。
[0011]因此，本发明具有如下有益效果:(I)操作简便、高效，样品提取和净化简单，可批量测定，检测时间短；(2)检测成本低，样品提取和净化用到的试剂和耗材均为实验室曰常常见耗材；(3)需要的有机试剂和有毒试剂少，大大减少了对操作人员和环境的污染；(4)与液相色谱-串联质谱配置使用可实现稻米中四种毒素的快速、同时检测。
【具体实施方式】
[0012]下面对本发明做进一步的描述。
[0013]稻米中四种真菌毒素的同时提取和净化方法，包括黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素Α、脱氧雪腐镰刀菌烯醇，采用乙腈:水为1:1的提取体系，并在提取体系中加入复合型盐析试剂，复合型盐析试剂包括氯化钠、无水硫酸镁、醋酸-醋酸钠缓冲溶液，采用中性氧化铝作为净化剂；
[0014]具体实施过程是，包括如下步骤:
[0015]I)取6.0g粉碎的均勾试样于50mL离心管中，加入12.0mL水，充分浸湿；
[0016]2)充分浸湿之后加入12.0mL乙腈，在摇床上振摇I小时；
[0017]3)加入6g无水硫酸镁、I.2g氯化钠和I.8mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH= 3.6)，用手剧烈振摇lmin;
[0018]4)将离心管溶液以4000转/分速度离心5min，使乙腈和水相分层；
[0019]5)移取2.0mL上清液，加入10mg中性氧化铝，用手剧烈振摇lmin，并以4000转/分速度离心5min;
[0020]6)准确吸取1.0mL净化后的上清液，用甲醇+ 0.1 %甲酸溶液(40+60 )定容至
10.0mL，再用0.22μπι有机滤膜过滤后，进高效液相色谱-串联质谱仪测定；
[0021]其中，步骤I中加入的水、步骤2中加入的乙腈与试样的体积质量比均为2:1，步骤3中加入的无水硫酸镁和氯化钠的质量比为5:1。
【主权项】
1.稻米中四种真菌毒素的同时提取和净化方法，包括黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇，其特征在于，采用乙腈:水为1:1的提取体系，并在提取体系中加入复合型盐析试剂，所述的复合型盐析试剂包括氯化钠、无水硫酸镁、醋酸-醋酸钠缓冲溶液，采用中性氧化铝作为净化剂。2.根据权利要求1所述的稻米中四种真菌毒素的同时提取和净化方法，其特征是，包括如下步骤:I)取5.0-10.0g粉碎的均匀试样于50mL离心管中，加入10.0-20.0mL水，充分浸湿;2)充分浸湿之后加入10.0-20.0mL乙腈，在摇床上振摇I小时;3)加入5_10g无水硫酸镁、l_2g氯化钠和1.5-3.0mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用手剧烈振摇lmin;4)将离心管溶液以4000转/分速度离心5min，使乙腈和水相分层； 5)移取2.0mL上清液，加入10mg中性氧化铝，用手剧烈振摇lmin，并以4000转/分速度离心5min;6)准确吸取1.0mL净化后的上清液，定容至10.0mL，进高效液相色谱-串联质谱仪测定。3.根据权利要求2所述的稻米中四种真菌毒素的同时提取和净化方法，其特征是，所述的步骤I中加入的水、步骤2中加入的乙腈与试样的体积质量比均为2:1。4.根据权利要求2所述的稻米中四种真菌毒素的同时提取和净化方法，其特征是，所述的步骤3中加入的无水硫酸镁和氯化钠的质量比为5:1。5.根据权利要求2所述的稻米中四种真菌毒素的同时提取和净化方法，其特征是，所述的步骤3中加入的乙酸-乙酸钠缓冲溶液的pH值为3.6。6.根据权利要求2所述的稻米中四种真菌毒素的同时提取和净化方法，其特征是，所述步骤5中加入的中性氧化铝与移取上清液的质量体积比为50:1。7.根据权利要求2所述的稻米中四种真菌毒素的同时提取和净化方法，其特征是，所述的步骤6中获得的上清液，用甲醇甲酸混合液定容至10.0mL后用0.22μπι有机滤膜过滤然后进高效液相色谱-串联质谱仪测定，所述的甲醇甲酸混合液中甲醇与甲酸的比例为40:60，其中甲酸为0.1 %甲酸溶液。
【文档编号】G01N30/14GK105911191SQ201610352218
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】牟仁祥, 曹赵云, 陈铭学, 朱智伟, 孙伟华, 杨欢
【申请人】中国水稻研究所