鉴定嗅觉受体调节剂的方法
【专利摘要】本申请描述了用于鉴定结合哺乳动物味觉乳头细胞上的嗅觉受体或调节嗅觉受体活性的物质的哺乳动物味觉乳头细胞、细胞系、细胞膜、方法和试剂盒，所述物质包括嗅觉受体的配体及其增强剂和阻断剂。
【专利说明】鉴定嗅觉受体调节剂的方法
[0001] 发明背景
[0002] 在各种生物体中，化学通讯被广泛用于从环境获取生活所需信息。嗅觉和味觉各 自是一种化学感受形式。味觉和嗅觉系统各自调节为独特的一组外界化学物质，并且它们 响应的感觉空间投射在大脑的不同区域。在脊椎动物中，每个味觉细胞根据其表达的味觉 受体的组合对至少一种味觉形式敏感，其中T2R受体为苦味，T1R受体为甜味和鲜味，PKD2L1 离子通道为酸味。在脊椎动物中，嗅觉受体构成G蛋白偶联受体的最大亚家族，其中在哺乳 动物物种中预期有多至1000个成员。如此多样性代表允许嗅觉系统区分数千种有味物质的 分子基础。
[0003] 尽管在大多数动物中味觉和嗅觉是单独的感觉系统，但某些生物仅具有一种化学 感应。例如，蛇利用其舌作为其感知系统的一部分。当舌头伸出进入空气时，舌头上的受体 选取微小化学颗粒，其被感知为气味。当舌头缩回至鞘中时，舌头的末端整齐地进入雅各布 森器官器官，将收集到的化学信息通过该器官传达至脑，该信息在脑中被快速处理和分析， 以便蛇能快速对其作出反应。在果蝇和一些其他昆虫中，表达异位嗅觉受体的味觉神经元 能感受气味。
[0004] 由于缺少用于鉴定嗅觉受体的调节剂的模型系统，理解哺乳动物嗅觉感受中的进 展被严重阻碍。基于发现哺乳动物味觉乳头细胞中嗅觉受体的功能性表达，本申请提供了 鉴定嗅觉受体的调节剂的方法。
[0005] 发明概述
[0006] 本申请提供了鉴定嗅觉受体的调节剂的方法。该方法包括在存在和不存在测试剂 的情况下，检测味觉乳头细胞或味觉乳头细胞膜的嗅觉受体的活性；以及如果在存在测试 剂的情况下受体活性相对于不存在测试剂的情况下嗅觉受体的活性升高或降低，则将测试 剂鉴定为嗅觉受体调节剂。
[0007] 本申请还提供了鉴定嗅觉受体配体的方法。该方法包括使包含嗅觉受体的味觉乳 头细胞或味觉乳头细胞膜与测试剂接触；以及检测嗅觉受体的活性。该方法还可以包括基 于嗅觉受体的活性，检测嗅觉受体配体存在或不存在。
[0008] 本申请还提供了鉴定嗅觉受体配体的增强剂的方法，通过在存在嗅觉受体配体的 情况下，使包含嗅觉受体的味觉乳头细胞或味觉乳头细胞膜与测试剂接触；以及在存在和 不存在测试剂的情况下，检测嗅觉受体的活性，其中如果在存在测试剂的情况下嗅觉受体 活性相对于不存在测试剂的情况下嗅觉受体的活性升高，则测试剂为嗅觉受体配体增强 剂。
[0009] 本申请还提供了鉴定嗅觉受体配体的阻断剂的方法，通过在存在嗅觉受体配体的 情况下，使包含嗅觉受体的味觉乳头细胞或味觉乳头细胞膜与测试剂接触；以及检测在存 在和不存在测试剂的情况下嗅觉受体的活性，其中如果在存在测试剂的情况下嗅觉受体活 性相对于不存在测试剂的情况下嗅觉受体的活性降低，则测试剂为嗅觉受体配体阻断剂。 在一些实施方案中，测试剂与嗅觉受体配体竞争结合嗅觉受体。
[0010] 在本申请提供的方法的一些实施方案中，通过使味觉乳头细胞或细胞膜与测试剂 接触来检测嗅觉受体活性。嗅觉受体的活性可以通过测定细胞内Ca2+水平检测或通过检测 报告物。
[0011] 方法中使用的味觉乳头细胞或细胞膜可以为哺乳动物的，例如人或鼠。在公开的 方法的一些实施方案中，味觉乳头细胞为永生化味觉乳头细胞或获自永生化味觉乳头细胞 的味觉乳头细胞膜。在其他实施方案中，味觉乳头细胞为原代味觉乳头细胞或获自原代味 觉乳头细胞的味觉乳头细胞膜。
[0012] 方法中使用的味觉乳头细胞或细胞膜可以为轮廓味觉乳头细胞或细胞膜、菌状味 觉乳头细胞或细胞膜、或叶状味觉乳头细胞或细胞膜。
[0013] 本申请提供的方法中使用的测试剂可以为天然物质或合成物质或有味分子。
[0014] 在方法的一些实施方案中，嗅觉受体为哺乳动物嗅觉受体，例如人嗅觉受体或鼠 嗅觉受体。嗅觉受体可以为异源嗅觉受体。
[0015] 本申请还提供了用于将物质鉴定为有味物质的试剂盒。该试剂盒包括哺乳动物味 觉乳头细胞或细胞膜和说明书。试剂盒还可以包括能实现响应于所述物质的嗅觉受体的活 性检测的报告物。味觉乳头细胞或味觉乳头细胞膜可以为哺乳动物的，例如但不限于，人或 鼠。味觉乳头细胞或细胞膜可以为原代或永生化味觉乳头细胞或细胞膜。味觉乳头细胞或 细胞膜可以为轮廓味觉乳头细胞或细胞膜、菌状味觉乳头细胞或细胞膜、或叶状味觉乳头 细胞或细胞膜。在一些实施方案中，味觉乳头细胞或细胞膜包含哺乳动物嗅觉受体，例如、 人嗅觉受体或鼠嗅觉受体。在一些实施方案中，味觉乳头细胞或细胞膜包含异源嗅觉受体。
[0016] 本申请还提供了用于将物质鉴定为嗅觉受体配体的阻断剂或增强剂的试剂盒，其 包括哺乳动物味觉乳头细胞或细胞膜和已知的有味物质。试剂盒还可以包括说明书。试剂 盒还可以包括能实现响应于所述物质的嗅觉受体的活性检测的报告物。味觉乳头细胞或味 觉乳头细胞膜可以为哺乳动物的，例如但不限于，人或鼠。味觉乳头细胞或细胞膜可以为原 代或永生化味觉乳头细胞或细胞膜。味觉乳头细胞或细胞膜可以为轮廓味觉乳头细胞或细 胞膜、菌状味觉乳头细胞或细胞膜、或叶状味觉乳头细胞或细胞膜。在一些实施方案中，味 觉乳头细胞或细胞膜包含哺乳动物嗅觉受体，例如、人嗅觉受体或鼠嗅觉受体。在一些实施 方案中，味觉乳头细胞或细胞膜包含异源嗅觉受体。
[0017] 本申请还提供了哺乳动物味觉乳头细胞或其细胞膜，所述细胞或细胞膜表达可操 作地连接于报告物的嗅觉受体。细胞可以为原代细胞或永生化细胞。细胞优选为哺乳动物 的，例如但不限于，人或鼠。细胞可以为轮廓味觉乳头细胞、菌状味觉乳头细胞、或叶状味觉 乳头细胞。嗅觉受体优选为哺乳动物嗅觉受体，更优选为人或鼠嗅觉受体。在一些实施方案 中，嗅觉受体为异源嗅觉受体。本文还提供了包含上述哺乳动物味觉乳头细胞或细胞膜和 说明书的试剂盒。
[0018] 还提供了表达可操作地连接于报告物的嗅觉受体的哺乳动物味觉乳头细胞系。细 胞系优选为哺乳动物的，例如但不限于，人或鼠。细胞系可以来源于轮廓味觉乳头细胞、菌 状味觉乳头细胞、或叶状味觉乳头细胞。嗅觉受体优选为哺乳动物嗅觉受体，更优选为人或 鼠嗅觉受体。在一些实施方案中，嗅觉受体为异源嗅觉受体。本文还提供了包含上述哺乳动 物味觉乳头细胞系和说明书的试剂盒。
[0019] 下文更详细地讨论细胞、细胞膜、试剂盒和相关使用方法。
[0020] 附图简要描述
[0021]图1A至1C显示了 mOR-17-GFP小鼠的轮廓味觉乳头中17嗅觉受体的透射成像。mOR-I7-GFP转基因小鼠表现出轮廓味觉乳头中绿色荧光蛋白（GFP)的表达。图像是用LEICA? TCS-SP2共聚焦激光扫描显微镜获取。图1A显示了对应视场的透射成像。图1B显示了轮廓乳 头中的GFP表达。图1C显示了GFP和轮廓乳头的重叠。利用LCS软件（Leica Microsystems Inc.)和AdobePh〇tOsh〇.p?elements 2.0(Adobe Systems Inc.)对图像进行排列并对对 比度和亮度进行了细微调整。比例尺= 25yM。
[0022]图2 A至2 C显示了 m0R-M71 -GFP小鼠的轮廓味觉乳头中M71嗅觉受体的透射成像。 m0R-M71-GFP转基因小鼠表现出轮廓味觉乳头中绿色荧光蛋白（GFP)的表达。图像是用 IJEIC/\?TCS-SP2共聚焦激光扫描显微镜获取。图2A显示了对应视场的透射成像。图2B显 示了轮廓乳头中的GFP表达。图2C显示了 GFP和轮廓乳头的重叠。按照上文图1A-1C所述，对 图像进行排列和细微调整。
[0023]图3A至3C显示了 mOR-EG-GFP小鼠的轮廓味觉乳头中丁子香酚嗅觉受体的透射成 像。mOR-EG-GFP转基因小鼠表现出轮廓味觉乳头中绿色荧光蛋白（GFP)的表达。图像是用 LE1CA?TCS-SP2共聚焦激光扫描显微镜获取。图3A显示了对应视场的透射成像。图3B显 示了轮廓乳头中的GFP表达。图3C显示了 GFP和轮廓乳头的重叠。按照上文图1A-1C所述，对 图像进行排列和细微调整。
[0024]图4A至4B显示了 mOR-EG-GFP小鼠的轮廓味觉乳头中丁子香酚嗅觉受体的透射成 像。mOR-EG-GFP转基因小鼠表现出轮廓味觉乳头中GFP的表达。图像是用LEICA? TCS-SP2 共聚焦激光扫描显微镜获取。图4A显示了对应视场的透射成像。图4B显示了轮廓乳头中的 GFP表达。按照上文图1A-1C所述，对图像进行排列和细微调整。
[0025] 图5A至?为mOR-17-GFP小鼠的轮廓乳头中PLC-b2(A、B)和GFP(C、D)的共定位的透 射成像。
[0026] 图6A至6D为显示m0R-M71-GFP小鼠的轮廓乳头中PLC-b2(图6C)和GFP(图6B)的共 定位的透射成像。还示出未染色（图6A)和叠加（图6D)。
[0027] 图7A至7D显示mOR-EG-GFP小鼠的轮廓乳头中PLC-b2 (7B)和GFP (7C)的共定位。还 示出叠加(7D)和未染色(7A)的透射成像。
[0028] 图8A至8D为显示m0R-M71-GFP小鼠的轮廓乳头中味蛋白（8B)和GFP(8C)的共定位 的透射成像。还示出正常(8A)和叠加(8D)。
[0029] 图9A至9D为显示mOR-EG-GFP的轮廓乳头中味蛋白（9B)和GFP(9C)的共定位的透射 成像。还示出正常(9A)和叠加(9D)。
[0030] 图10A至10D显示了，在用于产生M71和丁子香酚转基因小鼠的培养的野生小鼠味 觉(M129)细胞中，未观察到488nm波长(诱发GFP相关信号)诱发的信号。新鲜分离的味觉组 织（图10A和10C)在488nm波长的光诱发后未显示任何GFP表达。获自Ml 29小鼠的培养的味觉 乳头细胞（图10B和10D)，在488nm波长的光诱发时，未显示任何GFP表达。DAPI染色指示细胞 核。
[0031] 图11A至11C显示了，从m0R-M71-GFP(〃M71〃)小鼠新鲜分离的味觉组织，在488nm波 长的光诱发时，表达GFP。
[0032]图12A至12F显示了培养的人菌状味觉细胞中0R8D1的表达，通过肽抑制测试证实。 图12A和12D显示了分别在不存在或存在0R8D1特异性肽的情况下，培养的人味觉乳头细胞 的透射成像。显示了在不存在（图12B)和存在（图12E)其特异性肽用0R8D1抗体染色的培养 的人味觉乳头细胞(ffflO)。图12B显示了培养的人味觉乳头细胞的亚组中存在0R8D1表达，但 是将OR8D1抗体与其特异性肽预孵育导致OR8D1特异性免疫染色完全消除（图12E)。图12C和 12F显示了分别在不存在或存在OR8D1特异性肽的情况下，培养的人味觉乳头细胞的核的透 射成像。
[0033]图13的图显示了获自mOR-M71-GFP (〃M71〃）小鼠的培养的味觉乳头细胞响应于受 体特异性气味、乙酰苯和苦味混合物，表明单一细胞上存在嗅觉和味觉受体两者。
[0034]图14显示了培养的获自mOR-M71-GFP( 〃M71〃）小鼠的味觉乳头细胞响应于受体特 异性气味、苯甲醛和苦味混合物，表明单一细胞上存在嗅觉和味觉受体两者。
[0035]图15显示了培养的获自mOR-M71-GFP (〃M71〃）小鼠的味觉乳头细胞响应于受体特 异性气味、乙酰苯、苯甲醛和苦味混合物，表明单一细胞上存在嗅觉和味觉受体两者。
[0036]图16显示了培养的获自mOR-EG-GFP( 〃mEUG〃)小鼠的味觉乳头细胞响应于受体特 异性气味、丁子香酚和苦味混合物，表明单一细胞上存在嗅觉和味觉受体两者。获自mOR-EG-GFP小鼠的培养的味觉乳头细胞特别表明单一细胞上存在嗅觉和味觉受体两者。
[0037] 图17显示了获自mOR-EG-GFP( 〃mEUG〃）小鼠的培养的味觉乳头细胞响应于苦味混 合物和混合物A，表明单一细胞上存在嗅觉和味觉受体两者。
[0038]图18显示了获自M129小鼠的培养的味觉乳头细胞对丁子香酚敏感。
[0039]图19显示了获自Ml 29小鼠的培养的味觉乳头细胞对混合物A敏感。
[0040]图20显示了获自M129小鼠的培养的味觉乳头细胞对乙酰苯敏感。
[00411图21显示了获自Ml 29小鼠的培养的味觉乳头细胞对混合物B、苯甲醛和苦味混合 物敏感，表明单一细胞上存在嗅觉和味觉受体两者。
[0042]图22显示了获自人舌的培养的菌状味觉乳头(HB0)细胞响应于气味刺激混合物A 和混合物B。利用fura-2标准钙成像系统，测量培养的人菌状味觉细胞中细胞内钙水平 ([Ca2+]i)的改变。图显示出在暴露于气味的过程中，个体细胞的[Ca+2]i水平的代表性改 变。刺激物被溶解于林格氏溶液，并调整pH和摩尔渗透压浓度。
[0043]图23显示了获自人舌的培养的菌状味觉乳头(HB0)细胞对丁子香酚敏感。参与应 答的可能的受体为人OR? 18 (或小鼠01 f r 73)。
[0044]图24显示了获自人舌的培养的菌状味觉乳头(HB0)细胞对己酸敏感。参与应答的 可能的受体为人〇R51Ll(或小鼠01fr64和/或01fr653)。
[0045]图25显示了获自人舌的培养的菌状味觉乳头(HB0)细胞对香豆素敏感。参与应答 的受体可能为以下中的一个或多个：人0R2J2,0R2W1，和0R5P3(或小鼠01frl519,01fr749， 01frl352,01frl079,01frl377,01fr556,01frl341,01frl062,01frl09,01fr508,01fr983, 01fr876，01frll04，和01fr895)。
[0046]图26显示了获自人舌的培养的菌状味觉乳头(HBO)细胞对乙酰苯敏感。参与应答 的受体为以下中的一个或多个：人0R2W1和0R5P3(或小鼠01fr749,01frl352,01frl079， 01frl377,01fr556,01fr 1341,01frl062,01frl09,01fr983,01fr876,01frl104,01fr895, 01frl68,01fr429,01frl67,和01frl51)。
[0047]图27显示了获自人舌的培养的菌状味觉乳头(HBO)细胞对庚醛敏感。参与应答的 受体可能为〇R2Wl(或小鼠01frl7)。
[0048]图28显示了获自人舌的培养的菌状味觉乳头(HB0)细胞对新铃兰醛（lyral)敏感。 参与应答的受体为人0R10J5(或小鼠01frl5和01frl6)。
[0049]图29A至29C显示了响应于丁子香酚的获自mOR-EUG-GFP小鼠的培养的味觉乳头细 胞中GFP的表达。钙成像后采集图像。图29A显示了培养的mOR-EUG-GFP小鼠味觉细胞的光透 射。图29B显示了表达GFP的图29A的细胞。图29C显示了叠加的图29A的细胞。这些图表明：丁 子香酚响应性细胞表达GFP，这表明响应于丁子香酚的培养的小鼠味觉细胞上存在丁子香 酚受体。
[0050] 图30A至30C显示了响应于乙酰苯的获自H10R-M71-GFP小鼠的培养的味觉乳头细胞 中GFP的表达。钙成像后采集图像。用箭头标出的响应性细胞显示表GFP达。图30A显示了培 养的mOR-EUG-GFP小鼠味觉细胞的光透射。图30B和30C显示了培养的小鼠味觉细胞表达 GFP。这些图表明：丁子香酸响应性细胞表达GFP，这表明响应于丁子香酸的培养的小鼠味觉 细胞上存在丁子香酚受体。
[00511图31A和31B的图显示了用0R7D4或0RS6转染的培养的味觉细胞表现出对各自受体 的气味配体的升高的钙响应。
[0052]图32A-32E显示了永生化人菌状味觉乳头细胞响应于受体特异性气味，指示庚醛 (32A)、乙酰苯(32B)、甲基肉桂(32C)、丁子香酚(32D)和新铃兰醛(32E)的特异性气味受体 的存在。通过将培养的人菌状味觉乳头(HB0)细胞永生化来获得永生化人菌状味觉乳头细 胞。这些结果表明：永生化人菌状味觉乳头细胞保留其原有的生理学、分子学和信号转导性 质。
[0053]示例性实施方案的详细描述
[0054]涉及描述的多方面的各种术语贯穿说明书和权利要求中使用。这些术语理解为其 在本领域中的一般含义，除非另外说明。其他特别定义的术语应当与本文提供的定义一致 的方式来解释。
[0055] 在本说明书和后附权利要求书中，单数性质〃a〃、〃an〃和"the"包括复数形式，除非 上下文有明确的相反指示。因此，例如，涉及〃细胞〃包括两个或更多个细胞的组合，诸如此 类。说明书中利用"包含/包括"的语言呈现的各个实施方案包括其他成分或方法步骤。当使 用〃包含/包括〃时，应当理解为，相关的实施方案包括利用术语〃由…组成〃的描述，这排除 了其他成分或方法步骤，以及利用术语〃本质上由…组成〃的描述，这排除了会明显改变实 施方案或发明的性质的任何成分或方法步骤。
[0056] 当涉及可测量的值，例如量、持续时间等，本文所用的术语"约"意图包括从规定值 的高至±10%的变异，因为这样的变异也适合于实施所公开的方法。除非另外说明，表达成 分数量、性质（例如分子量）、反应条件以及说明书和权利要求书中的其他事项的全部数值 应被理解为在全部情况下受到术语"约"的修饰。因此，除非有相反指示，说明书和后附权利 要求书中的数值参数是约数，其可以根据本发明寻求获得的希望的性质而改变。从最低限 度来讲，但这并不是试图限制等同原则对于权利要求范围的适用性，每一数值参数至少应 当考虑所报道的有效数字的数值并通过使用一般舍入技术来进行解释。
[0057] 虽然限定本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实施例中涉及的 数值为尽可能准确地报道。但是，任何数值固有地存在一定误差，这是由在其各自的测试测 量中存在的标准偏差必然导致的。
[0058] 本文所用的术语"竞争结合"用于涉及第一物质具有的活性与第二物质具有的活 性为结合相同的底物。第一物质的结合效率(例如，动力学或热力学)可以为等同于或大于 或小于第二物质的底物结合效率。例如，结合底物的平衡结合常数(Kd)对于两种物质可以 不同。
[0059] 本文所用的术语〃原代细胞〃指直接从组织分离的非转化的、非永生化的细胞。
[0060] 本文所用的术语〃报告基因〃指编码可以检测的蛋白的基因。〃报告基因或分子〃包 括编码荧光物质的基因、化学发光物质、发色物质、猝灭剂、放射性核苷酸、酶、底物、辅酶因 子、抑制剂和本领域已知的其他部分。在一些实施方案中，〃报告分子〃能产生可测量信号。 报告基因的实例包括，但不限于，焚光素酶、绿色荧光蛋白（例如，tauGFP)，黄色荧光蛋白、 青色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄红色荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶、半乳糖苷酶、碱性磷 酸酶和辣根过氧化物酶。
[0061] 当用于检测时，本文所用的术语"应答"指生成可检测信号（例如，报告蛋白的累 积、离子浓度增加、可检测化学产物的累积）。
[0062] 本文所用的短语〃味觉乳头细胞〃指味觉基底细胞和/或a细胞that表达一种或多 种味觉受体和响应于一种或多种促味剂刺激(例如，通过监测细胞内钙水平和/或电生理学 数据来测定）。在一些实施方案中，味觉乳头细胞表达味觉乳头细胞的一种或多种生物标志 物(例如，磷脂酶-02和/或味蛋白）。味觉基底细胞表达一种或多种干细胞标志物(例如，细 胞角蛋白8(0(8)，1^1，1^6,3(?2，11^111等)和能分化为味觉细胞类型（例如，1型、11型或 III型）。
[0063]术语"测试剂"指任何天然或合成的化学实体、药剂、药物、食品等。例如，测试剂可 以为食品、药剂、食品或药剂的组分或分解产物、或食品或药剂的污染物。
[0064]通过提供用于鉴定同源嗅觉受体配体和其增强剂和阻断剂的模型系统，本申请描 述了用于帮助理解嗅觉编码的细胞、细胞膜、方法和试剂盒。所述细胞、细胞膜、方法和试剂 盒提供多种研究、诊断、治疗、药物和食品筛选应用。例如，所述细胞、细胞膜、方法和试剂盒 允许鉴定和表征负责健康状态和嗅觉应答的嗅觉受体配体。因此，所述细胞、细胞膜、方法 和试剂盒还提供了用于鉴定允许操控嗅觉应答(例如，用于控制感知气味)的配体的手段。 [0065]味觉乳头细胞和细胞膜
[0066] 本申请提供了功能性表达一种或多种嗅觉受体(0R)的味觉乳头细胞。在一些实施 方案中，味觉乳头细胞所表达的一种或多种嗅觉受体对于细胞是天然的。还提供了已被修 饰为包含一种或多种编码0R的多核苷酸的味觉乳头细胞（即，异源表达，例如，重组表达）。 转化细胞而包含编码嗅觉受体的多核苷酸的方法可用于产生本文所述的修饰的细胞，这是 本领域技术人员能够理解的(参见，例如，美国专利7,488,599，通过援引的方式将其并入本 文）。在优选的实施方案中，味觉乳头细胞和细胞膜是哺乳动物的，包括但不限于:鸟、小鼠、 大鼠、兔、猴、猿、或人，优选为人或鼠。
[0067] 还提供了所述味觉乳头细胞的细胞膜，其功能性表达一种或多种嗅觉受体。
[0068] 嗅觉受体是G-蛋白偶联受体(GPCR)，其被有味物质结合而启动细胞内信号转导事 件的级联，导致细胞内钙水平改变。嗅觉受体神经元的细胞膜中表达的嗅觉受体负责检测 气味分子。活化的嗅觉受体是信号转导级联中最初的角色，信号转导级联最终产生神经冲 动，其被传递至大脑。这些受体是GPCR的A类视紫红质样家族的成员。某些伴侣或附属蛋白 存在于哺乳动物嗅觉细胞或表达OR的味觉细胞，这有助于它们输送至细胞表面膜和配体诱 导的应答，例如，RTP1S。当异源表达于非嗅觉来源的培养的细胞中时，有味物质受体蛋白保 留于内质网中。因此，本文所述的细胞、细胞系或细胞膜(不是含OR的天然味觉细胞)必须被 修饰为含有附属蛋白（例如RTP1S)，从而有助于它们输送至细胞表面膜和异源细胞中配体 诱导的应答（即，细胞不天然含有OR或附属蛋白。或者，天然含有附属蛋白的细胞可被修饰 为含有和表达另外的本文所述的0R，可利用常规的转染或其他已知的细胞修饰技术。
[0069] 功能性嗅觉受体表达可通过本领域中已知的任何手段来测定（例如，通过监测细 胞内钙水平和/或电生理学数据）。嗅觉受体可以为任何哺乳动物嗅觉受体，包括但不限于 获自鸟、小鼠、大鼠、兔、猴、猿或人的嗅觉受体。嗅觉受体优选为人或鼠的。嗅觉受体的实例 是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于，人0R51L、0R5D18、0R8D1、0R2J2、0R2W1、 0R10J5和0R5P3;鼠01frl5、01frl6、01frl7、01fr64、01fr73、01fr653、01frl519、01fr749、 01frl352、01frl079、01frl377、01fr556、01frl341、01frl062、01frl09、01fr508、01fr983、 01灶876、01打1104、01打168、01打429、01打167、01打151和01灶895;和以上的能够实现有 味物质诱导的应答的片段和衍生物。参见，例如，Zhang and Firestein，Nature Neurosci.，2002,5(2):124-133;Malnic et al.，PNAS，2004，101(8):2584-2589;01ender et al,Human Genomics,2008,3(1):87-97；Zozulya et al.,Genome Biol2001,2(6): ^86&1'〇11〇018.1-〇018.2。将以上每篇文献通过援引的方式并入本文。
[0070] 味觉乳头细胞和细胞膜可以为获自外周组织，例如舌（参见，例如，美国专利7， 488，599，通过援引的方式将其并入本文），包括叶状，菌状或轮廓味觉乳头细胞或其细胞 膜。用于本文所述的方法和试剂盒的味觉乳头细胞和细胞膜可以为原代或永生化味觉乳头 细胞或从它们获取的细胞膜。因此，本申请还提供了哺乳动物味觉乳头细胞的细胞系，其表 达一种或多种嗅觉受体。
[0071] 在一些实施方案中，所述味觉乳头细胞、细胞系和细胞膜被进行了修饰，使得嗅觉 受体基因或基因启动子可操作地连接于报告物。示例性鼠嗅觉受体基因启动子包括但不限 于：丁子香酚启动子、M71启动子和17启动子、以及01frl5、01frl6、01frl7、01fr64、01fr73、 01fr653、01fr1519、01fr749、01fr1352、01fr1079、01fr1377、01fr556、01fr1341、 01frl062、01frl09、01fr508、01fr983、01fr876、01frll04、01frl68、01fr429、01frl67、 01frl51 和 01fr895 启动子。
[0072] 示例性人启动子包括但不限于嗅觉受体0R51L、0R5D18、0R8D1、0R2J2、0R2W1、 0R10J5和0R5P3的启动子。本文中列出的合适的报告物。在一些实施方案中，编码报告物的 序列与内部核糖体进入位点（IRES) -起引入。这样的连接允许检测表达嗅觉受体。选择的 启动子可以通过合适的手段引入，然后通过检测报告物。
[0073]在一个实施方案中，用可操作地连接于合适的启动子的嗅觉受体DNA和可选的报 告基因和上文讨论的可选的伴侣DNA瞬时转染味觉细胞。产生用于此种转染的DNA序列所用 的方法在本领域中有描述；参见，例如，上文列出的出版物之一或Sambrook et al， Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY选择上文所述的合适的启动子、合适的嗅觉受体DNA、报告物序列以及附属DNA 序列，从而使细胞能表达受体。这样的附属序列包括RTP1S，M1序列（参见，例如，Wu，L et al , June 2012，''Receptor-transporting Protein 1 Short (RTPIS)Mediates Translocation and Activation of Odorant Receptors byActing through Multiple Steps，J.Biol.Chem. ,287(26): 22287-94)。其他有用的序列包括内部核糖体进入位点 (IRES)，例如，脊髓灰质炎病毒内部核糖体进入序列。另外其他的序列是本领域中已知的并 且可获得的。作为IRES的替代方案，DNA可包括编码2A肽的序列，2A肽在翻译后事件中自我 切割。参见，例如，M.L.Donnelly，et al，J.Gen.Virol，78(Pt l):13-21(Jan 1997); Furler,S.,et al,Gene Ther8(11):864-873(June 2001)；Klump H.,et al,Gene Ther.，8(10):811-817(May 2001)。另外其他合适的序列是约15-25核酸的间隔子序列，或 启动子和一种或多种操纵子序列之间的间隔的内含子，以及核定位序列(NLS)。
[0074] 用于包含于DNA序列中的其他调节序列包括，但不限于，增强子序列、接合供体序 列和接合受体序列、转录起始和终止位点、核糖体结合位点、表位标签、Goldberg-Hogness" TATA〃元件、限制性酶切位点、选择标记、复制起点、聚腺苷酸化序列（例如，BGH polyA， SV40polyA)、药物抗性标记(例如，卡那霉素抗性）。所有这些元件都可以从广泛已知的序列 中选择。
[0075] 通过常规方式将DNA序列转染入细胞，例如电穿孔、通过合适的病毒或病毒样颗粒 (例如，AAV)的递送，或其他已知方法。本申请描述的发明不受限于转染所用的具体技术、或 者待转染的DNA序列的组成部分的选择。参见，例如，多种教科书，例如Sambr〇〇k e t a 1， Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor, NY的各个版本。
[0076] 所描述的味觉乳头细胞和细胞膜的使用方法
[0077] 所描述的味觉乳头细胞、细胞系和细胞膜可以用于本文提供的鉴定嗅觉受体的配 体和调节剂的方法。测试剂结合味觉乳头细胞、细胞系和细胞膜上的嗅觉受体的能力可以 完成，例如通过将测试剂偶联于放射性同位素或酶学标签，使得测试剂与嗅觉受体的结合 可以通过检测复合物中标记的测试剂而测定。例如，测试剂可以用 125I、35S、14C或3H直接或间 接标记，并且放射性同位素通过放射性发射的直接计数或通过闪烁计数来检测。或者，测试 剂可以进行酶学标记，例如，用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶，并且酶学标记是 通过测定合适的底物向产物的转化来检测的。在用或不用任何相互作用物标记的情况下， 测试剂与嗅觉受体相互作用的能力也可以通过本领域已知的任何手段来评价。
[0078] 在一些实施方案中，鉴定嗅觉受体配体的方法包括将表达功能性嗅觉受体的所述 味觉乳头细胞、细胞系或细胞膜暴露于测试剂，然后检测嗅觉受体活性。可用的测试剂包括 但不限于任何天然或合成化学实体，药剂，药物，食品等。例如，测试剂可以为食品、药剂、食 品或药剂的组成部分或分解产物，有味分子或组合物(例如，庚醛，乙酰苯，新铃兰醛，丁子 香酚，苦味混合物，混合物A，混合物B)、或食品或药剂的污染物。如果测试剂对于嗅觉受体 为配体特异性，则嗅觉受体活性的改变将可检测到。
[0079] 在一些实施方案中，本文所述的味觉乳头细胞、细胞系或细胞膜可用于第二信使 分析，其监测嗅觉受体活化后的信号转导(例如，测量细胞内Ca+ 2水平或cAMP水平）。在第二 信使分析中，细胞或细胞膜与一种或多种物质(例如，来自组合式文库)接触，并检测存在或 不存在应答。在一些实施方案中，第二信使分析检测或测量响应于由膜受体和离子通道的 刺激产生的细胞内改变的来自报告物分子的荧光信号（例如，Ca 2+水平，膜电势，pH，cAMP， IP3,花生四烯酸释放）。报告物分子的实例包括，但不限于，FRET(荧光共振能量转换）系统 (例如，Cuo-脂质和oxono 1 s，EDAN/DABCYL)，钙敏感指示剂(例如，Fluo-3，FURA2，INDO 1，和 FLU03/AM，BAPTA AM)，氯化物敏感指示剂（例如，SPQ，SPA)，钾敏感指示剂（例如，PBFI)，钠 敏感指示剂(例如，SBFI)，和pH敏感指示剂(例如，BCECF)。通常，在暴露于测试剂之前，细胞 或细胞膜被装载报告物分子。细胞或细胞膜对测试剂处理的响应可以通过本领域已知的方 法检测，包括，但不限于，荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪，微流体装置，FLIPR系统。 参见，例如，Schroeder and Neagle，J.Biomol.Screening 1:75(1996)，通过援引的方式将 其并入本文，和平板读数系统。
[0080] 在其他实施方案中，味觉乳头细胞和细胞膜可用于报告基因分析中，其监测转录/ 翻译水平的细胞应答。例如，如果嗅觉受体基因或基因启动子可操作地连接于报告物（例 如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，c-myc，6-组氨酸(6xHis)，绿色荧光蛋白（GFP)，麦芽糖结合 蛋白（MBP)，甲型流感病毒血凝素(HA)，0_半乳糖苷酶和GAL4)，报告物的表达或表达变化会 可以检测到。
[0081] 所述味觉乳头细胞、细胞系和细胞膜可以用于鉴定嗅觉受体的调节剂的方法。在 一些实施方案中，方法包括在存在和不存在测试剂的情况下，测量或检测所述味觉乳头细 胞、细胞系或细胞膜表达的功能性嗅觉受体的活性。可用测试剂包括但不限于任何天然或 合成化学实体、药剂、药物、食品等。例如、测试剂可以食品、药剂、食品或药剂的组成部分或 分解产物、有味分子或组合物(例如，庚醛、乙酰苯、新铃兰醛、丁子香酚、苦味混合物、混合 物A、混合物B)、或食品或药剂的污染物。如果测试剂为嗅觉受体调节剂，存在测试剂的情况 下的嗅觉受体活性相对于不存在测试剂的情况下的嗅觉受体活性会升高或降低。在一些实 施方案中，本文所述的味觉乳头细胞、细胞系或细胞膜可用于第二信使分析，其监测嗅觉受 体活化后的信号转导(例如，测量细胞内Ca+ 2水平或cAMP水平）。在其他实施方案中，味觉乳 头细胞可用于报告基因分析，其监测转录/翻译水平的细胞应答。例如，如果嗅觉受体基因 或基因启动子可操作地连接于报告物（例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，c-myc，6-组氨酸 (6xHis)，绿色荧光蛋白（GFP)，麦芽糖结合蛋白（MBP)，甲型流感病毒血凝素(HA)，0_半乳糖 苷酶和GAL4)，相对于不存在测试剂的情况，存在测试剂的情况下报告物的表达或表达改变 会可检测到。
[0082] 在另一实施方案中，根据本文提供的方法，所述味觉乳头细胞、细胞系和细胞膜可 用于鉴定有味物质或嗅觉受体配体的增强剂的方法。因此，在一些实施方案中，提供了鉴定 能升高或增强嗅觉受体响应于已知有味物质或嗅觉受体配体的活性的天然或合成物质的 方法。所述味觉乳头细胞、细胞系和细胞膜可用于鉴定本文提供的有味物质或嗅觉受体配 体的增强剂的方法。因此，在一些实施方案中，鉴定有味物质或嗅觉受体配体的增强剂的方 法包括在存在有味物质或嗅觉受体配体的情况下，使本文所述的表达功能性嗅觉受体的味 觉乳头细胞、细胞系或细胞膜与测试剂接触;并测量或检测在存在和不存在测试剂的情况 下的嗅觉受体活性。可用测试剂包括但不限于任何天然或合成化学实体，药剂，药物，食品 等。例如、测试剂可以为食品、药剂、食品或药剂的组成部分或分解产物，有味分子或组合物 (例如，庚醛，乙酰苯，新铃兰醛，丁子香酚，苦味混合物，混合物A，混合物B )、或食品或药剂 的污染物。如果存在测试剂的情况下的嗅觉受体活性相对于不存在测试剂的情况下的嗅觉 受体活性升高，则测试剂为有味物质或嗅觉受体配体的增强剂。在一些实施方案中，本文所 述的味觉乳头细胞、细胞系或细胞膜可用于第二信使分析，其监测有味物质受体活化后的 信号转导(例如，测量细胞内Ca+2水平或cAMP水平）。存在测试剂的情况下第二信使分析所测 量的受体活性相对于不存在测试剂的情况升高，指示增强剂。在其他实施方案中，味觉乳头 细胞可用于报告基因分析，其监测转录/翻译水平的细胞应答。例如，如果嗅觉受体基因或 基因启动子可操作地连接于报告物（例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，c-myc，6-组氨酸 (6xHis)，绿色荧光蛋白（GFP)，麦芽糖结合蛋白（MBP)，甲型流感病毒血凝素(HA)，0_半乳糖 苷酶和GAL4)，相对于不存在测试剂的情况，存在测试剂的情况下报告物的检测升高指示增 强剂。
[0083] 根据本文提供的方法，所述味觉乳头细胞、细胞系和细胞膜还可用于鉴定有味物 质或嗅觉受体配体的阻断剂的方法。因此，在一些实施方案中，提供了鉴定能降低或减弱嗅 觉受体响应于已知有味物质或嗅觉受体配体的活性的天然或合成物质的方法。所述味觉乳 头细胞、细胞系和细胞膜可用于鉴定本文提供的有味物质或嗅觉受体配体的阻断剂的方 法。因此，在一些实施方案中，鉴定有味物质或嗅觉受体配体的阻断剂的方法包括在存在有 味物质或嗅觉受体配体的情况下，使本文所述的表达功能性嗅觉受体的味觉乳头细胞、细 胞系或细胞膜与测试剂接触;并测量或检测在存在和不存在测试剂的情况下的嗅觉受体活 性。可用测试剂包括但不限于任何天然或合成化学实体，药剂，药物，食品等。例如、测试剂 可以为a食品、药剂、食品或药剂的组成部分或分解产物，有味分子或组合物(例如，庚醛，乙 酰苯，新铃兰醛，丁子香酚，苦味混合物，混合物A，混合物B)、或食品或药剂的污染物。如果 存在测试剂的情况下的嗅觉受体活性相对于不存在测试剂的情况下的嗅觉受体活性降低， 则测试剂为有味物质或嗅觉受体配体的阻断剂。在一些实施方案中，本文所述的味觉乳头 细胞、细胞系或细胞膜可用于第二信使分析，其监测嗅觉受体活化后的信号转导（例如，测 量细胞内Ca+ 2水平或cAMP水平）。存在测试剂的情况下第二信使分析所测量的受体活性相对 于不存在测试剂的情况降低，指示阻断剂。在其他实施方案中，味觉乳头细胞可用于报告基 因分析，其监测转录/翻译水平的细胞应答。例如，如果嗅觉受体基因或基因启动子可操作 地连接于报告物(例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，c-myc，6-组氨酸(6xHis)，绿色荧光蛋白 (GFP)，麦芽糖结合蛋白（MBP)，甲型流感病毒血凝素(HA)，0_半乳糖苷酶和GAL4)，相对于不 存在测试剂的情况，存在测试剂的情况下报告物的检测降低指示阻断剂。
[0084] 试剂盒
[0085] 本申请还提供了用于将一种或多种物质鉴定为有味物质或嗅觉受体调节剂的试 剂盒。在一些实施方案中，试剂盒提供表达一种或多种嗅觉受体的味觉乳头细胞、细胞系或 细胞膜和说明书。试剂盒还可以包括允许检测嗅觉受体活性的报告物。
[0086] 本申请还提供了用于将测试剂鉴定为嗅觉受体配体的阻断剂或增强剂的试剂盒， 其中试剂盒包括表达一种或多种嗅觉受体的味觉乳头细胞、细胞系或细胞膜和已知有味物 质。
[0087] 在一些实施方案中，用于将测试剂鉴定为嗅觉受体配体的阻断剂或增强剂的试剂 盒包括说明书。
[0088] 本申请描述的试剂盒提供的味觉乳头细胞、细胞系或细胞膜优选为哺乳动物的， 包括但不限于鸟，小鼠，大鼠，兔，猴，猿，或人，优选人或鼠。味觉乳头细胞、细胞系或细胞膜 表达的一种或多种嗅觉受体为哺乳动物的，包括但不限于鸟，小鼠，大鼠，兔，猴，猿，或人， 优选人或鼠。在一些实施方案中，嗅觉受体对于味觉乳头细胞或细胞膜是天然的。在一些实 施方案中，嗅觉受体是异源的。"异源"表示嗅觉受体对于细胞不是天然的，或对于细胞是天 然的，但是天然存在于细胞基因组的不同位置，或者在天然细胞表达的水平不同于在修饰 的细胞中的表达水平。在一些实施方案中，试剂盒提供的味觉乳头细胞、细胞系或细胞膜表 达的一种或多种嗅觉受体可操作地连接于报告物。
[0089] 表达一种或多种嗅觉受体的味觉乳头细胞或细胞膜可以为原代细胞或永生化细 胞或其细胞膜。在优选的实施方案中，味觉乳头细胞、细胞系或细胞膜获自外周组织，优选 舌组织。表达一种或多种嗅觉受体的味觉乳头细胞、细胞系或细胞膜可以为轮廓味觉乳头 细胞或轮廓味觉乳头细胞膜;菌状味觉乳头细胞或菌状味觉乳头细胞膜;或叶状味觉乳头 细胞或叶状味觉乳头细胞膜。
[0090] 说明书可以指导使用者使用依照本文所述的方法的试剂盒。在一些实施方案中， 嗅觉受体标记有报告物，其允许实现细胞、细胞系或细胞膜暴露于测试剂之后检测嗅觉受 体活性。
[0091] 提供以下实施例来补充前文的公开，以及提供本文所述的主题的更好的理解。这 些实施例不应被认为限制所描述的主题。应当理解，本申请描述的实施例和实施方案仅是 为了举例说明的目的，并且由其而来的各种修饰或改变对于本领域技术人员是显而易见 的，这包括在本发明的实质范围内，并且可以不脱离本发明的实质范围而作出。
[0092] 文献(将其中的每一个通过援引的方式并入本文）：
[0093] 1.Gaudin JC,et al.Mouse orthologs of human olfactory-like receptors expressed inthe tongue.Gene.20060ct 15；381:42-8.Epub 2006 Jun 22.
[0094] 2.Durzynski L ,et al Olfactory-like receptor cDNAs are present in human lingual cDNA libraries.Biochem Biophys Res Commun.2005 Jul 22；333(1): 264-72.
[0095] 3.Gaudin JC,et al.New GPCRs from a human lingual cDNA library.Chem Senses.2001Nov;26(9):1157-66.
[0096] 以下实施例仅由于举例说明，并不限制本发明的范围。
[0097]实施例1-材料和方法：
[0098] A ? 17、M71和丁子香酚转基因小鼠的产生：
[0099] 通过检查I7、M71和丁子香酚(EG)转基因小鼠的味觉乳头，研究味觉乳头细胞的有 味物质(或嗅觉)受体(0R)性质。在一个实施方案中，利用由m0R-EG转录起始位点的3. Okb上 游部分以及mOR-EG-IRES-gapEGFP组成的转基因制备m0R-EG-GFP品系（〃m0R-EG-GFP〃）。 IRES序列允许0R与报告蛋白共表达。（Oka et al，Neuron，2006，52:857-859，通过援引的方 式将其并入本文）。在另一实施方案中，通过插入内部核糖体进入位点（IRES)和荧光轴突标 志物的编码序列tauGFP(IRES-tauGFP)至M71或编码序列的下游，产生M71-IRES-tauGFP (M71-G)突变r'm0R-M71-GFP")，产生GFP标记的M71 小鼠品系。（Axel et al，Neuron，2008， 60(6): 1068-1081，通过援引的方式将其并入本文）。在另一时时方案中，通过插入IRES-tauGFP至17或或编码序列的下游，产生17-11^34 &1^^3(〃111〇1?-17-6??〃），产生6??标记的17 小鼠品系。（Bozza et al，J? Neurosci ?，2002，22(8): 3033-3043，通过援引的方式将其并入 本文）。构建物被微注射入受精卵的原核。
[0100] B.人菌状味觉乳头细胞的培养物的建立和保持
[0101 ] 根据公开的方案培养人菌状乳头细胞(Ozdener et al，Chem Senses.2006Mar;31 (3):279-90;Ozdener et a 1,In Vitro Cellular&Developmental Biology-Animal. September 2011,47(8): 513-14;将其中每一篇文献通过援引的方式并入本文）。简 单而言，将人菌状味觉乳头移除，并立即放入分离溶液[26mM NaHC03，2.5mM NaH2ro4，20mM glucose，65mM NaCl，20mM KC1，和ImM乙二胺四乙酸(EDTA)]，然后用链霉蛋白酶E和弹性蛋 白酶进行酶学消化。然后，将消化的菌状乳头用手术刀轻轻切碎，并接种于包被I型胶原蛋 的玻片上，在含5%C0 2的湿润环境中、36°C下孵育。人菌状味觉乳头被培养在含10%胎牛血 清，1:5比例的M⑶B 153和三种复合抗生素（100U/mL/100yg/mL，青霉素/链霉素和0.5yg/mL 二性霉素 B)的Iscove's Modified Dulbecco's培养基。人菌状味觉乳头细胞已被保持培养 持续超过1年，未丧失活力并保留急性分离的味觉细胞的分子学和生物化学性质。
[0102] C.小鼠味觉乳头细胞的培养
[0103] 按照之前公开的操作（Ozdener et al，2006,上文引用），分离获自野生(ml29)、 I7、M71和丁子香酚转基因小鼠的轮廓和叶状乳头。简言之，通过注射酶混合物(链霉蛋白 酶，lmg/ml Sigma和弹性蛋白酶1 mg/m 1 Sigma)去除小鼠味觉乳头，立即放入分离溶液，然 后进行酶学消化。
[0104]然后，将消化的味觉乳头组织用手术刀轻轻切碎，并接种于包被I型胶原蛋的玻片 上，在含5 % C02的湿润环境中、36 °C下孵育。
[0105] D.免疫组织化学和免疫细胞化学
[0106]将小鼠轮廓和叶状味觉乳头组织在配制于磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2)中的4%多 聚甲醛(PFA)中室温固定1小时，然后将其依次浸入10%、20%和30%配制于PBS中的蔗糖， 每次24小时，进行冷冻保护。在Microm HM5000M低温恒温器上，以lOwii切割每个乳头的矢状 切面。将组织切片融解固定于SuperfrostP丨US?玻片上，直接观察GFP表达或进行染色（下 文描述)来定位GFP和味觉相关分子磷脂酶P2(PLC-b2)或味蛋白的共表达。
[0107]培养的人菌状味觉乳头(HB0)细胞(第4-5代)在配制于PBS中的4%PFA中室温固定 1 〇分钟。将细胞在配制于PBS的3 %正常山羊血清，3 %牛血清白蛋白和0.3 % Tr i ton X-100 中封闭30-60分钟，然后与一抗(0R8Dl，SantaCruz)4°C下过夜孵育。为了确定该抗体的特异 性，将该抗体与其特异性肽预先4°C下过夜孵育(或室温4-5小时），然后还将细胞置于该抗 体+肽混合物4°C下过夜孵育。
[0108] 对于小鼠味觉乳头组织，一抗按以下稀释使用：1: 500(抗a-味蛋白SantaCruz，抗 PLC-2 SantaCruz)。该步骤后，与稀释于封闭缓冲液中的二抗室温下孵育30min。二抗为抗 兔IgG Alexa 635(Molecular卩1'(^68，1]3厶）。用？133和水洗涤后，利用带0厶？1的 VectasMeld? (Vector Laboratories)安装玻片。在20倍放大倍数下，对至少三个视场中 的免疫反应性细胞细胞进行计数。用Le:ica?TCS SP2光谱共聚焦显微镜（Leica Microsystems Inc.)获取图像。GFP的激发波长为405nm，AlexaFlu〇r?633的激发波长为 633nm，在合适的波长下检测发射光。
[0109]通过在3行和2帧平均化的10 2 4 x 10 2 4像素格式下的单向扫描，使用L e i C a⑧ Scanware软件获取共聚焦图像。计算机控制的数字缩放被用于增加放大率至20倍物镜下最 大2.3倍。利用LCS软件（Leica Microsystems Inc.)和AdobePh〇tOsll〇p?elements 2.0 (Adobe Systems Inc.)安排图像并细微调整对比度和亮度。
[0110] 0.1?熟阵列的4€€}〇1161：1'11分析
[0111] 利用标准技术从培养的人菌状味觉乳头味觉细胞获得RNA。根据生产商推荐的方 案，用AffymetrixGeneChip?试剂盒(Affymetrix，Santa Clara，CA)处理总RNA以用于微 阵列。
[0112] E.钙成像：
[0113] 测量响应于刺激的细胞内钙水平改变。培养的人菌状和小鼠味觉乳头细胞接种于 15mm玻片。用改良林格氏溶液中 10mg/mLPlur〇nic?.F127(Molecular Probes Inc ?)中 ImM Fura_2AM(Molecular Probes Inc. )36°C下加载细胞1小时。各种气味，苦味混合物[苯硫脈 (PTC，2mM)和苯甲地那铵（2mM)，水杨苷（5mM)];和混合物A[大鼠生化分析中产cAMP气味 (Breer and Boekhoff,1991,Chem.Senses,16(1):19-29,and Restrepo et al,1993, J. Gen. Physiol ,102: 907-924);将上述两篇文献通过援引的方式并入本文](lOOrnM): hedione，香叶醇，苯乙醇，citralva，香茅醛和丁子香酸，];和混合物B[大鼠生化分析中产 IP3气味（Breer和Breer andBoekhoff, 1991 和Restrepo et al 1993)](100mM):新铃兰酸， 铃兰醛，三乙胺，乙基香草醛，异戊酸和苯乙胺])稀释于林格氏液中，林格氏液制备为pH调 整至7.2和渗透压调整至300mmol/kg。将盖玻片置于p4室系利用激发波长380nm，在倒置焚 光显微镜下将细胞可视化。利用PTI软件完成刺激选择和递送、聚焦和图像获取。图像获取 后，选择细胞上的目的区域(R0I)以背景对照区域，用于测量荧光比和强度值。首先，用林格 氏液洗涤培养的味觉乳头细胞l_3min，然后开始刺激递送。每个刺激递送3〇 sec-lmin，然后 用林格氏液洗出约2min。随后在Excel分析细胞的比值数据，以确定哪个细胞响应为细胞内 钙显著改变。钙成像后，用4%PFA固定玻片lOminJBS洗涤3次。在钙成像之前或之后，在荧 光成像显微镜或共聚焦显微镜下，观察细胞的GFP特异性信号，并且观察嗅觉响应特异性细 胞的共定位。
[0114] 实施例2-遗传修饰小鼠的味觉乳头组织中嗅觉受体启动子下的GFP表达
[0115] 本研究展示了人和小鼠味觉乳头细胞上生理活性嗅觉受体的表达。在共聚焦显微 镜下检查获自遗传修饰为在M71、17或丁子香酚(EG)启动子的控制下表达GFP的小鼠的味觉 乳头组织。GFP在转基因小鼠的味觉乳头中表达，表明味觉乳头细胞中I7、M71和丁子香酚受 体的存在。发现GFP的表达特异性位于味觉乳头中。如图1A-1D所示，mOR-17-GFP转基因小鼠 表现出轮廓味觉乳头中绿色荧光蛋白的表达。如图2A-2C所示，m0R-M71-GFP转基因小鼠表 现出轮廓味觉乳头中绿色荧光蛋白的表达。m0R-EG-GFP转基因小鼠表现出轮廓味觉乳头中 GFP的表达（图 3A-3C和4A-4B)。
[0116] 当用II型味觉细胞标志物(PLC-b2和味蛋白）对味觉组织进行染色时，观察到GFP 和PLC-b2及味蛋白表达在味觉乳头细胞中的共定位。PLC-b2表达显示为与GFP表达共定位 于m0R-17-GFP小鼠（图 5A-5D)，m0R-M71-GFP转基因小鼠（图 6A-6D)和m0R-EG-GFP转基因小 鼠（图7A-7D)的轮廓乳头。味蛋白表达也与GF表达共定位于m0R-M71-GFP转基因小鼠（图8A-8D)和m0R-EG-GFP转基因小鼠（图9A-9D)的轮廓乳头。
[0117] 在对照实验中，未观察到来自野生小鼠(ml29)(不具有任何GFP表达载体)的GFP人 为信号（图10A-10D)。新鲜分离的ml2味觉细胞也不表达GFP，而来自m0R-M71-GFP小鼠的新 鲜分离的味觉组织表达GFP(图11 A-l 1D)。有趣的是，小鼠丝状乳头表达GFP蛋白，这表明舌 的非味觉细胞中可能存在嗅觉受体。
[0118] 除小鼠组织之外，还在培养的人菌状味觉乳头细胞(HB0)中检测嗅觉受体的存在。 用0R8D1受体抗体(SantaCruz)对培养的人菌状味觉乳头(HB0)细胞进行染色，指示0R8D1蛋 白的表达（图12A-12C)。利用肽抑制测试检测0R8D1的特异性。具体而言，0R8D1抗体与其自 身的特异性肽预先孵育，以确定0R8D1免疫反应性的特异性。与其特异性肽孵育的0R8D1抗 体导致0R8D1特异性免疫反应性的完全消除（图12D-12F)。
[0119] 实施例4-哺乳动物味觉细胞的嗅觉性质
[0120]培养的人菌状味觉乳头的Affymetrix RNA分析展示了多于400种嗅觉受体相关 mRNA的存在。还检测了哺乳动物味觉细胞的功能性嗅觉特征。
[0121] 具体而言，通过钙成像检测培养的野生(ml29)、M71和丁子香酚小鼠味觉细胞以及 培养的人菌状味觉乳头细胞的嗅觉特征，其中用对某些嗅觉受体具有特异性的不同的气 味。我们发现，来自野生(ml29)和转基因小鼠以及来自人的培养的味觉乳头细胞表现出对 理想浓度下（100uM)的受体特异性有味物质的强应答，表明哺乳动物味觉细胞中气味特异 性受体的存在。我们还进一步证实，响应于有味物质的培养的味觉细胞响应于苦味混合物。 具体而言，m0R-M71-GFP小鼠味觉细胞培养物(第2天至第6天)表现出对乙酰苯(未限制）和 乙酰苯和苦味混合物（图13)的应答。获自m0R-M71-GFP小鼠的培养的味觉乳头细胞响应于 受体特异性气味，苯甲醛和苦味混合物（图14)。获自m0R-M71-GFP小鼠的培养的味觉乳头细 胞响应于受体特异性气味，乙酰苯和苯甲醛和苦味混合物(图15)。
[0122] 此外，获自mOR-EG-GFP小鼠的培养的味觉乳头细胞响应于受体特异性气味，丁子 香酚(图16)。获自mOR-EG-GFP小鼠的培养的(第四天)小鼠味觉细胞响应于苦味混合物和混 合物A(未显示）。获自mOR-EG-GFP小鼠的培养的味觉乳头细胞响应于苦味混合物和混合物A (图17)。培养的野生小鼠（ml29)味觉乳头细胞响应于苯甲醛（图21)，混合物A(图19)，乙酰 苯(图20)和混合物B(图21)。
[0123] 我们发现，培养的人菌状味觉乳头细胞表现出对理想浓度下（100UM)特异性有味 物质的应答，表明哺乳动物味觉细胞中存在气味特异性受体。我们还发现，响应于有味物质 的培养的味觉细胞响应于苦味混合物。为了证实气味响应性细胞和苦味响应性细胞之间的 关联，在钙成像后固定细胞。获自人舌的培养的菌状味觉乳头(HB0)细胞对混合物A和混合 物B (图22)敏感。培养的人味觉细胞响应于气味刺激。利用fura-2标准钙成像系统测量培养 的人菌状味觉细胞中细胞内钙水平（[Ca2+] i)的改变。刺激物溶解于林格氏溶液，并调整pH 和摩尔渗透压浓度。图显示了暴露于气味过程中个体细胞的[Ca+2]i水平的代表性改变。
[0124] 获自人舌的培养的HB0细胞对丁子香酚敏感（图23)。参与该应答的可能的受体为 人OR? 18 (或小鼠01 f r73)。获自人舌的培养的HB0细胞对己酸敏感（图24)。参与该应答的一 种可能的受体为人〇R51Ll(或小鼠01fr64和/或01fr653)。获自人舌的培养的HB0细胞还对 香豆素敏感（图25)。参与该应答的可能的受体为人0R2J2,0R2W1和0R5P3(或小鼠01frl519， 01fr749,01frl352,01frl079,01frl377,01fr556,01frl341,01frl062,01frl09,01fr508, 01fr983，01fr876，01frl104，和01fr895)。
[0125] 获自人舌的培养的HB0细胞对乙酰苯敏感（图26)。参与该应答的可能的受体为人 0R2W1 和 0R5P3(或小鼠 01fr749,01fr 1352, Olfr 1079, Olfr 1377,01fr556,01fr 1341， 01frl062,01frl09,01fr983,01fr876,01frll04,01fr895,01frl68,01fr429,01frl67和 01斤151)。获自人舌的培养的1?0细胞对庚醛敏感（图27)。参与该应答的可能的受体为 0R2W1 (或小鼠01frl7)。获自人舌的培养的HBO细胞对新铃兰醛敏感（图28)。参与该应答的 一种可能的受体为人〇Rl〇J5(或小鼠01frl5和01frl6)。
[0126] 实施例5-气味响应性细胞和苦味响应性细胞之间的关联
[0127] 钙成像后，固定获自mOR-EG-GFP转基因小鼠的培养的味觉细胞。用于钙成像的视 图和响应性细胞被定位。我们发现，响应性细胞表达GFP，表明有味物质刺激细胞而表达其 自身的受体。我们还观察到，有味物质响应性和GFP阳性细胞还能响应于苦味刺激。具体而 言，图29A-29C显示了，妈成像后，mOR-EG-GFP培养的味觉乳头细胞响应于丁子香酚。图30A-30C显示了，钙成像后，m0R-M71-GFP培养的味觉乳头细胞响应于乙酰苯。用于钙成像的视图 和响应性细胞被定位。我们发现，响应性细胞表达GFP，表明有味物质刺激细胞而表达其自 身的受体。我们还观察到，有味物质响应性和GFP阳性细胞还能响应于苦味刺激。
[0128] 实施例6-细胞中气味受体的瞬时表达
[0129] 在一个研究中，用约1.5微克的具有伴侣DNA(受体转运蛋白1短形式(RTP1S)和M3 (毒蕈碱乙酰胆碱受体）的嗅觉受体DNA 0RS6(也为01fr544，GenBank序列参考号NM_ 020289.2) 和具有伴侣0麻（打？15和]?3)的嗅觉受体01?240(也为01?704;6611831^号匪 001005191.2) 转染培养的人味觉(耶0)细胞。伴侣0嫩在上文引用的而2012中鉴定。
[0130]利用Lipofectamine 2000试剂，按照生产商的建议实施转染。过夜孵育后，更换培 养基再孵育24小时，然后利用受体特异性气味（例如，雄（留）烷二酮对于0R7D4/240为特异 性，癸二酸(Nonanedionic acid)对于S6为特异性气味）进行手动妈成像。参见，图31A和 31B。虽然未显示，30或100微摩尔浓度下也发生应答。
[0131 ]相似地，永生化人菌状味觉乳头(Ulduz)细胞响应于受体特异性气味，庚醛，乙酰 苯，甲基肉桂，丁子香酚和新铃兰醛。参见，图32A-32E。
[0132]将本说明书引用的全部出版物并且特别是2013年12月16日提交的US临时专利申 请61/916423通过援引的方式并入本文。虽然结合具体方案描述了本发明，但是应当理解， 可以不脱离本发明的实质进行改变。这样的改变也意图落入后附权利要求的范围。
【主权项】
1. 哺乳动物味觉乳头细胞、细胞系或其细胞膜，其中所述细胞、细胞系或细胞膜表达可 操作地连接于报告物的嗅觉受体或表达异源嗅觉受体。2. 如权利要求1所述的细胞或细胞膜，其中所述细胞是原代细胞、永生化细胞、非人哺 乳动物细胞、人细胞、鼠细胞、轮廓味觉乳头细胞、菌状味觉乳头细胞或叶状味觉乳头细胞。3. 如权利要求1所述的细胞或细胞膜，其中所述嗅觉受体是哺乳动物嗅觉受体。4. 如权利要求1所述的细胞或细胞膜，其中所述嗅觉受体是人嗅觉受体或鼠嗅觉受体。5. 如权利要求1所述的细胞或细胞膜，其中所述嗅觉受体是异源或外源嗅觉受体。6. 鉴定嗅觉受体的调节剂的方法，所述方法包括： 在存在和不存在测试剂的情况下，检测味觉乳头细胞或味觉乳头细胞膜的所述嗅觉受 体的活性；以及 如果相对于不存在所述测试剂的情况下所述嗅觉受体的活性，存在所述测试剂的情况 下受体活性升高或降低，则将所述测试剂鉴定为所述嗅觉受体的调节剂。7. 如权利要求6所述的方法，其中检测存在所述测试剂的情况下所述嗅觉受体的活性 的步骤包括： (a) 使所述味觉乳头细胞或所述味觉乳头细胞膜与所述测试剂接触； (b) 测定细胞内Ca2+水平;或 (c) 检测报告物。8. 如权利要求6所述的方法，其中所述味觉乳头细胞或味觉乳头细胞膜是哺乳动物味 觉乳头细胞、细胞系或其细胞膜，其中所述细胞或细胞膜表达可操作地连接于报告物的嗅 觉受体。9. 如权利要求6所述的方法，其中所述味觉乳头细胞或味觉乳头细胞膜是非人哺乳动 物细胞、人细胞、鼠细胞、永生化味觉乳头细胞、获自永生化味觉乳头细胞的味觉乳头细胞 膜、原代味觉乳头细胞、获自原代味觉乳头细胞的味觉乳头细胞膜、轮廓味觉乳头细胞或轮 廓味觉乳头细胞膜、菌状味觉乳头细胞或菌状味觉乳头细胞膜、或叶状味觉乳头细胞或叶 状味觉乳头细胞膜。10. 如权利要求1所述的方法，其中所述测试剂是天然物质、合成物质、有味分子、非人 哺乳动物嗅觉受体、人嗅觉受体、鼠嗅觉受体、或异源或外源嗅觉受体。11. 鉴定嗅觉受体的方法，包括 (a) 使包含嗅觉受体的味觉乳头细胞、细胞系或味觉乳头细胞膜与测试剂接触；以及 (b) 检测所述嗅觉受体的活性。12. 如权利要求11所述的方法，其中所述检测包括检报告物或测定细胞内Ca2+水平。13. 如权利要求11所述的方法，其中所述味觉乳头细胞，细胞系或细胞膜为非人哺乳动 物细胞、人细胞、鼠细胞、永生化细胞、获自永生化味觉乳头细胞的细胞膜、原代细胞、获自 原代味觉乳头细胞的细胞膜、轮廓味觉乳头细胞或细胞膜、菌状味觉乳头细胞或细胞膜、或 叶状味觉乳头细胞或细胞膜。14. 如权利要求11所述的方法，其中所述嗅觉受体为非人哺乳动物嗅觉受体、人嗅觉受 体、鼠嗅觉受体、或异源嗅觉受体。15. 如权利要求11所述的方法，其中所述测试剂为有味分子。16. 如权利要求11所述的方法，还包括以下步骤:c)基于所述活性，检测嗅觉受体配体 存在或不存在。17. 鉴定嗅觉受体配体的增强剂或阻断剂的方法，包括： (a) 在存在嗅觉受体配体的情况下，使包含所述嗅觉受体的味觉乳头细胞或味觉乳头 细胞膜与测试剂接触；以及 (b) 在存在和不存在所述测试剂的情况下，检测所述嗅觉受体的活性， 其中如果在所述测试剂存在的情况下所述嗅觉受体的活性相对于不存在所述测试剂 的情况下所述嗅觉受体的活性升高，则所述测试剂为所述嗅觉受体配体的增强剂；以及 其中如果在所述测试剂存在的情况下所述嗅觉受体的活性相对于不存在所述测试剂 的情况下所述嗅觉受体的活性降低，则所述测试剂为所述嗅觉受体配体的阻断剂。18. 如权利要求17所述的方法，其中所述检测包括检测报告物或测定细胞内Ca2+水平。19. 如权利要求17所述的方法，其中所述味觉乳头细胞，细胞系或细胞膜为非人哺乳动 物细胞、人细胞、鼠细胞、永生化细胞、获自永生化味觉乳头细胞的细胞膜、原代细胞、获自 原代味觉乳头细胞的细胞膜、轮廓味觉乳头细胞或细胞膜、菌状味觉乳头细胞或细胞膜、或 叶状味觉乳头细胞或细胞膜。20. 如权利要求17所述的方法，其中所述嗅觉受体为非人哺乳动物嗅觉受体、人嗅觉受 体、鼠嗅觉受体、或异源嗅觉受体。21. 如权利要求17所述的方法，其中所述测试剂为有味分子。22. 如权利要求17所述的方法，其中所述测试剂与嗅觉受体配体竞争结合所述嗅觉受 体。23. 用于将物质鉴定为有味物质或嗅觉受体配体的阻断剂或增强剂的试剂盒，所述试 剂盒包括哺乳动物味觉乳头细胞或细胞膜和说明书。24. 如权利要求23所述的试剂盒，还包含能实现响应于所述物质的所述嗅觉受体的活 性检测的报告物。25. 如权利要求23所述的试剂盒，其中所述味觉乳头细胞，细胞系或细胞膜为非人哺乳 动物细胞、人细胞、鼠细胞、永生化细胞、获自永生化味觉乳头细胞的细胞膜、原代细胞、获 自原代味觉乳头细胞的细胞膜、轮廓味觉乳头细胞或细胞膜、菌状味觉乳头细胞或细胞膜、 或叶状味觉乳头细胞或细胞膜。26. 如权利要求23所述的试剂盒，其中所述味觉乳头细胞或细胞膜包含哺乳动物嗅觉 受体或人嗅觉受体或鼠嗅觉受体或异源嗅觉受体。27. 如权利要求23所述的试剂盒，还包含已知的有味物质。28. 如权利要求23所述的试剂盒，包含哺乳动物味觉乳头细胞、细胞系或其细胞膜，其 中所述细胞、细胞系或细胞膜表达可操作地连接于报告物的嗅觉受体或表达异源嗅觉受 体。
【文档编号】G01N33/566GK105917228SQ201480072908
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2014年12月15日
【发明人】哈坎·欧泽德·穆罕默德
【申请人】莫奈尔化学感官中心