一种昆虫成虫石蜡切片染色方法
【专利摘要】一种昆虫成虫石蜡切片染色方法，属于显微组织切片技术领域，包括组织固定、组织脱水、组织透明、浸蜡、包埋与切片、展片与烘片、脱蜡和组织复水、染色、脱水与透明、封片和观察，最终切片对组织区分度高，能够清晰观察到虫体内各个器官及组织的空间结构，适用于体壁坚硬、体腔液体含量较少的成虫虫体材料。采用该方法处理蚤蝇成虫虫体，在显微镜下可以清晰地观察到内部消化系统、排泄系统、神经系统、呼吸系统、循环系统及生殖系统。本发明昆虫成虫整体石蜡切片方法不仅可以填补昆虫成虫内部器官及组织观察的空白，还可以弥补局部观察的不足，为昆虫系统发育分析提供分类特征，操作简单，耗时短，成本低。
【专利说明】一种昆虫成虫石蜡切片染色方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及一种昆虫成虫石蜡切片染色方法，属于显微组织切片技术领域，特别是涉及一种昆虫成虫石蜡切片染色方法。
【背景技术】
[0003]昆虫石蜡切片及染色技术是研究昆虫组织形态及组织病理的重要实验技术，一般包括解剖、固定、脱水透明、包埋、切片、染色等步骤。目前石蜡切片及染色技术多用于昆虫幼虫及成虫的局部组织或器官，如触角、消化道、足等。这样不能观察到昆虫成虫内部整体器官及组织的空间结构。成虫的内部器官形态不仅反映其生理特征，并由于内部结构较之外部形态受环境影响小，常常更有着种的稳定性。但因成虫外骨骼坚硬，体腔液体含量少，目前常规的切片方法难以制作完整的石蜡切片;而成虫局部组织或器官的切片方法不仅操作复杂，耗时长，且常需要真空负压处理等较高级仪器设备，更重要的是最终固定、包埋、切片等的处理效果不够理想，最终局部切片对组织区分度十分有限，难以观察到完整虫体内部各系统及器官的空间结构。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种昆虫成虫石蜡切片染色方法，此方法不仅操作简单、耗时短、成本低，还能够清晰观察到虫体内各个器官及组织的空间结构。
[0005]本发明所采用的技术方案是:
一种昆虫成虫石蜡切片染色方法，包括以下步骤:
(I)组织固定:
取去除足和翅的昆虫虫体浸于组织固定液中，室温下静置I小时，再于4°C下静置12小时;组织固定液为:浓度为0.5%的Tr i tonX-100-4%多聚甲醛混合固定液。保存温度为零下200C，用量与虫体体积比为50:1。
[0006](2)组织脱水:
将经过(I)处理后的虫体取出，在4°C条件下，蒸馏水进行漂洗，再于室温下依次用浓度梯度为70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液脱水，每个梯度的处理时间为20分钟；蒸馏水与乙醇用量与虫体的体积比为50:1。
[0007](3)组织透明:
将经过(2)处理后的虫体取出，室温下依次在二甲苯:乙醇1:3混合液、二甲苯:乙醇1:1混合液中浸泡1分钟，再在纯二甲苯溶液中浸泡5分钟；
(4)浸蜡、包埋与切片；
将经过(3)处理后的虫体取出，在55°C的液体石蜡:二甲苯1:1混合液中浸泡2小时，再于60°C的液体石蜡中浸泡4小时，经过冷却、凝固、定形后取出，进行切片； (5)展片与烘片:
取切片移至涂抹过粘片剂并预热至55°C的载玻片上，切片立即自然完全舒展，再置于370C条件下12小时烘片;粘片剂的组成为:蛋白液、甘油、水杨酸钠。其比例为10:10:1。
[0008](6)脱蜡和组织复水:
取烘片后的载玻片浸泡在二甲苯溶液中，保持5分钟，再依次浸泡浓度梯度为100%、95%、90%、80%、70%的乙醇溶液，再浸泡于蒸馏水中，每个梯度的处理时间为I?3分钟。
[0009](7)染色:
取组织复水后的载玻片浸泡在苏木精溶液中，保持5分钟，移至蒸馏水中漂洗I分钟，再移至返蓝液浸泡I分钟，再于分化液中30秒，最后于伊红溶液中染色2分钟。
[0010](8)脱水与透明:
取染色后的载玻片进行蒸馏水漂洗5分钟，再依次浸泡在浓度梯度为70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液中2?5分钟，移至二甲苯溶液中浸泡3分钟。
[0011](9)封片和观察
在切片组织上滴加中性树胶，盖上盖玻片，置于通风橱中进行晾干后，在显微镜下观察。
[0012]本发明的有益效果:
本发明中昆虫成虫石蜡切片方法，操作简单，耗时短，成本低，最终切片对组织区分度高，能够清晰观察到虫体内各个器官及组织的空间结构，适用于体壁坚硬、体腔液体含量较少的成虫虫体材料。采用该方法处理蚤蝇成虫虫体，在显微镜下可以清晰地观察到内部消化系统、排泄系统、神经系统、呼吸系统、循环系统及生殖系统。本发明昆虫成虫整体石蜡切片方法不仅可以填补昆虫成虫内部器官及组织观察的空白，还可以弥补局部观察的不足，为昆虫系统发育分析提供分类特征。
【附图说明】
[0013]
图1为雌性蚤蝇成虫腹部横切图；
图2为雄性蚤蝇成虫整体纵切图。
【具体实施方式】
[0014]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0015]实施例1
本实施例中为蚤蝇成虫石蜡切片方法，包括以下步骤:
1、组织固定
在化学通风橱中配制浓度0.5%的1'1'；[1:01^-100-4%多聚甲醛混合固定液。
[0016]固定流程为:将试供虫体收集后置于冰床上，去除足和翅后直接投放到混合固定液中，固定液的量与虫体体积比为50:1，4°C温度下静置12小时;试验昆虫为人工智能培养箱中饲养蚤蝇成虫，饲养温度26 0C，相对湿度70%
2、组织脱水
将经过(I)处理后的虫体取出，在4°C条件下，蒸馏水进行漂洗，再于室温下依次用浓度梯度为70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液脱水，每个梯度的处理时间为20分钟；蒸馏水与乙醇用量与虫体的体积比为50:1。
[0017]3、组织透明:
将经过(2)处理后的虫体取出，室温下依次在二甲苯:乙醇1:3混合液、二甲苯:乙醇1:1混合液中浸泡1分钟，再在纯二甲苯溶液中浸泡5分钟；
4、浸蜡、包埋与切片；
将经过(3)处理后的虫体取出，在55°C的液体石蜡:二甲苯1:1混合液中浸泡2小时，再于60°C的液体石蜡中浸泡4小时，经过冷却、凝固、定形后取出，进行切片；
5、展片与烘片:
取切片移至涂抹过粘片剂并预热至55°C的载玻片上，切片立即自然完全舒展，再置于370C条件下12小时烘片;粘片剂的组成为:蛋白液、甘油、水杨酸钠。其比例为10:10:1。
[0018]6、脱蜡和组织复水:
取烘片后的载玻片浸泡在二甲苯溶液中，保持5分钟，再依次浸泡浓度梯度为100%、95%、90%、80%、70%的乙醇溶液，再浸泡于蒸馏水中，每个梯度的处理时间为I?3分钟。
[0019]7、染色:
取组织复水后的载玻片浸泡在苏木精溶液中，保持5分钟，移至蒸馏水中漂洗I分钟，再移至返蓝液浸泡I分钟，再于分化液中30秒，最后于伊红溶液中染色2分钟。
[0020]8、脱水与透明:
取染色后的载玻片进行蒸馏水漂洗5分钟，再依次浸泡在浓度梯度为70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液中2?5分钟，移至二甲苯溶液中浸泡3分钟。
[0021]9、封片和观察
在切片组织上滴加中性树胶，盖上盖玻片，置于通风橱中进行晾干后，在显微镜下观察。
[0022]在显微镜下可以清晰地观察到内部消化系统、排泄系统、神经系统、呼吸系统、循环系统及生殖系统见图1，图2。
【主权项】
1.一种昆虫成虫石蜡切片染色方法，其特征在于，所述方法包括以下过程: 组织固定: 取去除足和翅的昆虫虫体浸于组织固定液中，室温下静置I小时，再于4°C下静置12小时;组织固定液为:浓度为0.5%的TritonX-100-4%多聚甲醛混合固定液;保存温度为零下200C，用量与虫体体积比为50:1; (2)组织脱水: 将经过(I)处理后的虫体取出，在4°C条件下，蒸馏水进行漂洗，再于室温下依次用浓度梯度为70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液脱水，每个梯度的处理时间为20分钟；蒸馏水与乙醇用量与虫体的体积比为50:1 ； (3)组织透明: 将经过(2)处理后的虫体取出，室温下依次在二甲苯:乙醇1:3混合液、二甲苯:乙醇1:1混合液中浸泡1分钟，再在纯二甲苯溶液中浸泡5分钟； (4)浸蜡、包埋与切片； 将经过(3)处理后的虫体取出，在55°C的液体石蜡:二甲苯1:1混合液中浸泡2小时，再于60°C的液体石蜡中浸泡4小时，经过冷却、凝固、定形后取出，进行切片； (5)展片与烘片: 取切片移至涂抹过粘片剂并预热至55°C的载玻片上，切片立即自然完全舒展，再置于37°C条件下12小时烘片;粘片剂的组成为:蛋白液、甘油、水杨酸钠;其比例为10:10:1； (6)脱蜡和组织复水: 取烘片后的载玻片浸泡在二甲苯溶液中，保持5分钟，再依次浸泡浓度梯度为100%、95%、90%、80%、70%的乙醇溶液，再浸泡于蒸馏水中，每个梯度的处理时间为I?3分钟； (7)染色: 取组织复水后的载玻片浸泡在苏木精溶液中，保持5分钟，移至蒸馏水中漂洗I分钟，再移至返蓝液浸泡I分钟，再于分化液中30秒，最后于伊红溶液中染色2分钟； (8)脱水与透明: 取染色后的载玻片进行蒸馏水漂洗5分钟，再依次浸泡在浓度梯度为70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液中2?5分钟，移至二甲苯溶液中浸泡3分钟； (9)封片和观察 在切片组织上滴加中性树胶，盖上盖玻片，置于通风橱中进行晾干后，在显微镜下观察。
【文档编号】G01N1/30GK105928752SQ201610226169
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月13日
【发明人】刘广纯, 褚梦颖, 冯典兴
【申请人】沈阳大学