一种中药材红外光谱边分离边分析多级宏观指纹鉴定方法
【专利摘要】本发明提供一种中药材红外光谱边分离边分析多级宏观指纹鉴定方法，包括以下步骤：取样品，置于红外光谱仪上，测定原药材及各萃取部位样品的红外光谱图；将各红外光谱图分别进行二阶求导；得到上述相应各红外光谱图的二阶导数谱；将所压样品装入变温附件，温度程控50～180℃，温度从50℃逐步升高，每升温10℃采集一次红外光谱，经二维相关分析软件处理采集的系列光谱—变温动态谱，即获得二维红外相关光谱。分析各红外光谱图中主要特征峰的归属，本发明将红外光谱的宏观指纹特性应用于中药提取物的质量监控，从整体上对中药提取物的质量进行控制，不仅快速、有效、可行，而且安全、绿色、环保，能够为中药提取物走向国际提供技术支撑。
【专利说明】
一种中药材红外光谱边分离边分析多级宏观指纹鉴定方法
技术领域
[0001] 本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种中药材红外光谱边分离边分析多级 宏观指纹鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 20 15版《中国药典》收载的老鹳草为栊牛儿苗科植物栊牛儿苗（Erodium stehaianum Willd.)、老鹤草（Geranium wilfordii Maxim.)或野老鹤草（Geranium carolinianum L.)的干燥地上部分。具有祛风湿，通经络，止泻痢等作用。特别是近年医学 研究发现，老鹳草中的鞣质类物质对肿瘤方面的疾病有突出的疗效。但成分复杂的老鹳草 药材及其提取物的分析质控目前仍然是难题。
[0003]红外光谱法又称"红外分光光度分析法"。是分子吸收光谱的一种。根据不同物质 会有选择性的吸收红外光区的电磁辐射来进行结构分析;对各种吸收红外光的化合物的定 量和定性分析的一种方法。物质是由不断振动的状态的原子构成，这些原子振动频率与红 外光的振动频率相当。用红外光照射有机物时，分子吸收红外光会发生振动能级跃迀，不同 的化学键或官能团吸收频率不同，每个有机物分子只吸收与其分子振动、转动频率相一致 的红外光谱，所得到的吸收光谱通常称为红外吸收光谱，简称红外光谱"IR"，。对红外光谱 进行分析，可对物质进行定性分析。各个物质的含量也将反映在红外吸收光谱上，可根据峰 位置、吸收强度进行定量分析。如文献"丹参丹酚酸边分离边分析的红外光谱法研究"（第十 七届全国分子光谱学学术会议论文集2012-10-19)采用边分离边分析的红外光谱法快速监 控并分析了丹参总丹酚酸从丹参原药材到总丹酚酸局部再到丹酚酸B单体的整个提取过 程。结果表明，各级组分都有各自的红外光谱指纹特征。
【发明内容】
[0004] 本发明为解决上述技术问题提供一种快速、有效、可行，而且安全、绿色、环保的一 种中药材红外光谱边分离边分析多级宏观指纹鉴定方法。
[0005] 本发明为解决上述技术问题所采取的方案为:一种中药材红外光谱边分离边分析 多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于以下步骤： 先将中药材切断、粉碎、并过200目筛； 在上述所得药材粉末中，加入提取剂，提取60min，过滤，回收提取剂，得水溶液； 将水溶液依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各提取液经过减压浓缩后得到氯仿层、 乙酸乙酯层、正丁醇层和水层； 制样:加入溴化钾粉末进行压片制样，得压片试样； 测定所述压片试样的红外光谱图； 采用软件对所述的红外光谱图二阶导数谱解析，得二阶导数谱； 测定所述压片试样的二维相关红外谱； 依次分级对比相应图谱，即可对各提取部位样品的主体成分、特征成分以及无机成分 等进行分析鉴定； 其中，上述预处理步骤中的提取剂为1-4份丙酮、2-5份乙酸乙酯、1-9份甲醇、1-70份 水，因其取得效果的机理尚不明确可能是叠加产生了意料不到的效果或协同交互作用。
[0006]优选的，上述预处理步骤中的提取剂为3份丙酮、2份乙酸乙酯、9份甲醇、60份水。 [0007]或者，上述预处理步骤中的提取剂为2份丙酮、4份乙酸乙酯、7份甲醇、68份水。 [0008]或者，上述预处理步骤中的提取剂为1份丙酮、3份乙酸乙酯、5份甲醇、55份水。 [0009]或者，上述预处理步骤中的提取剂为4份丙酮、2份乙酸乙酯、3份甲醇、49份水。 [0010]上述的红外光谱图二阶导数谱解析温度程控为50~180°C。
[0011] 上述的提取方法为超声提取，利用超声振动使乙醇快速的进入药材粉末中，是其 所含有机成分尽可能完全地溶于溶剂中。
[0012] 与现有技术相比，本发明所具有的优点在于： 1、提取剂配方合理，可以充分提取中药材成分、脱除率高，且摄取用量少。
[0013] 2、采用红外光谱技术对中药材的提取分离过程进行了实时监控，记录了提取分离 过程中整体化学信息的动态变化规律，建立了以红外宏观指纹法为先导的"边分离边分析" 技术。
[0014]
【附图说明】： 图1:老鹳草与老鹳草素的红外光谱(4000~400cm-l) 图2:老鹳草与老鹳草素的二阶导数谱（1800~700cm-l) 图3:不同样品的红外光谱图（4000~400 cm-1) a.氯仿层b.乙酸乙酯层c.正丁醇层d. 水层e.老鹳草素 f.硝酸钾 图4:不同样品的二阶导数谱图（1800~700 cm-1) a.氯仿层b.乙酸乙酯层c.正丁醇层 d.水层e.老鹳草素 f.硝酸钾 图5:老鹳草丙酮提取物的四个提取层的二维同步相关红外光谱(1800~1000 cm-l)a. 氯仿层b.乙酸乙酯层c.正丁醇层d.水层e.硝酸钾 图6:硝酸钾的二维同步相关红外光谱（1800~1000 cm-1)。
【具体实施方式】
[0015]以下结合附图和实施例作进一步详细描述： 实施例1: 1、一种中药材红外光谱边分离边分析多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于以下步骤： 1) 先将中药材切断、粉碎、并过200目筛； 2) 在上述所得药材粉末中，加入提取剂，提取60min，过滤，回收提取剂，得水溶液； 3) 将水溶液依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各提取液经过减压浓缩后得到氯仿 层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层； 4) 制样:加入溴化钾粉末进行压片制样，得压片试样； 5) 测定所述压片试样的红外光谱图； 6) 采用软件对所述的红外光谱图二阶导数谱解析，得二阶导数谱； 7) 测定所述压片试样的二维相关红外谱； 8) 依次分级对比相应图谱，即可对各提取部位样品的主体成分、特征成分以及无机成 分等进行分析鉴定； 其中，所述预处理步骤中的提取剂为1-4份丙酮、2-5份乙酸乙酯、1-9份甲醇、1-70份 水。
[0016]优选的，上述预处理步骤中的提取剂为3份丙酮、2份乙酸乙酯、9份甲醇、60份水。 [0017]或者，上述预处理步骤中的提取剂为2份丙酮、4份乙酸乙酯、7份甲醇、68份水。 [0018]或者，上述预处理步骤中的提取剂为1份丙酮、3份乙酸乙酯、5份甲醇、55份水。
[0019] 或者，上述预处理步骤中的提取剂为4份丙酮、2份乙酸乙酯、3份甲醇、49份水。
[0020] 上述的红外光谱图二阶导数谱解析温度程控为50~180°C。实施例2:老鹳草原药 材主体成分分析 实施例2: 实验方法： 用KBr压片法制样，获得原药材在室温下的红外光谱图。用PerkinElmer公司的 Spectrum v6.02软件进行二阶导数图谱解析，平滑点数为13点。老鹳草中含有鞣质类、黄酮 类成分以及糖类成分。1730、1618~1445 cm-1主要归属于老鹳草素及其衍生物的鞣质类 物质的吸收峰。在1337 cm-1处的吸收峰为酸类分子的0-H弯曲振动，1232 cm-1为糖类分子 C-0伸缩振动吸收，在1048 cm-1处的C-0强吸收峰则来自于糖苷类成分;老鹳草二阶导数谱 提高了图谱表观分辨率，原图谱中吸收峰被分解成多个峰，1746 cm-1处出现酯类分子C=0 伸缩振动，说明原药材中也有少量酯类成分。1618~1445 cm-1苯环骨架振动吸收峰被突显 出来，证实鞣质类以及少量黄酮类成分(另有1659 cm-1)的存在。
[0021] 实施例3:老鹳草不同萃取部位红外光谱以及二阶导数光谱分析 实验方法： 先将中药材加提取物超声提取60min(提取物为3份丙酮、2份乙酸乙酯、9份甲醇、60份 水），过滤，回收提取物，水溶液依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将各提取液经过减压浓 缩后得到氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层，加入溴化钾粉末进行压片制样，获得各萃 取层在室温下的红外光谱图。用PerkinElmer公司的Spectrum v6.02软件进行二阶导数图 谱解析，平滑点数为13点。老鹳草提取物氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层均有明显的鞣质类 成分的特征吸收峰，3600~2500 cm-1的0-H伸缩振动吸收区域有宽而强的吸收峰，1728~ 1714 cm-1酯类和酸类分子的C=0伸缩振动，和1600~1450 cm-1有明显的苯环骨架伸缩振 动峰，通过相似度比较可以看出乙酸乙酯层中多酚类成分含有较多的老鹳草素，其次为正 丁醇层、氯仿层。二阶导数谱更可清晰表明在氯仿层中有酯羰基吸收峰（1746 cm-1)，723 cm-1处吸收峰证明在氯仿层中有油脂类成分，在乙酸乙酯与正丁醇层中出现更多特征峰与 老鹳草素相对应的鞣质类特征吸收峰;水层中很强吸收峰出现在1384、825 cm-1的，检索表 明其为硝酸钾特征吸收峰。但是在原药材中未发现硝酸钾的吸收峰，可能是因为在提取过 程中对硝酸盐进行了富集，在氯仿层、乙酸乙酯层也相应地发现了硝酸钾吸收峰。
[0022] 实施例4:老鹳草不同萃取部位的二维相关红外光谱 实验方法： 将所压不同萃取部位样品装入变温附件，温度程控50~180°C，温度从50°C逐步升高， 每升温l〇°C采集一次红外光谱，经二维相关分析软件处理采集的系列光谱一变温动态谱， 即获得二维红外相关光谱。老鹳草提取物氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层与水层1800~1000 cm-1二维相关红外光谱有数量不等的明显自动峰。在乙酸乙酯层自动峰最多为10个，而水 层中只出现两个，因此可以很直观地区分四者。氯仿层1701 cm-1处酯类羰基的吸收峰随温 度升高峰强度逐渐降低；乙酸乙酯层与正丁醇层中在1629和1619 cm-1附近是鞣质类成分 相关的吸收峰随着温度升高强度也逐渐减弱。氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层提取物 的二维相关谱中均有N03-( 1383 cm-1)的一个强且尖的自动峰，且与其他自动峰的交叉峰 均为负，说明此处在温度微扰下总体变化趋势与其他自动峰变化趋势相反。另外结果表明， 正丁醇层中也含有少量的硝酸钾，虽然在其一维图谱和二阶导数图谱并没有与硝酸钾有关 的吸收峰出现，验证了二维相关光谱确实可以提高红外光谱的检测限和谱图分辨率。通过 1383 cm-1自动峰强度及其与其他峰的关系可快速判断硝酸钾的存在和相对含量。
[0023] 实施例5: 实验方法： 用KBr压片法制样，获得原药材在室温下的红外光谱图。用PerkinElmer公司的 Spectrum v6.02软件进行二阶导数图谱解析，平滑点数为13点。老鹳草中含有鞣质类、黄酮 类成分以及糖类成分。1730、1618~1445 cm-1主要归属于老鹳草素及其衍生物的鞣质类 物质的吸收峰。在1337 cm-1处的吸收峰为酸类分子的0-H弯曲振动，1232 cm-1为糖类分子 C-0伸缩振动吸收，在1048 cm-1处的C-0强吸收峰则来自于糖苷类成分;老鹳草二阶导数谱 提高了图谱表观分辨率，原图谱中吸收峰被分解成多个峰，1746 cm-1处出现酯类分子C=0 伸缩振动，说明原药材中也有少量酯类成分。1618~1445 cm-1苯环骨架振动吸收峰被突显 出来，证实鞣质类以及少量黄酮类成分(另有1659 cm-1)的存在。
[0024] 实施例6:老鹳草不同萃取部位红外光谱以及二阶导数光谱分析 实验方法： 先将中药材加提取物超声提取60min(提取物为1份丙酮、3份乙酸乙酯、5份甲醇、55份 水。），过滤，回收提取物，水溶液依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将各提取液经过减压 浓缩后得到氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层，加入溴化钾粉末进行压片制样，获得各 萃取层在室温下的红外光谱图。用PerkinElmer公司的Spectrum v6.02软件进行二阶导数 图谱解析，平滑点数为13点。老鹳草提取物氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层均有明显的鞣质 类成分的特征吸收峰，3600~2500 cm-1的0-H伸缩振动吸收区域有宽而强的吸收峰，1728 ~1714 cm-1酯类和酸类分子的C=0伸缩振动，和1600~1450 cm-1有明显的苯环骨架伸缩 振动峰，通过相似度比较可以看出乙酸乙酯层中多酚类成分含有较多的老鹳草素，其次为 正丁醇层、氯仿层。二阶导数谱更可清晰表明在氯仿层中有酯羰基吸收峰（1746 cm-l)，723 cm-1处吸收峰证明在氯仿层中有油脂类成分，在乙酸乙酯与正丁醇层中出现更多特征峰与 老鹳草素相对应的鞣质类特征吸收峰;水层中很强吸收峰出现在1384、825 cm-1的，检索表 明其为硝酸钾特征吸收峰。但是在原药材中未发现硝酸钾的吸收峰，可能是因为在提取过 程中对硝酸盐进行了富集，在氯仿层、乙酸乙酯层也相应地发现了硝酸钾吸收峰。
[0025] 实施例7:老鹳草不同萃取部位的二维相关红外光谱 实验方法： 将所压不同萃取部位样品装入变温附件，温度程控50~180°C，温度从50°C逐步升高， 每升温l〇°C采集一次红外光谱，经二维相关分析软件处理采集的系列光谱一变温动态谱， 即获得二维红外相关光谱。老鹳草提取物氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层与水层1800~1000 cm-1二维相关红外光谱有数量不等的明显自动峰。在乙酸乙酯层自动峰最多为11个，而水 层中只出现两个，因此可以很直观地区分四者。氯仿层1701 cm-1处酯类羰基的吸收峰随温 度升高峰强度逐渐降低；乙酸乙酯层与正丁醇层中在1629和1619 cm-1附近是鞣质类成分 相关的吸收峰随着温度升高强度也逐渐减弱。氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层提取物 的二维相关谱中均有N03-( 1383 cm-1)的一个强且尖的自动峰，且与其他自动峰的交叉峰 均为负，说明此处在温度微扰下总体变化趋势与其他自动峰变化趋势相反。另外结果表明， 正丁醇层中也含有少量的硝酸钾，虽然在其一维图谱和二阶导数图谱并没有与硝酸钾有关 的吸收峰出现，验证了二维相关光谱确实可以提高红外光谱的检测限和谱图分辨率。通过 1383 cm-1自动峰强度及其与其他峰的关系可快速判断硝酸钾的存在和相对含量。
[0026] 对比实验： 设置对照组，通过对比实验，如下表1，实施例较现有技术具有明显且出乎意料的产品 特性，在没有明显增加成本的情况下产品性能显著改善。
[0027] 表1对比试验结果
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉本 领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所做的更动和润饰，均应属于本发明所 附权利要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种中药材红外光谱边分离边分析多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于以下步骤： 1)先将中药材切断、粉碎、并过200目筛； 2 )在上述所得药材粉末中，加入提取剂超声提取60min，过滤，回收提取剂，得水溶液； 3) 将水溶液依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各提取液经过减压浓缩后得到氯仿 层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层； 4) 制样:加入溴化钾粉末进行压片制样，得压片试样； 5) 测定所述压片试样的红外光谱图； 6) 采用软件对所述的红外光谱图二阶导数谱解析，得二阶导数谱； 7) 测定所述的压片试样的二维相关红外谱； 8) 依次分级对比相应图谱，即可对各提取部位样品的主体成分、特征成分以及无机成 分等进行分析鉴定； 其中，所述预处理步骤中的提取剂为1-4份丙酮、2-5份乙酸乙酯、1-9份甲醇、1-70份 水。2. 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于:所述步骤6)中的红外光谱图二阶导数 谱解析温度程控为50~180°C。
【文档编号】G01N21/3563GK105928897SQ201610386026
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】孙仁爽, 滕坤, 张海丰, 胡彦武, 关颖丽, 李成华
【申请人】通化师范学院