一种碳量子点修饰的葡萄糖氧化酶酶膜及其制备方法
【专利摘要】一种碳量子点修饰的葡萄糖氧化酶酶膜及其制备方法，属于电化学生物传感器及其制备技术领域。碳量子点修饰的葡萄糖氧化酶酶膜以硝酸纤维素膜为基质膜，含有催化剂葡萄糖氧化酶和纳米材料碳量子点，以及防腐剂苯甲酸、抗菌剂庆大霉素、保护剂牛血清白蛋白、软化剂甘油、交联剂戊二醛等组分。制备方法：首先将苯甲酸、庆大霉素等添加剂按一定比例溶于葡萄糖氧化酶溶液中，然后将碳量子点、戊二醛与葡萄糖氧化酶溶液混合交联，再取混合液滴到硝酸纤维素基体上，干燥后即获得本发明酶膜。优点在于，有效提高了电子传递速率，降低了测试电压。用于溶液中葡萄糖检测，具有酶活性高、稳定性好、检测线性范围宽及灵敏度高。制备方法简便易行、成本较低。
【专利说明】
一种碳量子点修饰的葡萄糖氧化酶酶膜及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于电化学生物传感器及其制备技术领域，特别是涉及一种碳量子点修饰的葡萄糖氧化酶酶膜及其制备方法。
【背景技术】
[0002]电化学生物传感器因其分析准确、快速、选择性好、灵敏度高等优点，近几十年已经得到越来越多的关注。在电化学生物传感器中，葡萄糖传感器的研究占有很大的比例。但是，传感器存在酶易失活和泄露、储存和使用寿命较短等问题，制约了酶膜型葡萄糖生物传感器的实际应用。目前的解决方法主要是使用新颖的固定基体材料、添加纳米材料和提高酶固定技术及工艺优化等。
[0003]在专利(I)CNlOl140258中，杨文胜等人用戊二醛作为交联剂将葡萄糖氧化酶固定在硝酸基纤维素膜上，并与铂电极构成了葡萄糖生物传感器，研究结果表明葡萄糖氧化酶能够很好地固定在硝酸基纤维素膜上，所制得的传感器的线性响应范围为0.05?4.0mmol/L，响应时间小于80s，葡萄糖电化学生物传感器对β-D-葡萄糖的响应灵敏度为1.ΙμΑ.L/mmol。但该方法制备的葡萄糖生物传感器线性响应范围较窄，响应时间较长，另外其响应灵敏度也较低。
[0004]在文献(2)山东科学，2010，23(2):14-17中，毕元春等人制备了不同粒径、形貌和分散性的金纳米粒子，并分别对葡萄糖氧化酶膜进行修饰。研究结果表明:粒径小、分散性好的球状金纳米粒子可以极大地提高葡萄糖氧化酶酶膜的灵敏度，说明使用纳米材料不仅可以增加酶的吸附量和稳定性，还可以提高酶的催化活性，使酶电极的电流响应灵敏度得到显著提高。但采用金纳米材料，存在成本较高的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种碳量子点修饰的葡萄糖氧化酶酶膜及其制备方法。碳量子点具有较好生物相容性和较强的导电性，能够促进酶与电极间的电子传递，并可以降低过氧化氢的催化电位；以硝酸纤维素膜为基体膜，为葡萄糖氧化酶提供一个三维多孔结构基底，使得葡萄糖氧化酶更好地分散到这些孔状结构中，提高酶与待测物的接触面积。
[0006]本发明碳量子点修饰的葡萄糖氧化酶酶膜以硝酸纤维素膜为基质膜，含有催化剂葡萄糖氧化酶和纳米材料碳量子点，以及防腐剂苯甲酸、抗菌剂庆大霉素、保护剂牛血清白蛋白、软化剂甘油、交联剂戊二醛等组分；其中，硝酸纤维素膜厚度为50?150μπι，孔径为
0.20?1.Ομπι，葡萄糖氧化酶含量为3.6 X 12?5.5 X 13活力单位U/cm2，苯甲酸含量为4.3X 10—4?2.2 X 10—3g/cm2，庆大霉素含量为I.9 X 10—3?9.7 X 10—3g/cm2，牛血清白蛋白含量为2.3 X 10—4?I.2 X 10—3g/cm2，甘油含量为3.2 X 10—4?I.7 X 10—3g/cm2，戊二醛含量为6.7X 10—3?3.4 X 10—2g/cm2，碳量子点含量为2.2 X 10-5?I.2 X 10-4g/cm2。
[0007]本发明还提供上述以硝酸纤维素膜为基体的碳量子点修饰的葡萄糖氧化酶酶膜的制备方法:首先是将硝酸纤维素基体膜在在磷酸缓冲溶液PBS中进行浸泡处理，然后用高纯氮气将基体膜吹干，粘上O型橡胶圈后进行压实，再将含有甘油、苯甲酸、牛血清白蛋白、庆大霉素的葡萄糖氧化酶液与戊二醛溶液、碳量子点溶液进行混合交联，取定量混合交联液滴到已制备好的酶膜上，晾干后待用。具体工艺步骤为:
[0008](I)将硝酸纤维素膜浸泡在pH值为4.5?7.5的磷酸缓冲溶液PBS中5?1h，取出后用高纯氮气将硝酸纤维素膜吹干，然后用703有机硅胶将硝酸纤维素膜和O圈粘牢后放入冰箱中3?5h，压实，待用；
[0009](2)以pH值为4.5?7.5的磷酸缓冲溶液PBS为溶剂，配制葡萄糖氧化酶混合溶液，其中葡萄糖氧化酶的活度为6.92 X 16?4.33 X 107U/L，甘油浓度为0.092?0.46g/L，苯甲酸浓度为0.12?0.62g/L，牛血清白蛋白浓度为0.20?1.0g/L，庆大霉素浓度为1.5?7.6g/L;配制体积比为1:100?5:100的戊二醛溶液;配制固液比为1:100?1:1的碳量子点溶液；
[0010](3)按照体积比为3:1:4的比例将葡萄糖氧化酶混合溶液、戊二醛溶液及碳量子点溶液进行混合，混合交联10?30min，用移液枪取13?29yL混合液滴在步骤(I)制备的硝酸纤维素膜上，晾干后形成面积为0.70?0.75cm2的酶膜圆斑，放入4 °C冰箱中保存待用。
[0011]将上述葡萄糖氧化酶酶膜套在Pt电极顶端作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt丝作为对电极组装成三电极体系，可用于溶液中葡萄糖浓度的检测。将该三电极体系置于pH值为4.5?7.5的磷酸缓冲溶液中，用CHI660D电化学工作站进行电化学表征。采用计时电流i_t法测试传感器对β-D-葡萄糖的响应电流(如图1所示)，其响应时间为20s;由图2可以看出，该传感器对β-D-葡萄糖的线性响应范围为0.001?5.0mmol/L，大于文献⑴中传感器的线性响应范围，同时由线性拟合方程得出本发明传感器对β-D-葡萄糖的响应灵敏度为1.955μΑ.L/mmol;由图3可以计算出本发明葡萄糖氧化酶酶膜的米氏常数为2.44mmol/L，说明本发明的葡萄糖氧化酶酶膜对葡萄糖表现出良好的亲和性;对本发明的葡萄糖氧化酶膜进行连续124次测试(如图4所示)，其响应信号未见明显下降，124次的测试中响应信号大小波动在5.0 %以内；前30次测试中(如图5所示)，响应信号大小波动在3.8 %以内，这说明本发明以硝酸纤维素膜为基体的碳量子点修饰的葡萄糖氧化酶酶膜具有良好的操作稳定性;对本发明的葡萄糖氧化酶酶膜进行储存稳定性测试(如图6所示)，可以看出其储存稳定性良好。
[0012]本发明的特点及优势在于:采用硝酸纤维素膜作为基体膜，因其具有良好的生物相容性，能够较好地保持酶的活性，并且价位低廉;采用碳量子点修饰酶膜，有效提高了电子传递速率，降低了测试电压;在制备方法方面，本发明制备方法简便易行、工序较少、耗时较短、制备过程成本较低，易于推广应用;在性能方面，本发明葡萄糖氧化酶酶膜具有较低的测试电压、较宽的线性响应范围和较好的操作稳定性，适合在发酵工业生产中广泛使用。
【附图说明】
[0013]图1为本发明实施例1制备的葡萄糖氧化酶酶膜对β-D-葡萄糖的计时电流1-t响应曲线;其中，横坐标为时间t，单位:秒(s)，纵坐标为响应电流I，单位:微安(μΑ)。
[0014]图2为β-D-葡萄糖浓度与响应电流的关系曲线；其中，横坐标为β-D-葡萄糖的浓度，单位:毫摩尔/升(mmol/L)，纵坐标为响应电流I，单位:微安(μΑ)。
[0015]图3为β-D-葡萄糖浓度的倒数与响应电流的倒数的关系曲线;其中，横坐标为β-D-葡萄糖浓度的倒数，单位:升/毫摩尔(L/mmol)，纵坐标为响应电流I的倒数，单位:I/微安(1/μΑ)0
[0016]图4为本发明实施例1制备的葡萄糖氧化酶酶膜的操作稳定性测试图；其中，横坐标为测试次数，单位:次，纵坐标为相对响应值，单位:百分数(% )。
[0017]图5为本发明实施例1制备的葡萄糖氧化酶酶膜前30次的响应情况;其中，横坐标为测试次数，单位:次，纵坐标为相对响应值，单位:百分数(% )。
[0018]图6为本发明实施例1制备的葡萄糖氧化酶酶膜储存稳定性测试图；其中，横坐标为测试次数，单位:周，纵坐标为相对响应值，单位:百分数(% )。
【具体实施方式】
:
[0019]实施例1
[0020]将平均孔径为0.45μηι，厚度为10ym的硝酸纤维素膜浸入到pH值为5.5的磷酸缓冲溶液PBS中处理5h，取出，用高纯犯吹干，粘O形橡胶圈上，压实3h待用;配制葡萄糖氧化酶活度为1.73 X 107U/L的葡萄糖氧化酶混合溶液，甘油浓度为0.18g/L，苯甲酸浓度为0.25g/L，牛血清白蛋白浓度为0.4g/L，庆大霉素浓度为3.04g/L ；配制体积比3.0 %的戊二醛溶液，配制浓度为0.38g/L碳量子点水溶液;分别取葡萄糖氧化酶混合溶液6yL，戊二醛溶液2yL，碳量子点溶液SyL进行混合交联，滴涂到已压实的硝酸纤维素膜上，干燥后于4°C冰箱中保存。
[0021]将上述酶膜套在Pt电极顶端作为工作电极，Pt丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，测试底液PBS的pH为5.5，采用CHI660D电化学工作站对所构建的葡萄糖传感器进行电化学表征。采用i_t法测试传感器对β-D-葡萄糖的响应电流(如图1所示)，得出其响应时间为20s;本发明传感器对β-D-葡萄糖的响应线性范围为0.001?5.0mmol/L(如图2所示)，且由线性拟合方程得出其响应灵敏度为1.955μΑ.L/mmol;计算出其米氏常数为2.44mmol/L(如图3所示)；本发明所制酶膜连续使用124次其响应信号未见明显下降(如图4所示)，124次的测试中响应信号大小波动在5%以内；前30次测试中响应信号大小波动在3.8%以内(如图5所示)，该葡萄糖氧化酶膜储存稳定性(如图6所示)良好，在第9周时达到初始测试值的80%。
[0022]实施例2
[0023]将平均孔径为0.20μηι，厚度为80μηι的硝酸纤维素膜浸入到pH值为7.0的磷酸缓冲溶液中处理7h，取出，用高纯％吹干，粘O形橡胶圈上，压实4h待用；配制葡萄糖氧化酶活度为1.73 X 107U/L的葡萄糖氧化酶混合溶液，甘油浓度为0.18g/L，苯甲酸浓度为0.5g/L，牛血清白蛋白浓度为0.4g/L，庆大霉素浓度为6.08g/L ；配制体积比3.0%的戊二醛溶液，配制浓度为0.38g/L碳量子点水溶液;分别取葡萄糖氧化酶混合溶液6yL，戊二醛溶液2yL，碳量子点溶液SyL进行混合交联，滴涂到已压实的硝酸纤维素膜上，干燥后于4°C冰箱中保存。
[0024]将上述酶膜套在Pt电极顶端作为工作电极，Pt丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，测试底液PBS的pH为5.5，采用CHI660D电化学工作站对所构建的葡萄糖传感器进行电化学表征。采用i_t法测试传感器对β-D-葡萄糖的响应电流，其响应时间小于50s;本发明传感器对β-D-葡萄糖响应的线性范围为0.05?5.0mmo I /L，由线性拟合方程得出其响应灵敏度为1.822μΑ.L/mmol;计算出其米氏常数为21.71mmol/L;该葡萄糖氧化酶膜稳定性良好，在第8周时达到初始测试值的80%。
[0025]实施例3
[0026]将平均孔径为1.Ομπι，厚度为ΙΟΟμπι的硝酸纤维素膜浸入到pH值为5.5的磷酸缓冲溶液中处理5h，取出，用高纯％吹干，粘O形橡胶圈上，压实3h待用；配制葡萄糖氧化酶活度为6.92 X 106U/L的葡萄糖氧化酶混合溶液，甘油浓度为0.46g/L，苯甲酸浓度为0.62g/L，牛血清白蛋白浓度为I.0g/L，庆大霉素浓度为7.6g/L ；配制体积比2.0 %的戊二醛溶液，配制浓度为0.38g/L碳量子点水溶液;分别取葡萄糖氧化酶混合溶液6yL，戊二醛溶液2yL，碳量子点溶液SyL进行混合交联，滴涂到已压实的硝酸纤维素膜上，干燥后于4°C冰箱中保存。
[0027]将上述酶膜套在Pt电极顶端作为工作电极，Pt丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，测试底液PBS的pH为6.5，采用CHI660D电化学工作站对所构建的葡萄糖传感器进行电化学表征。采用i_t法测试传感器对β-D-葡萄糖的响应电流，其响应时间小于30s;本发明传感器对β-D-葡萄糖响应的线性范围为0.001?4.0mmol/L，由线性拟合方程得出其响应灵敏度为1.857μΑ.L/mmol ；计算出其米氏常数为2.94mmol/L;该葡萄糖氧化酶膜稳定性良好，在第9周时达到初始测试值的80%。
[0028]实施例4
[0029]将平均孔径为0.8μm，厚度为120μm的硝酸纤维素膜浸入到pH值为6.5的磷酸缓冲溶液中处理10h，取出，用高纯他吹干，粘O形橡胶圈上，压实4h待用；配制葡萄糖氧化酶活度为6.92 X 106U/L的葡萄糖氧化酶混合溶液，甘油浓度为0.18g/L，苯甲酸浓度为0.37g/L，牛血清白蛋白0.8g/L，庆大霉素3.04g/L ；配制体积比2.0%的戊二醛溶液，配制浓度为0.38g/L碳量子点水溶液;分别取葡萄糖氧化酶混合溶液6yL，戊二醛溶液2yL，碳量子点溶液8yL进行混合交联，滴涂到已压实的硝酸纤维素膜上，干燥后于4°C冰箱中保存。
[0030]将上述酶膜套在Pt电极顶端作为工作电极，Pt丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，测试底液PBS的pH为6.5，采用CHI660D电化学工作站对所构建的葡萄糖传感器进行电化学表征。采用i_t法测试传感器对β-D-葡萄糖的响应电流，其响应时间小于40s;本发明传感器对β-D-葡萄糖响应的线性范围为0.009?5.0mmol/L，由线性拟合方程得出其响应灵敏度为1.926μΑ.L/mmol;计算出其米氏常数为3.17mmol/L;该葡萄糖氧化酶膜稳定性良好，在第8周时达到初始测试值的80%。
[0031]实施例5
[0032]将平均孔径为0.8μηι，厚度为150μηι的硝酸纤维素膜浸入到pH值为7.0的磷酸缓冲溶液中处理6h，取出，用高纯％吹干，粘O形橡胶圈上，压实4h待用；配制葡萄糖氧化酶活度为4.33 X 107U/L的葡萄糖氧化酶混合溶液，甘油浓度为0.092g/L，苯甲酸浓度为0.37g/L，牛血清白蛋白浓度为0.8g/L，庆大霉素浓度为3.04g/L ；配制体积比2.0 %的戊二醛溶液，配制浓度为0.38g/L碳量子点水溶液;分别取葡萄糖氧化酶混合溶液6yL，戊二醛溶液2yL，碳量子点溶液SyL进行混合交联，滴涂到已压实的硝酸纤维素膜上，干燥后于4°C冰箱中保存。
[0033]将上述酶膜套在Pt电极顶端作为工作电极，Pt丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，测试底液PBS的pH为7.0，采用CHI660D电化学工作站对所构建的葡萄糖传感器进行电化学表征。采用i_t法测试传感器对β-D-葡萄糖的响应电流，其响应时间小于35s;本发明传感器对β-D-葡萄糖响应的线性范围为0.001?5.0mmoI/L，由线性拟合方程得出其响应灵敏度为1.896μΑ.L/mmol;计算出其米氏常数为2.69mmol/L;该葡萄糖氧化酶膜稳定性良好，在第9周时达到初始测试值的80%。
【主权项】
1.一种碳量子点修饰的葡萄糖氧化酶酶膜，其特征在于，该酶膜以硝酸纤维素膜为基质膜，含有催化剂葡萄糖氧化酶和纳米材料碳量子点，以及防腐剂苯甲酸、抗菌剂庆大霉素、保护剂牛血清白蛋白、软化剂甘油、交联剂戊二醛组分;其中，硝酸纤维素膜厚度为50?150μηι，孔径为0.20?I.Ομπι，葡萄糖氧化酶含量为3.6 X 12?5.5 X 13活力单位U/cm2，甘油含量为3.2 X 10—4?I.7 X 10—3g/cm2，苯甲酸含量为4.3 X 10—4?2.2 X 10—3g/cm2，牛血清白蛋白含量为2.3 X 10—4?I.2 X 10—3g/cm2，庆大霉素含量为I.9 X 10—3?9.7 X 10—3g/cm2，戊二醛含量为6.7 X 10—3?3.4 X 10—2g/cm2，碳量子点含量为2.2 X 10—5?I.2 X 10—4g/cm2。2.—种制备权利要求1所述碳量子点修饰的葡萄糖氧化酶酶膜的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将硝酸纤维素膜浸泡在pH值为4.5?7.5的磷酸缓冲溶液PBS中5?10小时，取出后用高纯氮气将硝酸纤维素膜吹干，然后用703有机硅胶将硝酸纤维素膜和O圈粘牢后放入冰箱中3?5小时，压实，待用； (2)以pH值为4.5?7.5的磷酸缓冲溶液PBS为溶剂，配制葡萄糖氧化酶混合溶液，其中葡萄糖氧化酶的活度为6.92 X 16?4.33 X 107U/L，甘油浓度为0.092?0.46g/L，苯甲酸浓度为0.12?0.62g/L，牛血清白蛋白浓度为0.20?1.0g/L，庆大霉素浓度为1.5?7.6g/L;配制体积比为I: 100?5:100的戊二醛溶液;配制固液比为1:100?1:1的碳量子点溶液； (3)按照体积比为3:1:4的比例将葡萄糖氧化酶混合溶液、戊二醛溶液及碳量子点溶液进行混合，混合交联10?30分钟，用移液枪取13?29yL混合液滴在步骤(I)制备的硝酸纤维素膜上，晾干后形成面积为0.70?0.75cm2的酶膜圆斑，放入4 °C冰箱中保存待用。
【文档编号】G01N27/327GK105928999SQ201610229037
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月13日
【发明人】杨文胜, 王明明, 刘长霞, 陈旭
【申请人】北京化工大学