特异性dna假结结构修饰的金电极及制备方法和应用
【专利摘要】本发明属于电化学传感器技术领域，具体涉及一种特异性DNA假结结构修饰的金电极及制备方法和应用。本发明所述特异性DNA假结结构修饰的金电极表面通过金?巯键的作用自组装修饰有末端带亚甲蓝氧化还原标签、茎环1含Nanog结合序列的DNA假结结构，该生物传感器利用功能化的DNA假结结构探针修饰的金电极与目标蛋白反应后，引起DNA假结结构构象改变，借助具有良好导电性的电信号分子MB，实现了对转录因子Nanog的灵敏检测，可以有效区分靶蛋白与其他对照蛋白。本方法操作简单，具有较高灵敏性和特异性，最小检测范围是170pM。
【专利说明】
特异性DN A假结结构修饰的金电极及制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于电化学传感器技术领域，具体涉及一种特异性DNA假结结构修饰的金 电极及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 细胞生物学的最有趣的问题之一是细胞多能性，细胞多能性受到严格的监管，调 节异常可能会导致先天性缺陷、无法损伤修复甚至是癌症。Nanog是多能性相关的重要转录 因子(transcription factors，TFs)之一，是一个近期引起大家极大兴趣的生物分子，它发 挥功能是通过调控细胞增殖、死亡，决定细胞命运。已知，Nanog在大部分正常成年组织中不 表达，但是高表达于胚胎干细胞和肿瘤细胞。研究已经揭示了 Nanog在肿瘤中对于肿瘤细胞 的干细胞样表型做出了贡献。升高的Nanog水平通常与肿瘤发生、细胞侵袭和转移有关。 Nanog的强烈高表达通常预示了癌症恶性程度高、抗药性以及不良结局。因此，检测Nanog对 于肿瘤评估、药物干预检测及临床预后具有重要意义。
[0003] 传统的T F检测方法有如下几种：浓度检测（例如：w e s t e r n b 1 〇 t s， immunohistochemistry or ELISA)，绑定活性检测（例如：electrophoresis mobility shift assay，ChIP)和转录水平检测(例如:qPCR)。这些方法各有优点，但是也存在着耗时 长、操作复杂，测定结果容易出现假阴性等弊端。近年来，电化学技术不断发展，在生命科学 领域发挥了十分重要的作用。电化学DNA(E-DNA)传感器具有操作简单、灵敏性高、成本低廉 等优势。目前，研究人员已发展了一些检测TF的E-DNA传感器，他们都具有相当的灵敏性和 特异性，给TF检测提供了潜在的替换方法。但是这些方法尽管具有这些优势，他们在实际应 用中仍然存在一些缺陷。例如，大部分报道的E-DNA体系是signal-off型，signal-off的体 系结构容易出现假阳性(例如探针降解)和相对小的检测范围。相反，signal-on型传感器则 能够降低背景信号，具有明显优势。因此，近期有研究投入到了开发signal-on的TF电化学 传感器。然而这些方法仍然存在DNA链设计复杂、结合效率低等不足。
【发明内容】
[0004] 本发明需要解决的问题是提供一种特异性DNA假结结构修饰的金电极及其制备方 法和对Nanog的定量检测。
[0005] 为了达到解决上述问题的目的，本发明采用如下机理:DNA假结结构包含两个茎环 结构（莖环1和2 )，莖环1形成了莖环2的一部分。DNA假结结构序列为：ttttgaccga ttatgtttag atcagttcat aatcggtctt tttttttttt ttctgatdDNA假结结构3'端修饰了亚 甲蓝氧化还原标签，5'端通过金-巯键修饰到电极表面（图1)。茎环1设计了Nanog结合序列。 因为DNA假结结构具有相对刚性的结构，减少了氧化还原探针和电极的接触，信号背景将最 小化。Nanog绑定后，由于Nanog分子相对较大，存在位阻效应，将打断茎环2,释放一个弹性 的单链信号链，从而加强了电子传递效率，增加感应电流。
[0006] 本发明的技术方案：
[0007] 本发明所述一种特异性DNA假结结构修饰的金电极的表面通过金-巯键的作用自 组装修饰有末端带亚甲蓝氧化还原标签、茎环1含Nanog结合序列的DNA假结结构，该DNA假 结结构序列为：ttttgaccga ttatgtttag atcagttcat aatcggtctt tttttttttt ttctgatct。
[0008] 本发明所述特异性DNA假结结构修饰的金电极的制备方法由以下步骤构成：（1)将 金电极(3.0mm直径)浸泡于水虎鱼溶液(H 2S〇4:30%H2〇2 = 3:1) 15分钟，以消除吸附的物质， 并用超纯水漂洗；（2)分别用lym和0.3wii的氧化铝打磨，并且依次在乙醇和超纯水中超声10 分钟，用氮气吹干；（3)取水虎鱼溶液滴加到金电极表面反应5分钟，用超纯水冲洗干净，吹 干；（4)将处理过的金电极置于0.5M H2S〇4中，在0~1.6V电压范围内进行伏安扫描，扫速为 100mV/S，直至达到稳定；（5)金电极用超纯水冲洗并吹干后，浸没在含DNA假结结构的电极 修饰溶液中，室温下孵育1.5h，再浸没在ImM巯基乙醇溶液中lh，用超纯水冲洗，吹干，即得 到DNA假结结构修饰的金电极。上述含DNA假结结构的电极修饰溶液为1 OmM Tris-HC1 pH 7.0的Tris-HCl中含有浓度为0.2yM的DNA假结结构、140mM NaCl，lmM MgCl2,5mM KC1和ImM TCEP〇
[0009]本发明所述特异性DNA假结结构修饰的金电极对转录因子Nanog的电化学检测方 法，采用本发明所述特异性DNA假结结构修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电 极，铂电极为对电极，具体步骤为：
[0010] (1)取Nanog加入到 10mM Tris-HCl，140mM NaCl，lmM MgCl2，and 5mM KC1，1.0% Tween 20，pH 7.0的缓冲液中形成一系列含Nanog浓度在0~45nM范围内的反应体系；将工 作电极插入到该反应体系中，在37°C反应lh;
[0011] (2)将经步骤（1)处理的工作电极放置于10mM Tris-HC1，PH 7.0缓冲液中，利用三 电极系统，以方波伏安法(SWV)检测，并在5~25nM范围内，得到电流与Nanog浓度的线性关 系曲线，其线性系数为0.99;
[0012] (3)利用步骤(2)所得标准曲线法对待测样进行分析检测，分析Nanog的含量。
[0013]本发明的有益效果如下：
[0014] (1)本发明所述特异性DNA假结结构检测转录因子的金电极，其制作成本低廉、工 艺简单、操作简易；
[0015] (2)本方法制备的电化学传感器能够成功检测转录因子Nanog，而且灵敏度、特异 性高，具有很好的重复性；
[0016] (3)由于Nanog本身可以作为一种的检测靶标，用于细胞多能性分析、肿瘤耐药性 及预后诊断，对疾病的临床检测提供技术支持，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0017]图1为本发明的方法原理图。
[0018]图2为不同浓度0~45nM Nanog存在情况下电化学信号的变化图。其中内嵌图为蛋 白浓度在5~25nM范围内与电化学信号变化值之间的线性关系图。
[0019] 图3修饰有DNA假结结构底物的金电极分别与空白、25nM血红蛋白、BSA、NF-kB、 Nanog反应lh的电化学信号。
【具体实施方式】
[0020]实施例一:利用特异性DNA假结结构修饰的金电极检测不同浓度Nanog。
[0021] 步骤一，将金电极(3.0mm直径)浸泡于水虎鱼溶液(H2S〇4: 30 % H2〇2 = 3:1) 15分钟， 以消除吸附的物质，并用超纯水漂洗。接着，分别用lMi and 0.3wii的氧化铝打磨，并且依次 在乙醇和超纯水中超声10分钟，用氮气吹干。然后取水虎鱼溶液滴加到金电极表面反应5分 钟，用超纯水冲洗干净，吹干。
[0022] 步骤二，将处理过的金电极置于0.5M H2S〇4中，在0~1.6V电压范围内进行伏安扫 描，扫速为l〇〇mV/S，直至达到稳定;金电极用超纯水冲洗并吹干后，浸没在含DNA假结结构 的电极修饰溶液中，室温下孵育1.5h，再浸没在ImM巯基乙醇溶液中lh，用超纯水冲洗，吹 干，即得到DNA假结结构修饰的金电极。
[0023]步骤三，取Nanog加入到 10mM Tris-HCl，140mM NaCl，lmM MgCl2，and 5mM KC1， 1.0%Tween 20，pH 7.0的缓冲液中形成一系列含Nanog浓度在0~45nM范围内（0nM、5nM、 10碰、15碰、20碰、25碰、4511]\〇的反应体系 ；将工作电极插入到该反应体系中，在37°(：反应 lh;将探针修饰的工作电极放置于10mM Tris-HCl，PH 7.0缓冲液中，利用三电极系统，以方 波伏安法(SWV)检测氧化还原电信号。
[0024]如图2所示，测得各溶液的峰电流随着Nanog浓度升高而升高，这是由于Nanog与 DNA假结结构结合位点结合后，由于Nanog分子相对较大，绑定之后存在位阻效应，将打开茎 环2，释放MB分子到电极表面，增强电信号。Nanog浓度在5-25nM与SWV峰值响应线性相关，最 小检测范围是170pM，说明本发明的检测方法具有较高的灵敏性。
[0025]实施例二:生物传感器特异性研究。
[0026] 为验证本发明检测Nanog的特异性，本发明用了不同的蛋白，如人血红蛋白，牛血 清白蛋白（BSA)和转录因子NF-kB，按照实施例一的操作过程处理来验证该生物传感器的特 异性。如图3所示，当没有Nanog或者用其他非特异蛋白替代时，则几乎没有峰值，只有当加 入Nanog时，检测到明显峰信号。实验证实，此方法具有很好的特异性，本生物传感器检测具 有高度选择性。
【主权项】
1. 一种特异性DNA假结结构修饰的金电极，其特征在于该电极的表面通过金-巯键的作 用自组装修饰有末端带亚甲蓝氧化还原标签、茎环1含Nanog结合序列的DNA假结结构，该 DNA假结结构序列为：ttttgaccga ttatgtttag atcagttcat aatcggtctt tttttttttt ttctgatct。2. 根据权利要求1所述一种特异性DNA假结结构修饰的金电极的制备方法，其特征在于 该方法的具体步骤为： (1) 将直径3. Omm的金电极浸泡于H2SO4: 30 %H2O2 = 3:1的水虎鱼溶液中15分钟，以消除 吸附的物质，并用超纯水漂洗； (2) 分别用Ιμπι和0.3μηι的氧化铝打磨，并且依次在乙醇和超纯水中超声10分钟，用氮气 吹干； (3) 取水虎鱼溶液滴加到金电极表面反应5分钟，用超纯水冲洗干净，吹干； (4) 将处理过的金电极置于0.5Μ H2SO4中，在0~1.6V电压范围内进行伏安扫描，扫速为 100mV/s，直至达到稳定； (5) 金电极用超纯水冲洗并吹干后，浸没在含DNA假结结构的电极修饰溶液中，室温下 孵育1.5h，再浸没在ImM巯基乙醇溶液中Ih，用超纯水冲洗，吹干，即得到DNA假结结构修饰 的金电极，上述含DNA假结结构的电极修饰溶液为IOmM Tris-HCl pH 7.0的Tris-HCl中含 有浓度为〇.2μΜ的DNA假结结构、140mM NaClJmM MgCl2,5mM KCl和ImM TCEP。3. -种特异性DNA假结结构修饰的金电极对转录因子Nanog的电化学检测方法，其特征 是采用权利要求1所述的特异性DNA假结结构修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参 比电极，铂电极为对电极，具体检测步骤为： (1) 取Nanog加入到IOmM Tris-HCl，140mM NaCl，lmM MgCl2,and 5mM KCl，1.0%Tween 20，pH 7.0的缓冲液中形成一系列含Nanog浓度在0~45nM范围内的反应体系，将工作电极 插入到该反应体系中，在37°C反应Ih; (2) 将经步骤（1)处理的工作电极放置于IOmM Tris-HCl，PH 7.0缓冲液中，利用三电极 系统，以方波伏安法检测，并在5~25nM范围内，得到电流与Nanog浓度的线性关系曲线，其 线性系数为0.99; (3) 利用步骤(2)所得标准曲线法对待测样进行分析检测，分析Nanog的含量。4. 权利要求1所述特异性DNA假结结构修饰的金电极在细胞多能性分析或肿瘤耐药性 检测中的应用。
【文档编号】G01N27/48GK105929001SQ201610243290
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月19日
【发明人】李根喜, 马洁桦, 李超, 陶雅沁
【申请人】南京大学