一种快速检测乳及乳制品中羟脯氨酸含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测乳及乳制品中羟脯氨酸含量的方法，采用微波酸水解法对样品进行前处理，然后采用离子色谱法对前处理样品进行色谱柱分析L?羟脯氨酸的含量。该方法样品处理简单快速，结果准确可靠，方法灵敏度较国标法高，稳定性好，可以准确地测定添加有动物水解蛋白的乳及乳制品中L?羟脯氨酸的含量，可对动物水解蛋白进行定性定量分析，为乳及乳制品掺假提供了可靠的检测方法。
【专利说明】
一种快速检测乳及乳制品中羟脯氨酸含量的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及分析化学的技术领域，具体涉及一种快速检测乳及乳制品中羟脯氨酸 含量方法。
【背景技术】
[0002] 国家卫生部于2009年2月公布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单（第二 批)》的通知中明确规定乳及乳制品、含乳饮料中禁止添加皮革水解蛋白。皮革水解蛋白的 主体蛋白类型为胶原蛋白，羟脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸，约占胶原蛋白氨基酸总 量的13.63%。乳蛋白质则不含羟脯氨酸，因此常将羟脯氨酸作为奶粉及乳饮料产品掺假与 否的证据。
[0003] 羟脯氨酸的测定方法很多，前处理过程中常见的水解蛋白质的方法有酶水解、酸 水解和碱水解。其中酶水解因成本高而很少使用，碱水解会使部分氨基酸发生旋光异构;酸 水解较彻底，且不引起消旋，是较为常用的方法，其中最常用的是l〇5°C烘箱酸水解法，但这 个方法耗时长，效率低下。除了前处理过程，羟脯氨酸的分析方法主要有比色法、氨基酸自 动分析仪测定法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等。其中比色 法因其操作简单、经济实用，是目前最为常用的一种方法，但由于缺乏相应的分离手段，容 易出现假阳性现象。另外，由于大部分氨基酸没有紫外吸收，因而液相色谱法、氨基酸分析 仪都需要先经过衍生才可被检测，整个操作复杂，检测时间久，并且容易污染环境。
【发明内容】
[0004] 本发明就是针对上述技术现状，提供一种快速测定乳及乳制品中羟脯氨酸含量的 方法。
[0005] 本发明采用的技术方案为：
[0006] -种快速检测乳及乳制品中羟脯氨酸含量的方法，所述方法包括以下步骤：
[0007] (1)采用微波酸水解法对乳及乳制品样品进行前处理:在聚四氟乙烯反应罐中加 入待测的乳及乳制品样品、浓度3mol/L的硫酸水溶液，所述硫酸水溶液的体积用量以样品 质量计为15mL/g，将反应罐密封后，置于微波消解仪中，设置微波消解仪于100°C反应lmin， 然后再升到120-180°C的水解温度反应5-45min，反应完毕后，取出反应罐，所得反应液用水 定容至50mL，摇匀，先过C18固相萃取柱除去杂质，所得流出液稀释100倍后，再用0.22wii水 系膜过滤，取滤液，待用；
[0008] (2)采用离子色谱法对步骤（1)制备的滤液进行检测分析，得到滤液的离子色谱 图，滤液的离子色谱图中检测到的L-羟脯氨酸的峰面积与L-羟脯氨酸的标准曲线比较，计 算得到滤液中L-羟脯氨酸的含量，相应换算得到乳及乳制品中L-羟脯氨酸的含量。
[0009] 乳与乳制品指的是所有与奶有关的样品，包括奶粉、液态奶、酸奶等等。更具体的 乳制品指的是使用牛乳或羊乳及其加工制品为主要原料，加入或不加入适量的维生素、矿 物质和其他辅料，使用法律法规及标准规定所要求的条件，加工制作的产品。乳制品包括液 体乳（巴氏杀菌乳、灭菌乳、调制乳、发酵乳等）；乳粉类(全脂乳粉、脱脂乳粉、部分脱脂乳 粉、调制乳粉、牛初乳粉等）;炼乳类;乳脂肪类(稀奶油、奶油等）；干酪类;乳冰淇淋类;其他 乳制品类(干酪素、乳清粉、乳糖、奶片等）。这都是本领域技术人员公知的食品分类名称。
[0010] 所述的步骤(1)中的水解温度为120-180°c，优选为150-160°c，更优选155°C。
[0011] 所述的步骤（1)中水解温度下的反应时间为5-45min，优选为25-35min，更优选 30min〇
[0012]所述步骤（1)中，所得反应液用水定容至50mL，一般可将反应液转移至50mL离心管 中，随后用水分3次洗涤反应罐，再用水定容至50mL。这是本领域公知的洗涤定容方法。 [0013]所述步骤（2)中，离子色谱法优选采用ICS-5000离子色谱仪，脉冲安培检测器检 测 。
[0014] 所述步骤（2)中，L-羟脯氨酸的标准曲线可按照常规方法制作，一般按照以下操 作:配制不同浓度的L-羟脯氨酸标准溶液，按照步骤(2)分析滤液同样的方法用离子色谱法 进行检测，得到L-羟脯氨酸标准溶液的离子色谱图，以L-羟脯氨酸标准溶液的离子色谱图 中L-羟脯氨酸的峰面积为纵坐标，L-羟脯氨酸标准溶液的浓度为横坐标，制作得到L-羟脯 氨酸的标准曲线。
[0015] 所述的步骤(2)中采用的色谱柱为Thermo AminoPac? PA10分析柱(2mmX250mm)， AminoPac? PA10保护柱（2_X 50mm) 〇
[0016]所述的步骤（2)中脉冲安培检测器中，工作电极采用金电极，参比电极采用pH电 极，氨基酸检测电位。
[0017]所述的步骤(2)中，离子色谱法中，色谱柱的流速为0.25mL/min;柱温为30°C;进样 体积为25uL。
[0018]所述的步骤(2)中，离子色谱法采用NaOH/NaOAc/HOAc梯度洗脱，淋洗液梯度程序 如下表1。
[0019]表1:淋洗液梯度程序
[0021] 注:一般出峰在7~9分钟，为了洗柱和平衡，必须进行后续得操作，这样才能进下 一针?
[0022] 与现有技术相比，该方法的优点如下：
[0023] (1)样品前处理的时间大大缩短，从传统法的16h缩短至lh以内。
[0024] (2)该方法样品处理简单快速，结果准确可靠，方法灵敏度较国标法高，稳定性好。
[0025] (3)该方法可以准确地测定添加有动物水解蛋白的乳及乳制品中L-羟脯氨酸的含 量，可对动物水解蛋白进行定性定量分析，为乳及乳制品掺假提供了可靠的检测方法。
【附图说明】
[0026] 图1比色法检测L-轻脯氨酸的标准曲线图。
[0027] 图2离子色谱法检测L-轻脯氨酸的标准曲线图。
[0028]图3外加标L-轻脯氨酸浓度为0.050yg/mL阴性样品的离子色谱图。
【具体实施方式】
[0029] 以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述，但本发明的保护范围不 限于此。
[0030] 实施例1
[0031 ] 1.1实施方案所使用的试剂、仪器与耗材如下：
[0032] Thermo ICS-5000离子色谱仪(包括DP四元梯度栗和SP单栗，DC控制单元，EG淋洗 液发生器，45自动进样器）、〇11'〇111616〇116.8色谱工作站、￡]^4(^1^86纯水系统（美国密 理博公司）、Milli-Q Direct超纯水系统(美国密理博公司）、DGG-9053AD电热恒温鼓风干燥 箱(上海森信实验仪器有限公司）、HH-2数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）、723PCS可见 分光光度计(上海欣茂仪器有限公司）、TOPEX全能型微波化学工作平台（上海屹尧仪器科技 发展有限公司）、Vortex-Genie 2漩涡混合器(美国思博明科学器材公司）、SK8210HP超声波 清洗器(上海科导超声仪器有限公司）、SARTORIOUS QUINTIX213-1CN电子天平(赛多利斯科 学仪器(北京）有限公司）、Mettler Toledo XS205DualRange分析天平(梅特勒一托利多仪 器（上海）有限公司）、Eppendorf Research移液枪（20~200yL，500~1000yL，5000yL)(德国 艾本德股份公司hBond Elut C18柱（Agilent)、WondaDisc水系针头滤器MCE 0.22譲 (311；[11^(1211-61^)。他011(色谱纯，？1111^)、乙酸钠（色谱纯，1'1161'1110)、1^-轻脯氨酸（优级纯， Sigma)、氢氧化钠，冰乙酸，硫酸，4-(二甲氨基)苯甲醛，明胶，氯胺-T，正丙醇，异丙醇，三氯 乙酸，一水柠檬酸，无水乙酸钠(分析纯，沪试）。
[0033] 2实验方法
[0034] 2.1样品预处理
[0035] 2.1.1对比方法:传统烘箱酸水解法
[0036] 在50mL塑料离心管中加入0.4g奶粉样品、500此明胶溶液（15g/L)、6mL硫酸溶液 (3mol/L)，盖紧管盖，随后在漩涡混合器中混合均匀。在105°C烘箱中放置16h，反应完毕，取 出离心管，趁热加水至40mL，待冷却后用水定容至50mL，为传统烘箱酸水解液，在漩涡混合 器中混合lmin，经中速滤纸过滤，取滤液，稀释10倍，待用。
[0037]注:本实施例中采用的奶粉样品为阴性样品，是不掺杂明胶的，为了验证本发明的 可靠性和准确性，额外在样品中加入明胶进行实验。
[0038] 2.1.2实施方案方法:微波酸水解法
[0039] 在聚四氟乙烯反应罐中加入0.4g奶粉样品、500此明胶溶液（15g/L)、6mL硫酸溶液 (3mol/L)，盖紧罐顶，置于微波消解器中，设置温度梯度为100°Clmin、水解温度155°C 30min。反应完毕，取出反应罐，将反应液转移至50mL离心管中，随后用30mL水分3次洗涤反 应罐，待冷却后用水定容至50mL，为微波酸水解液，摇匀，先过C18固相萃取柱除去杂质，然 后稀释100倍，再用0.22ym水系膜过滤，取滤液，待用。
[0040] 2.2检测方法：
[0041 ] 2.2.1对比方法：比色法
[0042] 1试剂准备
[0043] (1)缓冲溶液:用500mL水溶解26.0g-水梓檬酸、14.0g氢氧化钠、78.0g无水乙酸 钠并转入1L的容量瓶，加入250mL正丙醇，用水定容至刻度。
[0044] (2)氯胺T溶液:用100mL上述配制的缓冲溶液溶解1.41g氯胺T，临用时现配。
[0045] (3)显色剂:称取10.0g对二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸水溶液[60% (m/m)]溶液 溶解，然后缓慢加入65mL异丙醇。临用时现配。
[0046] 2反应与比色
[0047] 分别移取步骤2.1.1和步骤2.1.2采用两种方法得到的滤液4.00mL于25mL比色管 中，加入2.00mL氯胺T溶液，混合后在室温下放置20min。随后加入2.00mL显色剂于比色管 中，混合后迅速放入60°C水浴中，加热20min。在558nm处用分光光度计测定吸光度。
[0048] 2.2.2实施方案方法:离子色谱法
[0049]步骤2.1.1和步骤2.1.2采用两种方法得到的滤液分别用离子色谱法进样分析，色 谱条件如下：色谱柱：1'1161'1]1〇八111；[110?&01￥?八10分析柱（2111111\250111111)，八111；[110?&0 1￥?八10保护 柱（2mmX50mm);检测器:脉冲安培检测器，金工作电极，pH参比电极，氨基酸检测电位;流 速:0.25mL/min;柱温：30 °C ;进样体积：25此。
[0050]淋洗液梯度程序见下表2。
[00511表2:淋洗液梯度程序
[0054] 3实验结果：
[0055]明胶中的羟脯氨酸含量与水解液中的羟脯氨酸含量不等，查阅文献发现明胶中的 羟脯氨酸含量(m/m)-般为11-13%。
[0056] 水解液中的羟脯氨酸含量，w 〇g/mL) = c X n
[0057] 明胶中的羟脯氨酸含量，
[0058] c为测定的羟脯氨酸的浓度(yg/mL);
[0059 ] n为稀释倍数，其中比色法为10，离子色谱法为100;
[0060] m为明胶质量(g)。
[0061 ]水解液中L-轻脯氨酸含量根据标准曲线计算。
[0062] 分别配制L-轻脯氨酸含量为0.500、1.000、1.500、2.000yg/mL的系列标准溶液，按 比色法的测定方法进行测定，以吸光度(y，Abs)对浓度(X，iig/mL)进行线性回归，计算得y = 0.21833x，r = 1.000，比色法的标准曲线如图1所示。
[0063] 分别配制L-轻脯氨酸含量为0.050、0.100、0.150、0.200yg/mL的系列标准溶液，按 离子色谱法的测定方法进行测定，以L-轻脯氨酸的峰面积值(y，nC ? min)对浓度(x，yg/mL) 进行线性回归，计算得y = 18.42707x，r = 0.999，离子色谱法的标准曲线图如图2所示。 [0064]根据标准曲线计算，步骤2.1.2奶粉样品采用微波水解法进行处理，155°C水解温 度下，离子色谱法检测，水解液中的羟脯氨酸含量为1.695yg/mL，折合L-羟脯氨酸在明胶中 的含量为11.30 %。
[0065] 实施例2:
[0066]用步骤2.1.2的微波水解法作为样品前处理方法，但改变水解温度分别为120°C、 140°C、145°C、150°C，分别采用步骤2.2.1比色法和2.2.2离子色谱法检测水解液中L-羟脯 氨酸含量的含量，结果如表3。
[0069] 结果表明，
[0070] a.水解温度在120~150 °C间时，样品因水解不彻底，导致计算结果偏低。
[0071] b.其中120°C水解组中，两种测定方法的数值相差较大，是因为对于比色法而言， 该浓度已小于其定量限，测定数值不准确;而对于离子色谱法法，该浓度大于其定量限，测 定数值可靠。
[0072] c.除120°C水解组，其余温度水解组中，2种测定方法计算数值较为接近，说明2种 测定方法结果一致，没有误差。
[0073] 实施例3
[0074] 按实施例1步骤2.1.1传统酸水解法和2.1.2微波酸水解法对奶粉样品进行前处 理，所不同的是，将加入的500此的15g/L明胶溶液分别替换为250、500、lOOOyg的L-羟脯氨 酸，，然后将所得水解液均用实施例1步骤2.2.1的比色法进行检测，并作6次平行，计算羟脯 氨酸的回收率和精密度，结果如表4所示。
[0075] 表 4
[0078]回收率计算公式如下（阴性样品中不含羟脯氨酸）：
[0080] cl为测定的水解液中羟脯氨酸的浓度(iig/mL);
[0081 ] n为稀释倍数，其中比色法为10，离子色谱法为100;
[0082] ml为加入的羟脯氨酸质量(mg)。
[0083] 实施例4
[0084]将实施例1步骤2.1.2的微波酸水解法加入的500yL的15g/L明胶溶液分别替换为 500yL的0.050、0.100、0.200yg/mL的L-轻脯氨酸系列标准溶液，然后按微波酸水解-离子色 谱法分别测定其回收率，并作6次平行。结果表明3者平均回收率分别为92.93、102.47和 94.48%，RSD分别为3.57、4.88、1.18 %，说明仪器、加标阴性样品较稳定，加标回收率较好。 当加标浓度为〇.〇25iig/mL时，但由于相邻峰的干扰，导致目标峰峰形不佳，因而确定其定量 限(L0Q)为0.050yg/mL，得峰面积为0.885nC ? min(离子色谱图见图3)。根据内标法，在阴性 样品的基础上逐级加入不同浓度的L-羟脯氨酸标准品，直至与相邻峰无法分开，确定检出 限（L0D)为0.015yg/mL。
[0085] 实施例5
[0086] 取正规渠道购买的不同乳制品样品，分别为奶粉、酸奶、炼乳、干酪，前处理方法如 下：
[0087] 在聚四氟乙烯反应罐中加入0.4g样品、6mL硫酸溶液(3mol/L)，盖紧罐顶，置于微 波消解器中，设置温度梯度为100°C lmin、水解温度155°C30min。反应完毕，取出反应罐，将 水解液转移至50mL离心管中，随后用30mL水分3次洗涤反应罐，待冷却后用水定容至50mL， 为微波酸水解液，摇匀，先过C18固相萃取柱除去杂质，然后稀释100倍，再用0.22wii水系膜 过滤，取滤液，待用。
[0088] 检测方法按照实施例1的步骤2.2.2离子色谱法，检测得到上述四种样品的水解液 中L-羟脯氨酸的含量均为0，未检出L-羟脯氨酸，均为合格产品。
【主权项】
1. 一种快速检测乳及乳制品中羟脯氨酸含量的方法，其特征在于所述方法包括以下步 骤： (1) 采用微波酸水解法对乳及乳制品样品进行前处理:在聚四氟乙烯反应罐中加入待 测的乳及乳制品样品、浓度3mo 1 / L的硫酸水溶液，所述硫酸水溶液的体积用量以样品质量 计为15mL/g，将反应罐密封后，置于微波消解仪中，设置微波消解仪于100°C反应lmin，然后 再升到120-180 °C的水解温度反应5-45min，反应完毕后，取出反应罐，所得反应液用水定容 至50mL，摇匀，先过C18固相萃取柱除去杂质，所得流出液稀释100倍后，再用0.22μπι水系膜 过滤，取滤液，待用； (2) 采用离子色谱法对步骤（1)制备的滤液进行检测分析，得到滤液的离子色谱图，滤 液的离子色谱图中检测到的L-羟脯氨酸的峰面积与L-羟脯氨酸的标准曲线比较，计算得到 滤液中L-羟脯氨酸的含量，相应换算得到乳及乳制品中L-羟脯氨酸的含量。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，水解温度为150-160°C。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，水解温度为155 °C。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1)中，水解温度下的反应时间为25-35min〇5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，离子色谱法采用ICS-5000离 子色谱仪，脉冲安培检测器检测。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，L-羟脯氨酸的标准曲线按照 以下方法操作:配制不同浓度的L-羟脯氨酸标准溶液，按照步骤(2)分析滤液同样的方法用 离子色谱法进行检测，得到L-羟脯氨酸标准溶液的离子色谱图，以L-羟脯氨酸标准溶液的 离子色谱图中L-羟脯氨酸的峰面积为纵坐标，L-羟脯氨酸标准溶液的浓度为横坐标，制作 得到L-羟脯氨酸的标准曲线。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中，离子色谱法采用的色谱柱 为Dionex AminoPac? PA10分析柱：2mmX250mm，AminoPacTM PA10保护柱：2mmX50mm。8. 如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中，脉冲安培检测器中，工作电 极采用金电极，参比电极采用pH电极，氨基酸检测电位。9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中，离子色谱法中，色谱柱的流 速为0.25mL/min;柱温为30 °C ;进样体积为25yL。10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤（2)中，离子色谱法采用NaOH、醋 酸钠、醋酸梯度洗脱，梯度程序如下表：
【文档编号】G01N30/06GK105929044SQ201610236027
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】葛晓鸣, 葛超, 葛一超, 钟莺莺, 计红, 俞雪钧
【申请人】宁波出入境检验检疫局检验检疫技术中心