一种分析感病植株代谢组诊断植物灰霉病的方法
【专利摘要】一种分析感病植株代谢组诊断植物灰霉病的方法。本发明公开了一种基于感病植株代谢组的气相色谱?质谱联用分析(GC?MS)和偏最小二乘判别分析(PLS?DA)进行植物灰霉病诊断的方法。本发明提供的灰霉病诊断方法包括样品的收集、液氮灭活、低温保存、代谢组提取、干燥、硅烷化衍生、GC?MS检测和PLS?DA模型的建立和检测等步骤。采用本发明的提取及检测方法能得到重现性较好的病原侵染植物代谢组结果，建立的PLS?DA模型可实现未显症灰霉感病样本的准确识别，以及他种病原侵染和健康样本中灰葡萄孢侵染样本的准确识别。本发明灵敏准确，可为移栽苗及定植后植物灰霉病的早期诊断提供有效方法，有利于实现田间灰霉病的早期防治。
【专利说明】
一种分析感病植株代谢组诊断植物灰霉病的方法
技术领域
[0001 ]本发明提供了 一种分析感病植株代谢组诊断植物灰霉病的方法，涉及代谢组学、 植物学、微生物学和仪器分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 灰霉病是蔬菜花卉生产中的重要病害之一，它常造成果蔬采后和储运过程中大量 烂果，引发严重经济损失。其病原菌灰葡萄孢菌寄主范围广，能侵染包括茄科、萌芦科、蔷薇 科、豆科、葡萄科等200余种植物。灰霉病菌侵染草莓等植物后，通常会进入一段时间的潜育 期，叶片上症状不明显，并可随秧苗移栽而传播，这给田间病害诊断带来困扰，给田间生产 带来严重损失。
[0003] 近年来代谢组学研究技术为全面揭示植物代谢组及其受外界刺激产生的特异性 变化提供了有效手段，在病原与寄主互作研究中发挥重要的作用。植物中有超过20万种的 代谢物质，有的是维持植株生命活动和生长发育所必须的初级代谢物，有的是利用初级代 谢物生成的与植物抗逆关系密切的次级代谢物。代谢物是细胞调控过程的最终产物，其种 类和含量变化被视为生物系统对基因或环境变化的最终响应。已有研究采用HPLC-MS检测 到了感病黑麦草释放的甘露醇等挥发性代谢物，采用GC-MS研究发现马铃薯块茎受马铃薯 黑腔亚种(Erwinia carotovora subsp.atroseptica)侵染特异性地产生乙酸乙稀酯，受接 骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)侵染可产生二环庚二稀和苯乙稀。感灰霉病菌草莓的 挥发性气体成分分析发现，异缬草醛、顺-4-癸烯醛、2-甲基-1-丁醇、异丁醇、1-辛烯-3-酮 和1-辛烯-3-醇与灰霉病菌侵染草莓植株密切相关。
[0004]当植物受到病原菌侵染后，植物体内的代谢物质发生显著变化，细胞信号传导途 径最先发生变化，在病原菌侵染几个小时后即可发生水杨酸和乙烯等物质的积累，氮氧化 合物、甲基茉莉酸、甲基水杨酸等被认为是系统获得抗性的关键中介。植物体内与抗病相关 的初生代谢物包括糖类、有机酸、氨基酸和脂类含量继而发生变化，它们的变化使得植物细 胞壁和根茎叶等器官结构发生调整，从而阻止病原菌的入侵。同时，植物体内与抗病性密切 相关的萜类、多酚类、芥子油苷等次生代谢物亦发生调整，这些物质通常与毒素和信号传导 密切相关。
[0005]运用代谢组学手段监测植物在感病状态下的这种变化，对植物病害的早期诊断有 着十分重要的应用价值。在植物与微生物的互作研究中，通过感病和健康状态下植株代谢 组的检测，比较分析健康植物、感病植物两类生物材料代谢组的异同，可以全面揭示微生物 对植物代谢组的影响，为植物病害的早期诊断提供技术支持。目前，有关代谢组学技术在灰 霉病诊断中的应用尚未见报道，病原侵染植株的代谢组检测方法以及判别诊断方法均有待 于研究确定。本发明提供了一种分析感病植株代谢组诊断植物灰霉病的方法，可为秧苗灰 霉病检测和田间灰霉病早期诊断提供有效方法，有利于实现灰霉病的早期防治。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种分析感病植株代谢组诊断植物灰霉病的方法。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种植物样品的采集、灭活、保存，代谢组的 提取、干燥、衍生化及GC-MS检测的方法。
[0008] 所述生物样品可来源于叶、花、果、茎、根、果实等。
[0009] 所述收集方法为:酒精消毒剪刀后剪取植物组织2_15g(优选10g)，装在写好标记 的自封袋中；
[0010] 所述灭活处理为:将装有样品的自封袋迅速置于液氮中速冻3-5min(优选5min);
[0011] 所述保存方法为:将按上述方法接种、收集、灭活的植物样品置于超低温冰箱保存 (优选 _80°C)。
[0012] 本发明还同时提供了对通过上述方法获得的受病原菌侵染的植物样品进行代谢 组提取、干燥和衍生化的方法。
[0013] 所述提取方法包括以下步骤：
[0014] 1)冷冻研磨破碎:灭活后的植物样品在液氮条件下研磨，或采用球磨仪研磨破碎 处理，得样品粉末；
[0015] 2)代谢组提取:准确称取100.0 ± 0.5mg的植物样品粉末，准确加入1.8mL提取溶 剂，采用祸旋振荡l_3min(优选lmin)后，继续超声提取10-30min(优选15min);
[0016] 3)离心处理：将2)提取获得的代谢组溶液在4000-15000rpm(优选12000rpm)下进 行离心5-15min(优选15min)，弃沉淀，得代谢组提取液；
[0017]所述的干燥方法为抽真空离心干燥，特点是准确移取0.6mL上清液至0.6-2mL(优 选0.6mL)离心管中，30-45°C (优选45°C)抽真空离心干燥4-8h，直至质量恒定；
[0018]所述的衍生化方法包括肟化和三甲基硅烷化两步衍生化反应，步骤如下：
[0019] 1)吸取100此衍生化试剂1加入已离心干燥好的样品管中，封口，超声10-30min(优 选20min)，涡旋l-3min(优选lmin)溶解，稍微离心后30°C条件下肟化衍生化反应2h;
[0020] 2)吸取100yL的衍生化试剂2至样品管中，封口，超声10-30min(优选20min)，稍微 离心，37°C条件下硅烷化衍生反应4-10h(优选6h);
[0021] 3)衍生化获得的样品在转速10000-15000r/min(优选12000r/min)下离心15min， 吸取上清液至GC样品玻璃管中，获得用于GC-MS检测的代谢组样品。
[0022] 所述提取方法步骤2)所述提取溶剂为：甲醇与水混合溶液，甲醇与水混合体积比 为 9.5:0.5-5:5(优选 8:2);
[0023] 所述的衍生化方法步骤1)所述衍生化试剂1为：甲氧基胺盐酸盐溶解于吡啶获得 的溶液，浓度为10_40mg/mL(优选20mg/mL);
[0024]所述的衍生化方法步骤2)所述衍生化试剂2为:三甲基氯硅烷、N，0-双三甲硅基乙 酰胺、三甲基咪唑、N，0-双三甲硅基三氟乙酰胺、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺、六甲基二 硅胺烷、N-甲基-N-三甲硅基乙酰胺中的任意一种。
[0025]此外，本发明还同时提供了一种对上述前处理方法获得的健康植物和感病植物组 织代谢组进行检测的方法，其特征是：
[0026]选用HP-5MS毛细管柱（30m X 0.25mm X 0.25wn);进样体积lyL;流速lmL/min;程序 升温;离子源和传输线温度分别为230°C和280°C ;氦气为载气，恒压模式;质谱EI电离源电 子能量70eV，全扫描扫描范围20-650m/z，频率0.2s/scan;溶剂延迟时间5.5min。
[0027] 此外，本发明还同时提供了一种对上述方法获得的健康植株和感病植株代谢组数 据进行谢组定性定量数据的导出、判别分析模型的建立和检测，从而进行植物感灰霉病判 别的方法，其特征是：
[0028] 代谢组定性定量数据的导出方法为:采用GC-MS分析软件对检测结果进行代谢组 定性和定量数据的导出，在典型样品的总离子流色谱图（TIC)中，检索NIST谱库，获得色谱 峰的定性，根据硅烷化反应规律分析色谱峰的代谢物归属。对每个色谱峰选取1个目标离 子、2个参考离子，创建定量数据库，设置积分参数，从样品检测数据中导出各特征离子峰面 积，对代谢组成分进行相对定量；
[0029] 判别分析模型建立和检测为:模型建立采用 的PLS-DA工具，灰霉病感病样本与健康样本或感他种病害样本中，随机选取部分数据作为 培训集，将代谢组数据与分类变量进行PLS分析，建立分类变量与代谢组数据的PLS回归模 型。模型检测选取未参与建模的样本数据作为检测集未知样本，计算分类变量预测值，分析 感灰霉病样本检出的准确率。
[0030] 判别分析模型的建立为：
[0031] 1)随机选取2/3样本的代谢组数据作为培训集，建立培训集的分类变量，1代表灰 霉感病样本，〇代表非灰霉感病样本；
[0032] 2)分类变量与代谢组数据的PLS分析，建立分类变量与代谢组数据的PLS回归模 型，模型验证采用留一法交叉验证；
[0033]所述判别分析模型的检测为：
[0034] 1)选取未参与建模的1/3样本的代谢组数据作为检测集；
[0035] 2)根据培训集建立的分类变量与代谢组数据间的PLS模型，计算检测集未知样本 的分类变量的预测值(Y pre5d)，具体判别方法是：
[0036] 样本的Ypred>0.5且偏差小于0.5，则判定样本为灰霉感病样本；
[0037]样本的Ypred〈0.5且偏差小于0.5，则判定样本为非灰霉感病样本；
[0038]样本的偏差大于0.5,则判别不稳定。
[0039]本发明的优点是：
[0040] 1、GC-MS对代谢组检测灵敏、稳定、重现性好、分析通量大。样品处理步骤简单，操 作方便，处理速度快，适用于大规模样本的处理和检测。
[0041 ] 2、所建立的PLS-DA判别方法对未知样本判别准确率高，可实现对未显症灰霉感病 植株与健康植株的判别区分，并可从感染他种病害植株和健康植株中鉴别灰霉病株，方法 准确可靠，移栽苗灰霉病株检测及田间早期防治提供可靠方法。
【附图说明】
[0042]结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0043]图1灰葡萄孢侵染草莓植株与健康草莓植株代谢组PLS得分图
[0044]图2基于灰葡萄孢侵染植株和健康植株代谢组的PLS-DA校正模型样本分类变量的 PLS真实值与预测值回归图
[0045] 图3检测集中未知样本的PLS-DA模型判别结果(1)
[0046] 图4灰葡萄孢菌、草莓炭疽菌侵染植株与健康植株代谢组的PLS得分图
[0047]图5基于灰霉病菌侵染和草莓炭疽菌侵染植株及健康植株代谢组的PLS-DA校正模 型样本分类变量的PLS真实值与预测值回归图
[0048]图6检测集中未知样本的PLS-DA模型判别结果(2)
[0049] 图7未接菌对照组草莓叶片样品代谢组总离子流图
[0050] 图8接种灰葡萄孢菌草莓叶片样品代谢组总离子流图
【具体实施方式】
[0051 ]实施例1基于GC-MS分析草莓植株代谢组对未显症样品的灰霉病诊断分析 [0052] 一、基于GC-MS分析草莓植株代谢组样品的前处理
[0053] 1)灰葡萄孢菌的接种
[0054]接种前用清水洗去叶片表面的灰尘，用75%乙醇对叶片表面进行消毒处理。采用 无伤喷雾的接种方式，将25ml孢子悬浮液(浓度为105个/ml左右)均匀喷洒至草莓植株的地 上部位。接种后将花盆放入盛水托盘中，用塑料膜封口。将接种灰葡萄孢菌的草莓植株20°C 黑暗处理12h，之后放置于正常光照条件下培养。对照处理喷施清水，其他处理相同；
[0055] 2)收集方法为:分别在接种2d、5d、7d后，酒精消毒剪刀后剪取植物组织，装在写好 标记的自封袋中；
[0056] 3)灭活处理为:将装有叶片的自封袋置于液氮中速冻3-5min;
[0057] 4)保存方法为:将按上述方法接种、收集、灭活的植物叶片样品置于-80°C超低温 冰箱保存。
[0058] 5)称取100.0±0.5mg的植物样品粉末于离心管中，加入1.8mL上述提取溶剂，涡旋 振荡lmin后，继续超声提取20min。
[0059] 6)离心干燥:将提取获得的代谢组溶液在12000rpm下进行离心10min，
[0060] 准确移取0.6mL上清液至离心管中，45 °C抽真空离心干燥4h至质量恒定。
[0061] 7)衍生化
[0062] 包括N，0-双三甲硅基三氟乙酰胺和甲氧基胺盐酸盐两步衍生化反应：
[0063] 吸取100此衍生化试剂甲氧基胺盐酸盐溶液(溶解于吡啶中，浓度20mg/mL)加入已 离心干燥好的样品管中，封口，超声15min，涡旋lmin溶解，稍微离心后30°C衍生化反应2h; [0064]加入100yL的衍生化试剂N，0_双三甲硅基三氟乙酰胺至样品管中，封口，超声 20min，稍微离心，37°C衍生化反应6h进行下述步骤3);
[0065] 获得的衍生化样品在离心转速12000r/min下离心15min，吸取160yL至GC样品玻璃 管中，获得用于GC-MS检测的草莓植株代谢组样品。
[0066]二、基于GC-MS分析草莓植株样品代谢组样品的检测
[0067]进行GC-MS检测，仪器型号为：气相为7890A，质谱为5975C。具体采用的检测条件 为:HP-5MS毛细管柱（30m X 0.25mm X 0.25wn);进样体积lyL;流速lmL/min;离子源和传输线 温度分别为230°C和280°C;氦气为载气，恒压模式;质谱EI电离源70eV，全扫描扫描范围m/z 20-650，频率0 ? 2s/scan;溶剂延迟时间5 ? 5min。
[0068] 升温程序参数见表1:
[0069]表1色谱柱梯度升温程序参数
[0071]经检测，未接菌对照组草莓叶片样品代谢组总离子流图如图7所示。共检测到189 个峰，与NIST谱库比对，并去除重复物质后，发现草莓叶片代谢组匹配度大于80%的代谢物 有31个，其中有机酸类有12种、糖类有13种、其它类别有6种。
[0072]三、基于GC-MS分析草莓植株代谢组对未显症样品的灰霉病诊断判别分析 [0073] PLS-DA法是基于PLS法建立的样本分类变量与GC-MS数据间的回归模型。因此，首 先对培训集的样品进行赋值:三个采样时间获得的草莓灰霉感病样本赋值为1，健康样本赋 值为0。试验收集了36个样本，培训集与检测集的比例为2:1，使用24个样品做培训集，12个 做检测集。
[0074] 1 )PLS_DA判别模型的建立与验证
[0075]利用PLS法对校正集样本的GC-MS数据与样本的分类变量进行回归分析，建立草莓 灰霉病株判别分析PLS模型。如图1所示，模型能够清楚地将草莓灰霉感病组和健康组分 开，35%的X变量可以解释8%的Y变量，模型可靠性高，可以用于判别分析。
[0076]由图2可知通过PLS回归分析建立的草莓发病情况的判别模型较好。图中两条直线 分别为模型校正结果和验证结果的回归线，两条回归线基本重合。指示变量的校正值和模 型的验证值相关系数均大于0.946;校正直线通过原点，验证直线接近于原点；模型的校正 和验证结果的均方差根（RMSE)分别为0.0434、0.1210均接近于0，偏移（0打86〇分别为 0.0038、0.0499接近于0,斜率(Slop)分别为0.9925、0.8853接近于1。说明模型的拟合好。 [0077] 2)PLS_DA模型对检测集样本的判别
[0078]采用建立的模型对12个未知样品进行判别，图3和表2为检测集样本中草莓灰霉感 病组与健康组的预测结果。由表2可知所有样品的预测偏差均较低，接近于0.1。1~6号样本 的Ypred都大于0.5,接近于1，判别为草莓灰霉感病样本。7~12号样本的Ypred均小于0.5,接近 于〇,被判别为健康样本。所有12个样本均获得了正确的判别，表明PLS-DA模型能很好地将 得草莓灰霉感病样本和健康样本判别出来，样本的识别准确率达到了100%。
[0079]表2检测集中未知样品的PLS-DA模型的判别结果
[0081 ]实施例2基于GC-MS分析灰葡萄孢侵染草莓植株代谢组对灰霉病诊断分析 [0082] 一、基于GC-MS分析灰霉病菌与草莓炭疽病菌侵染草莓植株代谢组样品的前处理 [0083] 1)灰葡萄孢菌与草莓炭疽菌的接种
[0084]接种前用清水洗去叶片表面的灰尘，用75%乙醇对叶片表面进行消毒处理。采用 无伤喷雾的接种方式，将25ml孢子悬浮液(浓度为105个/ml左右)均匀喷洒至草莓植株的地 上部位。接种后将花盆放入盛水托盘中，用塑料膜封口。将接种灰霉菌的草莓植株20°C黑 暗处理12h，之后放置于正常光照条件下培养。将接种草莓炭疽菌的草莓植株26 °C黑暗处理 48h，之后放置于正常光照条件下培养。对照处理喷施清水，其他处理相同；
[0085] 2)收集方法为:对于接种灰葡萄孢菌的植株，分别于接种后2d、5d、7d按照实施例1 方法收集草莓植株感灰霉病样本;对于接种草莓炭疽病菌的植株，分别于接种后3d、7d、14d 按照实施例1方法收集草莓植株感炭疽病样本;分别于两种病菌接种相应时间收集未接菌 草莓植株样本作为健康植株样本。
[0086]样品的灭活处理、保存、提取、离心干燥、衍生化方法同实施例1。
[0087] 二、基于GC-MS分析灰霉病菌与草莓炭疽病菌侵染草莓植株代谢组样品的检测
[0088] 样品的检测方法同实施例1。经检测，接种灰葡萄孢菌草莓叶片样品代谢组总离子 流图如图8所示。共检测到189个峰，与NIST谱库比对，并去除重复物质后，发现草莓叶片代 谢组匹配度大于80%的代谢物有31个，其中有机酸类有12种、糖类有13种、其它类别有6种。 [0089]三、基于GC-MS分析草莓植株代谢组对灰霉病诊断判别分析
[0090]数据分析方法与实施例1中相同。
[0091]首先对培训集的样品进行赋值:三个时间采集的两株灰葡萄孢菌52、59接种的样 本赋值为1，未接菌样本与草莓炭疽菌孢子接种的样本则赋值为〇。我们收集了 89个样本，培 训集与检测集的比例为2:1，使用60个样本做培训集，29个样本用做检测集。
[0092] 1) PLS-DA判别模型的建立与验证
[0093] 如图4所示，模型能够清楚地将草莓灰霉感病植株与健康植株或草莓炭疽感病植 株区分开，48%的X变量可以解释3%的Y变量，模型可靠性高，可以用于从健康草莓植株或 草莓炭疽感病植株中判别草莓灰霉感病植株的分析。
[0094] 由图5可知通过PLS回归分析建立的草莓发病情况和指示变量的相关性较好。图中 两条直线分别为模型校正结果和验证的回归线，两条回归线基本重合。指示变量的校正值 和模型的验证值相关系数均大于0.962;校正直线通过原点，验证直线接近于原点；模型的 校正和验证结果的均方差根(RMSE)分别为0.0551、0.0975均接近于0,偏移(Offset)分别为 0.0051、0.0229接近于0,斜率(Slop)分别为0.9873、0.9396接近于1，说明模型的拟和较好。 [0095] 2)PLS-DA模型对检测集样本的判别
[0096]采用建立的模型对29个未知样品进行判别分析，图6和表3为检测集样本中草莓灰 霉感病组与健康组或草莓炭疽感病组的预测结果。由表2可知所有样本的预测偏差均较低， 接近于0.1。1~12号样本的Ypred都大于0.5，接近于1，判别为灰霉感病样本。13~29号样本 的Y pred均小于0.5,接近于0,被判别为健康组或草莓炭疽感病组样本。所有29个样本均获得 了正确的判别，表明PLS-DA模型能很好地将草莓灰霉感病样本从健康组或草莓炭疽感病组 样本中判别出来，样本的识别准确率达到了100%。
[0097]表3检测集中未知样品的PLS-DA模型的判别结果
【主权项】
1. 分析感病植株代谢组诊断植物灰霉病的方法，包括以下步骤并依次进行:植物样品 的采集、灭活、保存，代谢组的提取、干燥、衍生化及GC-MS检测； 所述植物样品的采集方法为:酒精消毒剪刀后剪取植物组织2-15g，装在写好标记的自 封袋中； 所述灭活方法为:将装有样品的自封袋迅速置于液氮中速冻3_5min; 所述保存方法为:将按上述方法接种、收集、灭活的植物样品置于超低温冰箱保存； 所述代谢组提取方法包括以下步骤： 1) 冷冻研磨破碎:灭活后的植物样品在液氮条件下研磨，或采用球磨仪研磨破碎处理， 得样品粉末； 2) 代谢组提取:称取100.0 ±0.5mg的植物样品粉末，准确加入1.8mL提取溶剂，采用涡 旋振荡l_3min后，继续超声提取10-30min; 3) 离心处理:将2)提取获得的代谢组溶液在4000-15000rpm下进行离心5-15min，弃去 沉淀，得代谢组提取液； 所述的干燥方法为:准确移取〇. 6mL上清液至0.6-2mL离心管中，30°C_45°C抽真空离心 干燥4-8h，直至质量恒定； 所述的衍生化方法包括肟化和三甲基硅烷化两步衍生化反应，步骤如下： 1) 吸取l〇〇yL衍生化试剂1加入已离心干燥好的样品管中，封口，超声10-30min，涡旋1-3min溶解，稍微离心后30°C条件下肟化衍生化反应2h; 2) 加入100yL的衍生化试剂2至样品管中，封口，超声10-30min，稍微离心，37°C条件下 硅烷化衍生反应4-1 Oh; 3) 衍生化获得的样品在转速10000-15000r/min下离心15min，吸取上清液至GC样品玻 璃管中，获得用于GC-MS检测的代谢组样品； 所述提取溶剂为：甲醇与水混合溶液，甲醇与水混合体积比为9.5:0.5-5:5; 所述衍生化试剂1为：甲氧基胺盐酸盐溶解于吡啶获得的溶液，浓度为10-40mg/mL; 所述的衍生化试剂2为:三甲基氯硅烷、N，0-双三甲硅基乙酰胺、三甲基咪唑、N，0-双三 甲硅基三氟乙酰胺、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺、六甲基二硅胺烷、N-甲基-N-三甲硅基 乙酰胺中的任意一种； 所述的GC-MS检测方法为：选用HP-5MS毛细管柱，程序升温，离子源和传输线温度分别 为230°C和280°C，采用EI电离源，全扫描范围m/z 20~650。2. 如权利要求1所述分析感病植株代谢组诊断植物灰霉病的方法，其特征在于:其中植 物样品的采集、灭活、保存方法的条件是： 所述植物样品的采集方法为:酒精消毒剪刀后剪取植物组织l〇g，装在写好标记的自封 袋中； 所述灭活方法为:将装有样品的自封袋迅速置于液氮中速冻5min; 所述保存方法为:将按上述方法接种、收集、灭活的植物样品置于_80°C冰箱保存。3. 如权利要求1所述分析感病植株代谢组诊断植物灰霉病的方法，其特征在于:其中代 谢组的提取、干燥和衍生化方法的条件是： 所述代谢组提取方法包括以下步骤： 1)冷冻研磨破碎:灭活后的植物样品在液氮条件下研磨，或采用球磨仪研磨破碎处理 lmin，得样品粉末； 2) 代谢组提取:称取100.0 ±0.5mg的植物样品粉末，准确加入1.8mL提取溶剂，采用涡 旋振荡lmin后，继续超声提取15min; 3) 离心处理:将2)提取获得的代谢组溶液在12000rpm下进行离心15min，弃去沉淀，得 代谢组提取液； 所述的干燥方法为：准确移取〇 . 6mL上清液至0.6mL离心管中，45 °C抽真空离心干燥4-8h，直至质量恒定； 所述的衍生化方法包括肟化和三甲基硅烷化两步衍生化反应，步骤如下： 1) 吸取1 OOyL衍生化试剂1加入已离心干燥好的样品管中，封口，超声20min，涡旋lmin 溶解，稍微离心后30°C条件下肟化衍生化反应2h; 2) 加入100yL的衍生化试剂2至样品管中，封口，超声20min，稍微离心，37°C条件下硅烷 化衍生反应4-1 Oh; 3) 衍生化获得的样品在转速12000r/min下离心15min，吸取上清液至GC样品玻璃管中， 获得用于GC-MS检测的代谢组样品。4. 如权利要求3所述的分析感病植株代谢组诊断植物灰霉病的方法，其特征在于:其中 代谢组的提取和衍生化所用的提取溶剂和衍生化反应所用的试剂组合是： 所述提取溶剂为：甲醇与水混合溶液，甲醇与水混合体积比为8:2; 所述衍生化试剂1为：甲氧基胺盐酸盐溶解于吡啶获得的溶液，浓度为20mg/mL; 所述的衍生化试剂2为:三甲基氯硅烷、N，0-双三甲硅基乙酰胺、三甲基咪唑、N，0-双三 甲硅基三氟乙酰胺、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺、六甲基二硅胺烷、N-甲基-N-三甲硅基 乙酰胺中的任意一种。5. 利用如权利要求1-4任一项所述方法获得的GC-MS检测结果进行的植物感灰霉病判 别分析方法，包括以下步骤并依次进行:代谢组定性定量数据的导出、判别分析模型的建立 和检测； 所述代谢组定性定量数据的导出方法为:采用GC-MS分析软件对检测结果进行代谢组 定性和定量数据的导出，在典型样品的总离子流色谱图（TIC)中，检索NIST谱库，获得色谱 峰的定性，根据硅烷化反应规律分析色谱峰的代谢物归属。对每个色谱峰选取1个目标离 子、2个参考离子，创建定量数据库，设置积分参数，从样品检测数据中导出各特征离子峰 面积，对代谢组成分进行相对定量； 所述判别分析模型建立和检测为：模型建立采用 件的PLS-DA工具，灰霉病感病样本与健康样本或感他种病害样本中，随机选取部分数据作 为培训集，将代谢组数据与分类变量进行PLS分析，建立分类变量与代谢组数据的PLS回归 模型。模型检测选取未参与建模的样本数据作为检测集未知样本，计算分类变量预测值，分 析感灰霉病样本检出的准确率。6. 如权利要求5所述的利用如权利要求1-4任一项所述方法获得的GC-MS检测结果进行 的植物感灰霉病判别分析方法，其特征在于:其中判别分析模型的建立和检测方法是： 所述判别分析模型的建立为： 1)随机选取2/3样本的代谢组数据作为培训集，建立培训集的分类变量，1代表灰霉感 病样本，〇代表非灰霉感病样本； 2)分类变量与代谢组数据的PLS分析，建立分类变量与代谢组数据的PLS回归模型，模 型验证采用留一法交叉验证； 所述判别分析模型的检测为： 1) 选取未参与建模的1/3样本的代谢组数据作为检测集； 2) 根据培训集建立的分类变量与代谢组数据间的PLS模型，计算检测集未知样本的分 类变量的预测值(Ypred)，具体判别方法是： 样本的Yprad>0.5且偏差小于0.5，则判定样本为灰霉感病样本； 样本的Yprad〈0.5且偏差小于0.5，则判定样本为非灰霉感病样本； 样本的偏差大于〇. 5，则判别不稳定。
【文档编号】G01N30/02GK105929068SQ201610260197
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】刘鹏飞, 常旭念, 代探, 胡志宏, 耿媛, 刘子淇, 宋维珮, 刘西莉
【申请人】中国农业大学