一种豆芽中非法添加药物的高效检测方法
【专利摘要】本发明公开一种豆芽中非法添加药物的高效检测方法，包括如下步骤：（1）标准溶液配制；（2）待测样处理；（3）在线固相萃取；（4）高效液相色谱?静电场轨道阱高分辨质谱测定。本发明采用高效、重复性好的在线固相萃取方法结合高效液相色谱串联静电场轨道阱高分辨质谱测定豆芽中的非法添加药物，可实现对样品中非法添加药物的定性和定量测定，检测结果灵敏可靠；且采用本方法，对样品的前处理过程快速简便，提高工作效率；本方法中，根据豆芽中非法添加药物的特性，选择适当的萃取溶剂、清洗剂和洗脱剂以及适当的质谱检测参数，提高检测精度和可靠度；本方法的自动化程度高，有效避免人为操作带来的误差。
【专利说明】
一种豆芽中非法添加药物的高效检测方法
技术领域
[0001]本发明属于检测技术领域，涉及豆芽中非法添加药物的检测方法，具体涉及一种 豆芽中非法添加药物的在线固相萃取-高效液相色谱串联静电场轨道阱高分辨质谱测定方 法。
【背景技术】
[0002 ]豆芽中的非法添加药物包括:4-氯苯氧乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、赤霉素、萘乙酸、 吲哚丁酸、6-苄基腺嘌呤、多菌灵和吲哚乙酸等。以上这些药物中，除了多菌灵属于农药外， 其他药物均属于植物生长调节剂。这是一类用于调节植物生长发育的药物，可促进植物生 长、提高农作物的质量和产量。
[0003] 4-氯苯氧乙酸是一种有机酸，又名防落素，防止落花、落果;其以4-氯苯氧乙酸钠 的形式用于豆芽生产中，主要是抑制豆芽生根和催熟生长。2,4_二氯苯氧乙酸主要用于诱 导细胞增殖，引起脱分化和未组织化的细胞生长，对豆芽生长具有很好的促进和调节作用。 赤霉素是广泛存在的一类植物激素，可刺激叶和芽的生长，在植物幼苗生长过程中提高发 芽率，用于豆芽生产可提高产量。吲哚乙酸和吲哚丁酸可促进插条生根，诱导细胞分裂和分 化，促进插条不定根的形成。萘乙酸是一种植物激素生长素，可促进细胞分裂与扩大，诱导 形成不定根。多菌灵为一种广谱性杀菌剂，能够杀死豆芽中的霉菌、细菌。6-苄基腺嘌呤是 细胞分裂素的一种，促进细胞分裂，诱导组织分化，用于豆芽生产中可促进芽的生长，抑制 根的生长，缩短生长周期。
[0004] 近年来研究发现，植物生长调节剂虽然低毒，但会在农作物中残留，通过食物链进 入人体。人体长时间吸收后会对其造成一定程度的伤害:轻则造成腹泻等疾病;重则造成人 体免疫力下降，骨骼疏松，甚至致畸、致癌、致突变等后果。
[0005] 目前测定豆芽中的非法添加药物的前处理多是有机溶剂提取，使用大量的有机溶 剂，操作繁琐同时对操作人员造成伤害;或是采用固相萃取，手动操作，耗费大量人力。仪器 方法多采用液相色谱法或高效液相色谱串联三重四级杆质谱法，考虑到非法添加的药物品 种较多，并且有可能是未知药物，因此采用高分辨质谱进行精确质量数筛查，不仅能检测已 知可能添加的药物，也可以筛查出未知的添加物，对于豆芽品质监控有一定的现实意义。
【发明内容】
[0006] 发明目的:本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种操作简便、精准度高的 豆芽中非法添加药物的在线固相萃取-高效液相色谱串联静电场轨道阱高分辨质谱测定方 法，该方法可同时实现样品的定性和定量检测且灵敏高、结果可靠。
[0007] 技术方案:本发明所述的豆芽中非法添加药物的高效检测方法，包括如下步骤：
[0008] (1)标准溶液配制：将非法添加药物标准品用甲醇配制成浓度为150~300mg/L的 标准溶液，2~6 °C保存;再用甲醇逐级稀释成浓度为0.8~1.2mg/L的标准溶液；
[0009] (2)待测样处理:豆芽样品预先切碎，搅匀，称取0.5~2g于50mL离心管，加入冰醋 酸-乙腈溶液，祸旋，置于超声仪中超声15~30min; 5000~lOOOOrpm离心2~5min，取上清 液，氮气吹干，然后用甲醇与水的混合溶液溶解并定容至l.OmL，过滤于进样小瓶；
[0010] (3)在线固相萃取:采用HLB萃取柱，用甲醇和水分别活化，流速为4~6mL/min;然 后上样，上样量为0.3~0.8ml，上样溶剂为水，体积0.3~1. OmL;清洗溶剂为水;洗脱溶剂为 甲醇；
[0011] (4)高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱测定：采用加热的电喷雾离子源 (HESI-n );毛细管温度为300~400°C，鞘气流速40~60L/min，辅助气流速4~8L/min，吹扫 气流速2~6L/min;喷雾电压为3KV，透镜电压为50V;采用正负离子切换模式同时采集数据； 进样前将色谱柱平衡15~30min，在柱温为25~35°C下重复进同一浓度的标准溶液，当峰面 积变化在±10%以内，保留时间在±5%以内，开始正式进样;进样系列标准溶液浓度为5~ 150ng/mL，以标准溶液峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工 作曲线对样品进行定量，样品溶液中药物的响应值在仪器测定的线性范围内。
[0012]本发明中，所述的非法添加药物包括4-氯苯氧乙酸、2,4_二氯苯氧乙酸、赤霉素、 萘乙酸、吲哚丁酸、6-苄基腺嘌呤、多菌灵和吲哚乙酸。
[0013] 优选地，步骤⑶中活化剂为lmL甲醇和lmL7K。
[0014] 优选地，步骤（3)中清洗溶剂为lmL的水，流速为5mL/min;洗脱溶剂为0.5mL的甲 醇，流速为〇. 15mL/min。
[0015] 优选地，步骤⑷中采用的色谱柱为Agilent Polaris C-18,长度为100mm，内径为 2 ? 1mm，填料粒径为5ym。
[0016]优选地，步骤(4)中采用梯度洗脱程序，流动相为醋酸铵与甲醇的混合液。
[0017]优选地，所述的梯度洗脱程序具体如下：时刻Omin:采用95wt %的醋酸铵和5wt % 的甲醇混合液做流动相，流速为〇. 3mL/min;时刻2min:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇 混合液做流动相，流速为0.3mL/min;时刻4min:采用5wt %的醋酸铵和95wt %的甲醇混合液 做流动相，流速为0.3mL/min;时刻9min:采用5wt %的醋酸铵和95wt %的甲醇混合液做流动 相，流速为〇. 3mL/min;时刻10min:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇混合液做流动相，流 速为0.3mL/min;时刻12min:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇混合液做流动相，流速为 0?3mL/min〇
[0018]优选地，步骤(4)中所述的鞘气、辅助气和吹扫气均为N2。
[0019]优选地，步骤(4)中采集数据的扫描范围为100-600m/z，一级全扫描的分辨率R = 70000〇
[0020] 有益效果：（1)本发明采用高效、重复性好的在线固相萃取方法结合高效液相色谱 串联静电场轨道阱高分辨质谱测定豆芽中的非法添加药物，可实现对样品中非法添加药物 的定性和定量测定，检测结果灵敏可靠;且采用本方法，对样品的前处理过程快速简便，提 高工作效率；（2)本方法中，根据豆芽中非法添加药物的特性，选择适当的萃取溶剂、清洗剂 和洗脱剂以及适当的质谱检测参数，提高检测精度和可靠度；（3)本方法的自动化程度高， 有效避免人为操作带来的误差。
【附图说明】
[0021] 图1为豆芽中各类非法添加物标准溶液色谱图；（其中：1.4-氯苯氧乙酸、2.2,4_二 氯苯氧乙酸、3.赤霉素、4.萘乙酸、5.吲哚丁酸、6.6-苄基腺嘌呤、7.多菌灵、8.吲哚乙酸）。
[0022] 图2为采用本方法检测含有非法添加药物的阴性豆芽样品得到的色谱图，（其中： 1.4-氯苯氧乙酸、2.2，4_二氯苯氧乙酸、3.赤霉素、4.萘乙酸、5. B引噪丁酸、6.6-苄基腺嘌 呤、7.多菌灵、8.吲哚乙酸）。
【具体实施方式】
[0023] 下面通过附图对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于 所述实施例。
[0024] 本发明所述的实例使用的质谱仪为Thermo Fisher公司的Q-Exactive型高效液相 色谱-静电场轨道讲高分辨质谱仪，数据处理系统为美国Thermo Fisher公司的Xcalibur数 据处理系统;试剂均为常规市售。
[0025] 实施例:一种豆芽中非法添加药物的检测方法，包括如下步骤：
[0026] (1)标准溶液配制:将非法添加药物标准品用甲醇配制成浓度为200mg/L的标准溶 液，4°C保存;再用甲醇逐级稀释成浓度为lmg/L的标准溶液；
[0027] (2)待测样处理:豆芽样品预先切碎，搅匀，称取lg于50mL离心管，加入0.1 %冰醋 酸-乙腈溶液，祸旋，置于超声仪中超声20min; 8000rpm离心3min，取上清液，氮气吹干，然后 用甲醇与水的混合溶液溶解并定容至lmL，其中甲醇与水的体积比为3:7;过滤于进样小瓶；
[0028] (3)在线固相萃取：采用HLB萃取柱，用lmL的甲醇和lmL水分别活化，流速为4~ 6mL/min;然后上样，上样量为0.5ml，上样溶剂为0.5ml的水，流速为0.5mL/min;清洗溶剂为 lmL的水，流速为5mL/min;洗脱溶剂为0.5mL的甲醇，流速为0.15mL/min;
[0029] (4)高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱测定：采用加热的电喷雾离子源 (HESI-n );毛细管温度为350°C，鞘气(N2)流速50L/min，辅助气（N2)流速6L/min，吹扫气 (N 2)流速3L/min;喷雾电压为3KV，透镜电压为50V;采用正离子模式采集数据，一级全扫描 的分辨率R = 70000,扫描范围：100-600m/z;采用的色谱柱为AgilentPolaris C-18,长度为 100mm，内径为2.1mm，填料粒径为5ym;进样前将色谱柱平衡15min，在柱温为30°C下重复进 同一浓度的标准溶液，当峰面积变化在±10%以内，保留时间在±5%以内，开始正式进样； 进样系列标准溶液浓度为5，10，20，50，100，150ng/mL，本过程中采用梯度洗脱程序，流动相 为醋酸铵与甲醇的混合液；梯度洗脱程序具体如下：时刻Omin :采用95wt %的醋酸铵和 5wt %的甲醇混合液做流动相，流速为0.3mL/min;时刻2min:采用95wt %的醋酸铵和5wt % 的甲醇混合液做流动相，流速为〇. 3mL/min;时刻4min:采用5wt%的醋酸铵和95wt%的甲醇 混合液做流动相，流速为0.3mL/min;时刻9min:采用5wt %的醋酸铵和95wt %的甲醇混合液 做流动相，流速为0.3mL/min;时刻lOmin:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇混合液做流 动相，流速为0.3mL/min;时刻12min:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇混合液做流动相， 流速为0.3mL/min以标准溶液峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用 标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中药物的响应值在仪器测定的线性范围内。
[0030] 其中，高效液相色谱梯度洗脱程序见表1;豆芽中非法添加药物的中英文名称及质 谱精确质量数见表2;
[0031]表1高效液相色谱梯度洗脱程序
[0033]表2非法添加药物的中英文名称及质谱精确质量数
[0035] 参考上表2数据和图1曲线，样品中是否存在某种药物，需满足如下条件:该样品出 现的色谱峰的保留时间与标准品保留时间相差不超过± 2.5 % ;样品与标准品的精确质量 数的偏差小于5*1(T6,则确定为样品中含有该药物，图2为采用本方法检测含有非法添加药 物的阴性豆芽样品得到的色谱图，由两图对比可知，对于含有各类非法添加药物的豆芽样 品，采用本方法的检测结果与标准品的出峰位置基本一致，证明，采用本发明方法对豆芽中 非法添加药物检测结果的准确性和可靠性。
[0036] 采用本发明方法对典型含有非法添加药物的豆芽阴性样品加标回收率范围见表 3；
[0037] 表3典型豆芽阴性样品加标回收率范围
[0039]由表3数据可证明，采用本发明方法，对典型豆芽阴性样品的加标回收率可控制在 一个较适宜且稳定的范围内，证明本方法用于豆芽中非法添加药物的可靠度高，适于推广 使用。
[0040]如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释 为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对 其在形式上和细节上作出各种变化。
【主权项】
1. 一种豆芽中非法添加药物的高效检测方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 标准溶液配制：将非法添加药物标准品用甲醇配制成浓度为150~300mg//L的标准 溶液，2~6°C保存;再用甲醇逐级稀释成浓度为0.8~1.2mg/L的标准溶液； (2) 待测样处理:豆芽样品预先切碎，搅匀，称取0.5~2g于50mL离心管，加入冰醋酸-乙 腈溶液，祸旋，置于超声仪中超声15~30min; 5000~1000 Orpm离心2~5min，取上清液，氮气 吹干，然后用甲醇与水的混合溶液溶解并定容至I.OmU过滤于进样小瓶； (3) 在线固相萃取:采用HLB萃取柱，用甲醇和水分别活化，流速为4~6mL/min;然后进 样，上样量为〇. 3~0.8ml，上样溶剂为水，体积0.3~1.0 mL，流速为0.4~0.6mL/min;清洗溶 剂为水;洗脱溶剂为甲醇； (4) 高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱测定：采用加热的电喷雾离子源(HESI-Π );毛细管温度为300~400 °C，鞘气流速40~60L/min，辅助气流速4~8L/min，吹扫气流速 2~6L/min;喷雾电压为3KV，透镜电压为50V;采用正负离子切换模式同时采集数据;进样前 将色谱柱平衡15~30min，在柱温为25~35°C下重复进同一浓度的标准溶液，当峰面积变化 在±10%以内，保留时间在±5%以内，开始正式进样;进样系列标准溶液浓度为5~150ng/ mL，以标准溶液峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线 对样品进行定量，样品溶液中药物的响应值在仪器测定的线性范围内。2. 根据权利要求1所述的豆芽中非法添加药物的高效检测方法，其特征在于:所述的非 法添加药物包括4-氯苯氧乙酸、2,4_二氯苯氧乙酸、赤霉素、萘乙酸、吲哚丁酸、6-苄基腺嘌 呤、多菌灵和吲哚乙酸。3. 根据权利要求1所述的豆芽中非法添加药物的高效检测方法，其特征在于:步骤(3) 中活化剂为ImL的甲醇和ImL水，流速为4~6mL/min。4. 根据权利要求1所述的豆芽中非法添加药物的高效检测方法，其特征在于:步骤(3) 中清洗溶剂为〇 . 5-1.5mL的水，流速为4-6mL/min;洗脱溶剂为0.3-0.7mL的甲醇，流速为 0·1-0·3mL/min〇5. 根据权利要求1所述的豆芽中非法添加药物的高效检测方法，其特征在于:步骤(4) 中采用的色谱柱为Agilent Polaris C-18,长度为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为5μηι。6. 根据权利要求1所述的豆芽中非法添加药物的高效检测方法，其特征在于:步骤(4) 中采用梯度洗脱程序，流动相为醋酸铵与甲醇的混合液。7. 根据权利要求6所述的豆芽中非法添加药物的高效检测方法，其特征在于:所述的梯 度洗脱程序具体如下：时刻Omin:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇混合液做流动相，流 速为0.3mL/min;时刻2min:采用95wt%的醋酸铵和5wt%的甲醇混合液做流动相，流速为 0.3mL/min;时刻4min:采用5wt %的醋酸铵和95wt %的甲醇混合液做流动相，流速为0.3mL/ min;时刻9min:采用5wt %的醋酸铵和95wt %的甲醇混合液做流动相，流速为0.3mL/min;时 刻IOmin:采用95wt %的醋酸铵和5wt %的甲醇混合液做流动相，流速为0.3mL/min;时刻 12min:采用95wt%的醋酸铵和5wt%的甲醇混合液做流动相，流速为0.3mL/min。8. 根据权利要求1所述的豆芽中非法添加药物的高效检测方法，其特征在于:步骤(4) 中所述的鞘气、辅助气和吹扫气均为N2。9. 根据权利要求1所述的豆芽中非法添加药物的高效检测方法，其特征在于:步骤(4) 中采集数据的扫描范围为100-600m/z，一级全扫描的分辨率R=70000。
【文档编号】G01N30/06GK105929091SQ201610510191
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】柳菡, 张睿, 赵增运, 沈伟健, 丁涛, 吴斌, 沈崇钰
【申请人】江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心