基于免疫荧光技术的检测和定位花粉致敏原蛋白的方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于免疫荧光技术的检测和定位花粉致敏原蛋白的方法。该方法以花粉过敏IgE阳性血清作为抗体，利用生物素标记的抗人IgE抗体可特异性地识别IgE，Alexa Flour 488标记的链霉亲和素能与生物素特异结合，通过抗原抗体的特异结合以及对信号的级联放大效应，能使花粉中微弱的致敏原信号被凸现出来，以利于用激光共聚焦显微镜（LSM710）对花粉致敏原蛋白的相关荧光信号进行检测和定位。便于在花粉颗粒上直观地观察其致敏原的分布、强弱情况。本发明为研究花粉中致敏蛋白的识别，定位提供了更为直观有效的方法。所获得数据可以为分析致敏蛋白的分布特征，了解其致敏特性，为防治人群花粉症的频发提供科学数据。
【专利说明】
基于免疫荧光技术的检测和定位花粉致敏原蛋白的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种基于免疫荧光技术，激光扫描共聚焦显微镜荧光检测技术，对花粉致敏原蛋白进行检测和定位的方法。
【背景技术】
[0002]现在，花粉污染和人群过敏现象日益凸显。现有的资料表明，过敏性疾病的发病率大约为20%，城市人群中花粉过敏患者比例呈增加趋势，并多见在中青年人群中。我国花粉过敏患者的平均发病率约为2%，在高发地区，人群中的花粉过敏及轻度鼻炎过敏的发病率可以尚达17.8%。花粉中含有丰富的蛋白质，其中的部分油质和多糖蛋白被人吸入后，会被鼻腔的分泌物消化，随后释放多种抗体。有花粉过敏史的人再吸入花粉时，会产生过敏反应。
[0003]鉴于潷草、悬铃木花粉在上海区域有着广泛的分布，在上海春秋季大气中亦有发现。同时也有研究表明，飞散的花粉在大气中容易成为各种污染物(大气细粒子、S0x、N0x等)的载体，由此使得花粉污染导致的疾病机理变得异常复杂；且对人体健康产生严重危害，关于花粉致敏现象的研究也引起了越来越多的关注。然而目前对对花粉致敏原的研究多为体外的蛋白与抗体的免疫法分析，常用动物的IgG抗体，结合WESTERNBL0T，ELISA，dotblot等方法，目前为止还没有关于花粉中致敏原蛋白的定位及检测相关报道。因此花粉致敏原蛋白的监测和在花粉中定位方法的建立，对于研究花粉过敏机制以及预防和减少花粉致敏病症具有重大的意义。
[0004]免疫焚光技术(Immunofluorescence Technique，IF)是根据抗原抗体特异反应原理，将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检测细胞或组织内的相应抗原(抗体)。使细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上带有荧光信号，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，可以检测荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。激光共聚焦扫描显微镜(Confocal)是以激光为照明光源，经过照明针孔对样品实现点照明，该点所发射的的荧光信号通过探测针孔被探测器检测，被照射点以外的发射光和非焦平面的发射光均被探测针孔阻挡，因此其可对标本的在焦平面实现点照明、点扫描，最终成像为点成像。通过振镜在X/Y方向的连续扫描，Confocal控制软件将扫描的像素点组成共聚焦图像，通过电动载物台沿Z轴方向的连续扫描，可以获得样品不同层面的光切图像。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种基于免疫荧光技术的检测和定位花粉致敏原蛋白的方法。
[0006]免疫荧光技术在测定细胞因子，细胞表面抗原、肿瘤标志物等研究领域有着广泛应用，但是目前花粉及花粉致敏的研究中还没有相关报道。本文选用了已经专业检测的阳性过敏病人的血清(含有IgE)为抗体，可以更为真实地模拟致敏反应过程，从而更为直观精确地识别结合花粉过敏原蛋白，原理参见图1。本文创新性地将免疫荧光技术及花粉过敏病人的血清(含有IgE抗体)相结合，利用抗原抗体的免疫作用，使得荧光信号特异性地标记花粉致敏原蛋白。通过抗原抗体的特异结合以及对信号的级联放大效应，能使花粉中微弱的致敏原信号被凸现出来，再利用激光共聚焦扫描显微镜进行荧信号光观察，进而直观地对花粉里中的花粉致敏原蛋白进行检测和定位。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案，实验流程如图2，具体为:
一种基于免疫荧光技术的检测和定位花粉致敏原蛋白的方法，其特征在于该方法的具体步骤为:
a.花粉粒预处理:将花粉用PBS缓冲液浸洗，混匀1min，离心，得到经预处理的花粉；
b.花粉致敏原蛋白与血清中的IgE抗体结合:将步骤a所得经预处理的花粉与过花粉过敏病人的血清按WwVViw=I g: (I?5)ml的质量体积比混匀，避光22-26°C下孵育30min;离心去除上清，再用PBS缓冲液清洗，得到结合IgE抗体的花粉，该结合IgE抗体的花粉用缓冲液清洗；
c.1 gE抗体(一抗)与生物素标记的抗I gE抗体(二抗)结合:将步骤b所得结合I gE抗体的花粉与生物素标记的抗人IgE抗体溶液混匀，生物素标记的抗IgE抗体的溶液浓度为2.4mg/L，结合IgE抗体的花粉与生物素标记的抗人IgE抗体溶液的质量体积比为Wi?/V二抗=1 g:(20?50 )ml，避光22-26 °C孵育I h，离心去除上清，得到结合有抗I gE抗体的花粉，该花粉用PBS缓冲液清洗；
d.生物素标记的抗IgE抗体(二抗)与AlexaFlour 488标记的链霉亲和素识别:用缓冲液稀释Alexa Flour 488标记链霉亲和素至工作浓度为0.5?2yg/ml，得到Alexa Flour488标记链霉亲和素工作液;后将步骤c所得花粉与该Alexa Flour 488标记链霉亲和素工作液按WwyVAF488工嫌=1 g: (10?50)ml的质量体积比混匀，避光22?26°C孵育Ih，用PBS缓冲液清洗;所述的缓冲液的组成为:0.005M磷酸钠，0.125M氯化钠，pH 7.6;
Alexa Flour 488荧光信号的分布观察:激光共聚焦扫描显微镜，在波长488nm的激发光下对步骤d所得花粉进行荧光信号检测。
[0007]本发明选取新鲜花粉为研究对象，利用已知过敏病人的阳性血清(含IgE抗体)为一抗，标记有生物素的抗人IgE抗体(二抗)特异结合一抗，之后用Alexa Flour 488标记的链霉亲和素特异性结合生物素，用激光扫描共聚焦显微镜(LSM710)观察荧光信号，从而对花粉致敏原蛋白进行检测和定位。
[0008]利用此方法，对上海市两种主要致敏花粉(悬铃木花粉及潷草花粉)进行了荧光观察，并对花粉致敏原进行花粉粒上的原位检测及统计，结果发现，悬铃木花粉的致敏原蛋白主要分布在花粉粒的胞质内，如图3所示;而潷草花粉的致敏原蛋白主要分布在花粉粒的外壁上，内部胞质有少量分布，如图4所示。
[0009]本方法的优点及创新之处如下:本文主要是创新性地利用免疫荧光技术的方法，使用花粉过敏病人阳性血清(含IgE)作为抗体，利用激光共聚焦扫描显微镜在花粉不同层面检测花粉中的荧光信号，可以直观高效地分析致敏蛋白的分布特征，了解其致敏特性，为防治人群花粉症的频发提供科学数据。同时，花粉的直径大多在20un-30um之间，其粒径大小符合筛选型流式细胞仪的样品要求，也可以利用流式细胞仪对花粉的荧光信号强弱等特征，得出对花粉致敏强度的分析。其次，在收集的大气中，也含有花粉成分，可以应用于大气污染物中花粉致敏原蛋白的检测和定位。总而言之，这种基于荧光免疫技术的检测和定位花粉致敏原蛋白的方法，既可以直观高效地检测到花粉中的花粉致敏原蛋白并可以进行精准定位，同时在致敏花粉的数据统计分析，大气污染物中花粉致敏原的鉴定及分析的研究中具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0010]图1为花粉致敏原蛋白检测和定位的原理图。
[0011]图2为花粉致敏蛋白检测和定位的技术路线图。
[0012]图3为悬铃木花粉粒中花粉致敏原蛋白的检测及定位图。A488nm下观察到的荧光信号图B荧光信号在悬铃木花粉中的分布图。
[0013]图4为潷草花粉粒汇总花粉致敏原蛋白的检测及定位图。A488nm下观察到的荧光信号图B荧光信号在潷草花粉中的分布图。
[0014]具体方法步骤I，花粉粒预处理:
取0.05g的花粉(潷草花粉，悬铃木花粉)置于500ul的离心管中，加入lOOulPBS缓冲液浸洗花粉，震荡摇匀lOmin。室温2000rpm离心2min，用移液枪尽量除尽离心管中的上清。
[0015]2，花粉致敏原蛋白与血清中的I gE抗体(一抗)结合: 向离心管中加入花粉过敏病人的血清80111，混匀室温(22-26°(:)孵育301^11，；室温
2000rpm离心2min，用移液枪尽量除尽离心管中的上清。后用I3BS缓冲液清洗离心管中的花粉5次，每次用300ulPBS，每次3min。
[0016]注:此步加用PBS缓冲液处理的花粉样品做空白对照。
[0017]3，I gE抗体(一抗)与生物素标记的抗I gE抗体(二抗)结合:
向离心管中加入ΙΟΟμΙ生物素标记的抗人IgE抗体溶液，混匀室温(22-26 °C)孵育Ih;室温2000rpm离心2min，用移液枪尽量除尽离心管中的上清。后用I3BS缓冲液清洗离心管中的花粉5次，每次用300ulPBS，每次3min。
[0018]4，生物素标记的抗IgE抗体(二抗)与Alexa Flour 488标记的链霉亲和素识别: 用缓冲液稀释Alexa Flour 488标记链霉亲和素至工作浓度0.5-2^^/^1，后向离心管中加入10ul的Alexa Flour 488标记链霉亲和素工作液，避光室温(22_26°C)孵育lh，用PBS缓冲液清洗离心管中的花粉；
5,Alexa Flour 488荧光信号的分布观察:
用激光共聚焦扫描显微镜(型号LSM710)，在波长488nm的激发光下对步骤4所得花粉进行荧光信号检测。
[0019]6，分析荧光信号分布，得出结论。(图3，图4)
在激光共聚焦扫描显微镜观察潷草和悬铃木后，我们发现悬铃木花粉上的绿色荧光信号主要集中在花粉内部的胞质部分，而潷草花粉上的荧光信号主要集中在花粉壁上。而空白对照的花粉仅有极微弱的荧光信号。
[0020]根据结果，我们得到悬铃木花粉的致敏原蛋白主要分布在花粉内部的胞质中，而潷草花粉的致敏原蛋白主要分布在花粉壁上，出现荧光信号的花粉表示其致敏性较强，而为出现信号的花粉则表示其致敏性较弱，或者不会引起致敏，荧光信号的强弱可以作为花粉致敏性强弱的参考。空白试验的结果验证了此方法的特异性识别，部分出现的微弱的荧光信号可能是植物体内的自发荧光。
【主权项】
1.一种基于免疫荧光技术的检测和定位花粉致敏原蛋白的方法，其特征在于该方法的具体步骤为: a.花粉粒预处理:将花粉用PBS缓冲液浸洗，混匀1min，离心，得到经预处理的花粉； b.花粉致敏原蛋白与血清中的IgE抗体结合:将步骤a所得经预处理的花粉与过花粉过敏病人的血清按WwVViw=I g: (I?5)ml的质量体积比混匀，避光22-26°C下孵育30min;离心去除上清，再用PBS缓冲液清洗，得到结合IgE抗体的花粉，该结合IgE抗体的花粉用缓冲液清洗； c.1gE抗体(一抗)与生物素标记的抗IgE抗体(二抗)结合:将步骤b所得结合IgE抗体的花粉与生物素标记的抗人IgE抗体溶液混匀，生物素标记的抗IgE抗体的溶液浓度为2.4mg/L，结合IgE抗体的花粉与生物素标记的抗人IgE抗体溶液的质量体积比为Wi?/V二抗=1 g:(20?50 )ml，避光22-26 °C孵育I h，离心去除上清，得到结合有抗I gE抗体的花粉，该花粉用PBS缓冲液清洗； d.生物素标记的抗IgE抗体(二抗)与AlexaFlour 488标记的链霉亲和素识别:用缓冲液稀释Alexa Flour 488标记链霉亲和素至工作浓度为0.5?2yg/ml，得到Alexa Flour488标记链霉亲和素工作液;后将步骤c所得花粉与该Alexa Flour 488标记链霉亲和素工作液按WwyVAF488工嫌=1 g: (10?50)ml的质量体积比混匀，避光22?26°C孵育Ih，用PBS缓冲液清洗;所述的缓冲液的组成为:0.005M磷酸钠，0.125M氯化钠，pH 7.6; e.AlexaFlour 488荧光信号的分布观察:激光共聚焦扫描显微镜，在波长488nm的激发光下对步骤d所得花粉进行荧光信号检测。
【文档编号】G01N33/68GK105929174SQ201610277279
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月1日
【发明人】王伟倩, 潘瑞琪, 孙贺伟, 夏群芳, 吕森林, 李水军, 张卫, 周树敏, 王青躍
【申请人】上海大学