一种卡非佐米中间体中杂质的检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种2?((S)?4?甲基?2?((S)?2?(2?吗啉代乙酰氨基)?4?苯基丁酰胺基)戊酰氨基)?3?(S)?苯基丙酸中杂质的检测方法，包括：采用高效液相色谱法对2?((S)?4?甲基?2?((S)?2?(2?吗啉代乙酰氨基)?4?苯基丁酰胺基)戊酰氨基)?3?(S)?苯基丙酸进行检测；所述高效液相色谱法中的流动相为磷酸盐缓冲液和乙腈。本发明采用磷酸盐缓冲液以及洗脱能力较强的乙腈作为流动相，能够较好的分离出2?((S)?4?甲基?2?((S)?2?(2?吗啉代乙酰氨基)?4?苯基丁酰胺基)戊酰氨基)?3?(S)?苯基丙酸中的杂质，检测的准确度较高。
【专利说明】
一种卡非佐米中间体中杂质的检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊 酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸技术领域，尤其涉及一种2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙 酰氨基) _4_苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-( S)-苯基丙酸杂质的检测方法。
【背景技术】
[0002] 美国食品药品管理局(FDA)批准的治疗多发性骨髓瘤的药物包括新型蛋白酶体抑 制药和新型免疫调节药。硼替佐米为第一个蛋白酶体抑制药，成功用于治疗血液系统恶性 肿瘤，但在初始应答患者中经常复发，并且治疗期间发生了细胞毒性(周围神经病变）。借鉴 硼替佐米应用和作用机制的研究，卡非佐米成功发展为新一代蛋白酶体抑制药，它选择性 且不可逆地与蛋白酶体上的靶点结合。蛋白酶体参与哺乳动物细胞的大多数蛋白质的水 解，与调节多重生理功能有关，是抗肿瘤药物的确定靶点。卡非佐米是微生物自然产物的结 构类似物，为四肽蛋白酶体结构抑制药，选择性不可逆结合到20S蛋白酶体的苏氨酸活性位 点的N-末端，蛋白水解的核心颗粒26S蛋白酶体。卡非佐米对蛋白酶体抑制作用不可逆，且 需要合成新的蛋白用于恢复细胞的蛋白酶体活性，因此，与其他缓慢的可逆性抑制药相比， 卡非佐米的蛋白酶体抑制作用更持久，对骨髓瘤患者具有一定疗效。
[0003] 2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3- (S)-苯基丙酸是合成卡非佐米的重要中间体，具有式I所示的结构：
[0004]
[0005] 药品在不同工艺条件下可能产生不同的杂质谱，药品中杂质的控制是药品研发的 重要方面，也是临床毒性研究的重要指标。2-((S)_4-甲基-2-((S)-2_(2-吗啉代乙酰氨 基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸在合成工艺中、生产过程运输过程中以 及在微弱的酸、碱、氧化性环境下均会产生杂质，2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰 氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中杂质种类的多少及杂质含量的多少 对卡非佐米的质量有重要影响，因此2-( (S)-4-甲基-2-( (S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯 基丁酰胺基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸中杂质的检测对卡非佐米的应用具有重要意义。
[0006] 目前，尚未发现有关于2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4_苯基丁 酰胺基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸中杂质检测的相关报道。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰 氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中杂质的检测方法，本发明提供的检 测方法能够对一种2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰 氨基)-3-(S)_苯基丙酸中的杂质进行有效的检测。
[0008] 本发明提供了一种2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰 胺基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸中杂质的检测方法，包括：
[0009] 采用高效液相色谱法对2-((S)-4_甲基-2-((S)-2_(2-吗啉代乙酰氨基)-4_苯基 丁酰胺基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸进行检测；
[0010]所述高效液相色谱法检测过程中的流动相为磷酸盐缓冲液和乙腈。
[0011] 优选的，所述磷酸盐缓冲液的质量浓度为35mmol/L~45mmol/L。
[0012] 优选的，所述磷酸盐缓冲液的PH值为2.5~3.5。
[0013] 优选的，所述高效液相色谱检测过程中的流动相流速为0.9mL/min~1.2mL/min。
[0014] 优选的，所述高效液相检测过程中采用梯度洗脱的方式使流动相通过色谱柱，所 述梯度洗脱的方法为：
[0015] 在0~27min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从80 %~90 %下降到45 %~ 60%，乙腈在流动相中的质量含量从10%~20%增加到40%~55% ;
[0016] 在27min~35min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从45 %~60 %下降到20 % ~30%，乙腈在流动相中的质量含量从40%~55%增加到70%~80% ;
[0017] 在35min~45min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量保持20%~30%，乙腈在 流动相中的质量含量保持70%~80%。
[0018] 优选的，所述高效液相色谱检测过程中的色谱柱填充剂为十八烷基键合硅胶。
[0019] 优选的，所述高效液相色谱检测过程中填充剂的粒度为3μπι~6μπι。
[0020] 优选的，所述高效液相色谱检测过程中的检测波长为200nm~230nm〇
[0021] 优选的，2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰 氨基)-3-(S)_苯基丙酸中杂质的检测方法具体为：
[0022] 采用高效液相色谱法对2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基 丁酰胺基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸进行检测；
[0023]所述高效液相色谱检测过程中的色谱柱为C18色谱柱；流动相为乙腈和pH为3的 40_〇1/1的磷酸盐缓冲液;流动相流速为1111171]1；[11;检测波长为210111]1 ;
[0024]所述液相色谱检测过程中流动相采用梯度洗脱的方式通过色谱柱，所述梯度洗脱 的方法为：
[0025] 在0~27min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从86%下降到55%，乙腈在流 动相中的质量含量从14%增加到45% ;在27min~35min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量 含量从55%下降到25%，乙腈在流动相中的质量含量从45%增加到75% ;在35min~45min， 磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量保持25%，乙腈在流动相中的质量含量保持75%。 [0026] 优选的，所述2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基） 戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸中的杂质包括式Kl~K4-SRS中的一种或几种： Si 、I 以 v. .，
v S i.*.I A Vk-/ V
[0029]本发明采用磷酸盐缓冲液作为流动相中的水相，能够避免液相色谱检测过程中基 线的飘逸以及出现波峰波谷样的波动，使小杂峰的灵敏度降低，而且2-((S)_4-甲基-2-((S)-2_(2-吗啉代乙酰氨基)-4_苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸以及其中的杂 质对磷酸盐缓冲液不敏感，不会增加检测过程中的干扰，并且通过配合使用洗脱能力较强 的乙腈作为有机相，使本发明提供的方法能够较好的分离出2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中的杂质，杂质的分离度 较好，检测的准确度较高。
[0030] 此外，本发明提供的2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰 胺基)戊酰氨基)-3-( S)-苯基丙酸中杂质的检测方法稳定性和重复性较好，检测方法稳定 可靠。
【附图说明】
[0031] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 提供的附图获得其他的附图。
[0032] 图1为本发明实施例1中制备2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸的工艺流程图；
[0033]图2为本发明实施例1制备得到的2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨 基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸的核磁图谱；
[0034]图3为本发明实施例2提供的方法检测2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰 氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸得到的液相色谱图；
[0035]图4为本发明实施例3提供的方法检测2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰 氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸得到的液相色谱图；
[0036]图5为本发明实施例4提供的方法检测2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰 氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸得到的液相色谱图；
[0037]图6为本发明比较例1提供的方法检测2-((S)_4-甲基-2-((S)-2_(2-吗啉代乙酰 氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸得到的液相色谱图。
【具体实施方式】
[0038]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0039] 本发明提供了一种2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰 胺基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸中杂质的检测方法，包括：
[0040] 采用高效液相色谱法对2-((S)-4_甲基-2-((S)-2_(2-吗啉代乙酰氨基)-4_苯基 丁酰胺基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸进行检测；
[0041] 所述高效液相色谱法检测过程中的流动相为磷酸盐缓冲液和乙腈。
[0042] 本发明采用高效液相色谱法对2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)- 4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸进行检测。在本发明中，所述2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸具有式I所 示的结构：
[0043]
[0044] 本发明对2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰 氨基)-3-(S)_苯基丙酸的来源没有特殊的限制，可由市场购买获得，也可采用本领域技术 人员熟知的方法制备得到。在本发明的实施例中，所述2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉 代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸的制备方法为：
[0045] 将具有式1所示结构的化合物和碱金属氢氧化物进行反应，得到2-((S)_4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸：
[0046]
[0047] 在本发明的实施例中，具有式1所述结构的化合物和碱金属氢氧化物反应的温度 为-HTC~40°C。在本发明的实施例中，具有式1所述结构的化合物和碱金属氢氧化物反应 的时间为2h~5h。在本发明的实施例中，所述碱金属氢氧化物可以为氢氧化锂。在本发明的 实施例中，所述式1所述结构的化合物和碱金属氢氧化物的质量比为1:(1.0~2.0)。本发明 对所述式1所示结构的化合物的来源没有特殊的限制，可按照本领域技术人员熟知的方法 制备得到。在本发明的实施例中，所述式1所示结构的化合物的制备方法为：
[0048] 将式2所示结构的化合物和式3所示结构的化合物在四氢呋喃的碘化钾溶液中进 行反应，得到式1所示结构的化合物：
[0049]
[0050]在本发明的实施例中，式2所示结构的化合物和式3所示结构的化合物反应的温度 为50°C~58°C。在本发明的实施例中，式2所示结构的化合物和式3所示结构的化合物反应 的时间为3h~5h。在本发明的实施例中，式2所示结构的化合物和式3所示结构的化合物的 质量比为1: (3~4)。本发明对所述式2所示结构的化合物和式3所示结构的化合物的来源没 有特殊的限制，可由市场购买获得。
[0051]在本发明中，所述高效液相色谱检测以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有 不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相栗入装有固定相的色谱柱， 在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
[0052]在本发明中，所述高效液相色谱检测过程中的流动相为磷酸盐缓冲液和乙腈。本 发明采用磷酸盐缓冲液作为流动相中的水相，能够避免液相色谱检测过程中基线的飘逸以 及出现波峰波谷样的波动，使小杂峰的灵敏度降低，而且2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗 啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸以及其中的杂质对磷酸盐缓 冲液不敏感，不会增加检测过程中的干扰，并且通过配合使用洗脱能力较强的乙腈作为有 机相，使本发明提供的方法能够较好的分离出2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨 基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中的杂质，检测的准确度较高。
[0053]在本发明的实施例中，所述磷酸盐缓冲液的质量浓度为35mmol/L~45mmol/L;在 其他的实施例中，所述磷酸盐缓冲液的质量浓度为38mmol/L~42mmol/L;在另外的实施例 中，所述磷酸盐缓冲液的质量浓度为40mmol/L。在本发明的实施例中，所述磷酸盐缓冲液 的pH值为2.5~3.5;在其他的实施例中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为2.8~3.2;在另外的实 施例中，所述磷酸盐缓冲液的PH值为3。
[0054]在本发明的实施例中是，所述高效液相色谱检测过程中的流动相流速为0.9mL/ min~1.2mL/min;在其他的实施例中，所述高效液相色谱检测过程中的流动相流速为ImL/ min~I. lmL/min;在另外的实施例中，所述高效液相色谱检测过程中流动相的流速为ImL/ min。在本发明的实施例中，流动相的流速较低会得到的液相色谱图中峰会展宽，柱效降低； 流动相的流速较高柱压较大，会影响色谱柱使得到的液相色谱图中各峰之间无法分开，不 利于杂质的分离。
[0055] 在本发明的实施例中，所述高效液相检测过程中可采用梯度洗脱的方式使流动相 通过色谱柱，所述梯度洗脱的方法为：
[0056] 在0~27min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从80 %~90 %下降到45 %~ 60%，乙腈在流动相中的质量含量从10%~20%增加到40%~55% ;
[0057] 在27min~35min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从45 %~60 %下降到20 % ~30%，乙腈在流动相中的质量含量从40%~55%增加到70%~80% ;
[0058] 在35min~45min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量保持20%~30%，乙腈在 流动相中的质量含量保持70%~80%。
[0059] 在其他的实施例中，所述梯度洗脱的方法为：
[0060] 在0~27min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从82 %~88%下降到52%~ 58%，乙腈在流动相中的质量含量从12%~18%增加到42%~48% ;
[0061 ] 在27min~35min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从52%~58%下降到22% ~28%，乙腈在流动相中的质量含量从42%~48%增加到72%~78% ;
[0062] 在35min~45min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量保持22%~28%，乙腈在 流动相中的质量含量保持72%~78%。
[0063] 在另外的实施例中，所述梯度洗脱的方法为：
[0064] 在0~27min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从84%~86%下降到54%~ 56%，乙腈在流动相中的质量含量从14%~16%增加到44%~46% ;
[0065] 在27min~35min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从54 %~56 %下降到24 % ~26%，乙腈在流动相中的质量含量从44%~46%增加到84%~86% ;
[0066] 在35111；[11~451]1；[11，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量保持24%~26%，乙腈在 流动相中的质量含量保持84%~86%。
[0067] 在另外的实施例中，所述梯度洗脱的方法为：
[0068] 在0~27min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从86%下降到55%，乙腈在流 动相中的质量含量从14%增加到45% ;
[0069] 在27min~35min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从55%下降到25%，乙腈 在流动相中的质量含量从45%增加到75% ;
[0070] 在35min~45min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量保持25%，乙腈在流动相 中的质量含量保持75%。
[0071] 在本发明的实施例中，所述高效液相色谱检测过程中的色谱柱填充剂为十八烷基 键合硅胶。
[0072] 在本发明的实施例中，所述高效液相色谱检测过程中填充剂的粒度为3μπι~6μπι; 在其他的实施例中，所述高效液相色谱检测过程中填充剂的粒度为4.5μπι~5.5μπι;在另外 的实施例中，所述高效液相色谱检测过程中填充剂的粒度为5μπι。在本发明的实施例中，所 述色谱柱的直径为4mm~5mm;在其他的实施例中，所述色谱柱的直径为4.2mm~4.8mm;在另 外的实施例中，所述色谱柱的直径为4.4mm~4.6mm。在本发明的实施例中，所述色谱柱的柱 长为200mm~300mm;在其他的实施例中，所述色谱柱的柱长为220mm~280mm;在另外的实施 例中，所述色谱柱的柱长为240mm~260mm;在另外的实施例中，所述色谱柱的柱长为250mm。
[0073] 在本发明的实施例中，所述高效液相色谱检测过程中的检测波长为200nm~ 230nm;在其他的实施例中，所述高效液相色谱检测过程中的检测波长为205nm~225nm;在 另外的实施例中，所述高效液相色谱检测过程中的210nm~220nm。在本发明的实施例中，高 效液相色谱检测过程中的检测波长为210nm~220nm时能够对采用高效液相色谱法对2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙 酸及其中的杂质具有较好的吸收作用。
[0074] 在本发明的实施例中，所述2-((S)_4-甲基-2-((S)-2_(2-吗啉代乙酰氨基)-4_苯 基丁酰胺基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸中杂质的检测方法为：
[0075] 采用高效液相色谱法对2-((S)_4-甲基-2-((S)-2_(2-吗啉代乙酰氨基)-4_苯基 丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸进行检测；
[0076]所述高效液相色谱检测过程中的色谱柱为C18色谱柱；流动相为乙腈和pH为3的 40_〇1/1的磷酸盐缓冲液;流动相流速为1111171]1；[11;检测波长为210111]1 ;
[0077]所述液相色谱检测过程中流动相采用梯度洗脱的方式通过色谱柱，所述梯度洗脱 的方法为：
[0078] 在0~27min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从86%下降到55%，乙腈在流 动相中的质量含量从14%增加到45% ;在27min~35min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量 含量从55%下降到25%，乙腈在流动相中的质量含量从45%增加到75% ;在35min~45min， 磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量保持25%，乙腈在流动相中的质量含量保持75%。 [0079] 在本发明的实施例中，所述2-((S)_4-甲基-2-((S)-2_(2-吗啉代乙酰氨基)-4_苯 基丁酰胺基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸中的杂质包括下述化合物中的一种或几种：
[0082] 本发明提供的2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基） 戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中杂质的检测方法能够同时分离多种已知杂质及部分未知杂 质，其中K3以及K4的多种异构体杂质同主成分的结构及性质较为相似，分离难度较大，本发 明提供的检测方法能够将杂质进行有效的分离，而且杂质分离的分离度、稳定性及重复性 较好。
[0083]按照2015版药典四部通则0512高效液相色谱方法，检测本发明提供的2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中杂 质的检测方法的系统适应性和稳定性，记录多次进样后测得的杂质峰的保留时间、杂质峰 面积以及不同时间杂质峰的面积;检测结果表明，本发明提供的2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中杂质的检测方法系 统适应性和稳定性较好，这种检测方法稳定可靠。
[0084]按照2015版药典四部通则0512高效液相色谱方法，对本发明提供的2- ((S) -4-甲 基-2-( (S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中杂质 的检测方法中2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨 基)-3-(S)_苯基丙酸和杂质的分离度进行检测，检测结果为，本发明提供的2-((S)-4-甲 基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中杂质 的检测方法中2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨 基)-3-(S)_苯基丙酸与前后相邻杂质（以保留时间计）的分离度分别为1.57~1.86和2.51 ~6.75，分离度较好，这种检测方法能够准确的检测出2-( (S)-4-甲基-2-( (S)-2-(2-吗啉 代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中的杂质。
[0085] 本发明以下实施例所用的原料均为市售商品。
[0086] 实施例1
[0087] 按照图1所示的工艺流程制备2-((S)_4-甲基-2-((S)-2_(2-吗啉代乙酰氨基)-4_ 苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸，图1为本发明实施例1中制备2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸的工艺流程 图：
[0088]将100g的式2所示结构的化合物和49.3g的式3所示结构的化合物在丙酮溶液中58 °C下进行3小时的反应，得到式1所示结构的化合物；
[0089]将100g的式1所示结构的化合物和8.3g的氢氧化锂在(TC下进行5小时的反应，得 至Ij2-((S)_4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯 基丙酸。
[0090] 按照2015版药典四部通则0441方法，对本发明实施例1制备得到的2-((S)-4-甲 基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸进行检 测，检测结果如图2所示，图2为本发明实施例1提供的方法检测2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸得到的核磁图谱，由图 2可知，本发明实施例1制备得到的2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基 丁酰胺基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸具有式I所示的结构。
[0091] 实施例2
[0092] 采用高效液相色谱法对本发明实施例1制备得到的2-((S)_4-甲基-2-((S)-2_(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸进行检测；
[0093]所述高效液相色谱检测过程中的色谱柱为C18色谱柱;流动相为乙腈和pH为3的磷 酸盐缓冲液;流动相流速为1111171^11;检测波长为21〇11111;
[0094]所述液相色谱检测过程中流动相采用梯度洗脱的方式通过色谱柱，所述梯度洗脱 的方法为：
[0095] 在0~27min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从86%下降到55%，乙腈在流 动相中的质量含量从14%增加到45% ;在27min~35min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量 含量从55%下降到25%，乙腈在流动相中的质量含量从45%增加到75% ;在35min~45min， 磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量保持25%，乙腈在流动相中的质量含量保持75%。 [0096] 本发明实施2检测2-( (S)-4-甲基-2-( (S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺 基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸后得到的色谱图如图3所示，图3为本发明实施例2提供的方 法检测2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)-苯基丙酸得到的液相色谱图，对图3中的数据进行分析结果如表1所示，表1为图3中的 数据分析结果。
[0097]表1图3中的数据分析结果
[0100] 由图3和表1可知，本发明实施例2提供的方法检测2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中含有式K1、式K1-2、式 K1 -4、式K1 -5、式K2、式K3、式K4所示结构的杂质，杂质的峰形较好。
[0101] 按照上述技术方案所述的方法，对本发明实施例2提供的2-((S)_4-甲基-2-((S)_ 2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸的检测方法进行系 统适应性以及稳定性测试，测试结果如表2和表3所示，表2为本发明实施例2提供的检测方 法的系统适应性，表3为本发明实施例2提供的检测方法的稳定性。
[0102] 表2本发明实施例2提供的检测方法的系统适应性
[0104] 注:TR代表保留时间，A代表面积，SRS (RSR，RRS，SSR，RSS，SRR)代表K4的异构体
[0105] 表3本发明实施例2提供的检测方法的稳定性
[0108] 由表2和表3可知，本发明实施例2提供的2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙 酰氨基)-4_苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸的检测方法稳定可靠。
[0109] 按照上述技术方案所述的方法，对本发明实施例2提供的检测方法中2-((S)_4-甲 基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸和杂质 的分离度进行检测，检测结果为，本发明实施例2提供的检测方法中2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸和前杂的分离 度为1.86,与后杂的分离度为6.75,主峰与杂质及杂质与杂质间分离度较好，能够准确的检 测出2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_ 苯基丙酸中的杂质。
[0110] 实施例3
[0111] 采用高效液相色谱法对本发明实施例1制备得到的2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸进行检测；
[0112] 所述高效液相色谱检测过程中的色谱柱为C18色谱柱;流动相为pH为3的35mmol/L 的磷酸盐缓冲液和乙腈;流动相流速为0.9mL/min;检测波长为220nm;
[0113] 所述液相色谱检测过程中流动相采用梯度洗脱的方式通过色谱柱，所述梯度洗脱 的方法为：
[0114] 在0~27min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从80%下降到55%，乙腈在流 动相中的质量含量从20%增加到45% ;在27min~35min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量 含量从55%下降到20%，乙腈在流动相中的质量含量从50%增加到80% ;在35min~45min， 磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量保持20%，乙腈在流动相中的质量含量保持80%。
[0115] 本发明实施例3检测2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰 胺基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸后得到的色谱图如图4所示，图4为本发明实施例3提供的 方法检测2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)-苯基丙酸得到的液相色谱图，由图4可知，本发明实施例3提供的方法检测2-((S)-4-甲 基-2-( (S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中含有 式K1、式K1 -2、式K1 -4、式K1 -5、式K2、式K3、式K4所示结构的杂质，杂质的峰形较好。
[0116] 按照上述技术方案所述的方法，对本发明实施例3提供的2-((S)_4-甲基-2-((S)_ 2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸的检测方法进行系 统适应性以及稳定性测试，测试结果如表4和表5所示，表4为本发明实施例3提供的检测方 法的系统适应性，表5为本发明实施例3提供的检测方法的稳定性。
[0117] 表4本发明实施例3提供的检测方法的系统适应性
[0122] 由表4和表5可知，本发明实施例3提供的2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙 酰氨基)-4_苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸的检测方法稳定可靠。
[0123] 按照上述技术方案所述的方法，对本发明实施例3提供的检测方法中2-((S)_4-甲 基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸和杂质 的分离度进行检测，检测结果为，本发明实施例1提供的检测方法中2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸和杂质的前杂 的分离度为1.57，与后杂的分离度为2.51，分离度较好，能够准确的检测出2- ((S) -4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中的杂质。
[0124] 实施例4
[0125] 采用高效液相色谱法对本发明实施例1制备得到的2-((S)_4-甲基-2-((S)-2_(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸进行检测；
[0126] 所述高效液相色谱检测过程中的色谱柱为C18色谱柱;流动相为pH为3的40mmol/L 的磷酸盐缓冲液和乙腈;流动相流速为1.2mL/min;检测波长为219nm;
[0127] 所述液相色谱检测过程中流动相采用梯度洗脱的方式通过色谱柱，所述梯度洗脱 的方法为：
[0128] 在0~27min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从90 %下降到45%，乙腈在流 动相中的质量含量从10%增加到55% ;在27min~35min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量 含量从45 %下降到30 %，乙腈在流动相中的质量含量从55 %增加到70 % ;在35min~ 45min，磷酸盐缓冲液在流动相中的质量含量保持30%，乙腈在流动相中的质量含量保持 70% 〇
[0129] 本发明实施例4检测2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4_苯基丁酰 胺基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸后得到的色谱图如图5所示，图5为本发明实施例4提供的 方法检测2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3- (S)-苯基丙酸得到的液相色谱图，由图5可知，本发明实施例4提供的方法检测2-((S)-4-甲 基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中含有 式K1、式K1 -2、式K1 -4、式K1 -5、式K2、式K3、式K4所示结构的杂质，杂质的峰形较好。
[0130] 按照上述技术方案所述的方法，对本发明实施例4提供的2-((S)_4-甲基-2-((S)_ 2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸的检测方法进行系 统适应性以及稳定性测试，测试结果如表6和表7所示，表6为本发明实施例4提供的检测方 法的系统适应性，表7为本发明实施例4提供的检测方法的稳定性。
[0131 ]表6本发明实施例4提供的检测方法的系统适应性
[0136] 由表6和表7可知，本发明实施例4提供的2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙 酰氨基)-4_苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸的检测方法稳定可靠。
[0137] 按照上述技术方案所述的方法，对本发明实施例4提供的检测方法中2-( (S)-4_甲 基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸和杂质 的分离度进行检测，检测结果为，本发明实施例4提供的检测方法中2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸和杂质的前杂 的分离度为1.76，与后杂的分离度为2.32，分离度较好，能够准确的检测出2-( (S)-4-甲基- 2- ((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中的杂质。
[0138] 比较例1
[0139] 按照实施例2所述的方法对实施例1制备得到的2-((S)_4-甲基-2-((S)-2_(2-吗 啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸进行高效液相色谱检测，与 实施例2不同的是，采用质量浓度为0.05%的三氟乙酸的水溶液作为流动相。
[0140] 本发明比较例丨检测2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4_苯基丁酰 胺基)戊酰氨基)-3_(S)-苯基丙酸后得到的色谱图如图6所示，图6为本发明比较例1提供的 方法检测2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)-苯基丙酸得到的液相色谱图，由图6可知，本发明比较例1提供的方法无法对2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中的 杂质进行有效的检测。
[0141] 由以上实施例可知，本发明提供了一种2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰 氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中杂质的检测方法，包括:采用高效液 相色谱法对2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)- 3- (S)_苯基丙酸进行检测;所述高效液相色谱法检测过程中的流动相为磷酸盐缓冲液和乙 臆。
[0142] 本发明采用磷酸盐缓冲液作为流动相中的水相，能够避免液相色谱检测过程中基 线的飘逸以及出现波峰波谷样的波动，使小杂峰的灵敏度降低，而且2-((S)_4-甲基-2-((S)-2_(2-吗啉代乙酰氨基)-4_苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸以及其中的杂 质对磷酸盐缓冲液不敏感，不会增加检测过程中的干扰，并且通过配合使用洗脱能力较强 的乙腈作为有机相，使本发明提供的方法能够较好的分离出2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中的杂质，杂质的分离度 较好，检测的准确度较高。此外，本发明提供的2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨 基)-4-苯基丁酰胺基)戊酰氨基)-3-(S)_苯基丙酸中杂质的检测方法稳定性和重复性较 好，检测方法稳定可靠。
【主权项】
1. 一种2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗嘟代乙酷氨基)-4-苯基下酷胺基)戊酷氨基)- 3-(S)-苯基丙酸中杂质的检测方法，包括： 采用高效液相色谱法对2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗嘟代乙酷氨基)-4-苯基下酷 胺基)戊酷氨基)-3-(S)-苯基丙酸进行检测； 所述高效液相色谱法检测过程中的流动相为憐酸盐缓冲液和乙腊。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述憐酸盐缓冲液的质量浓度为 35mmol/L~45mmol/L。3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述憐酸盐缓冲液的pH值为2.5~ 3.5。4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测过程中的流动 相流速为 0 · 9mL/min~1.2mL/min。5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相检测过程中采用梯度洗 脱的方式使流动相通过色谱柱，所述梯度洗脱的方法为： 在0~27min，憐酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从80%~90%下降到45%~60%， 乙腊在流动相中的质量含量从10%~20%增加到40%~55% ; 在27min~35min，憐酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从45 %~60 %下降到20 %~ 30%，乙腊在流动相中的质量含量从40%~55%增加到70%~80% ; 在35min~45min，憐酸盐缓冲液在流动相中的质量含量保持20 %~30%，乙腊在流动 相中的质量含量保持70%~80%。6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测过程中的色谱 柱填充剂为十八烷基键合硅胶。7. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测过程中填充剂 的粒度为3皿~6皿。8. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测过程中的检测 波长为200nm~230nm。9. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗嘟代 乙酷氨基)-4-苯基下酷胺基)戊酷氨基)-3-(S)-苯基丙酸中杂质的检测方法具体为： 采用高效液相色谱法对2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2-吗嘟代乙酷氨基)-4-苯基下酷 胺基)戊酷氨基)-3-(S)-苯基丙酸进行检测； 所述高效液相色谱检测过程中的色谱柱为C18色谱柱；流动相为乙腊和pH为3的 40mmol/L的憐酸盐缓冲液;流动相流速为ImL/min;检测波长为210nm; 所述液相色谱检测过程中流动相采用梯度洗脱的方式通过色谱柱，所述梯度洗脱的方 法为： 在0~27min，憐酸盐缓冲液在流动相中的质量含量从86%下降到55%，乙腊在流动相 中的质量含量从14 %增加到45 % ;在27min~35min，憐酸盐缓冲液在流动相中的质量含量 从55%下降到25%，乙腊在流动相中的质量含量从45%增加到75%;在35min~45min，憐酸 盐缓冲液在流动相中的质量含量保持25%，乙腊在流动相中的质量含量保持75%。10. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述2-((S)-4-甲基-2-((S)-2-(2- 吗嘟代乙酷氨基)-4-苯基下酷胺基)戊酷氨基)-3-(S)-苯基丙酸中的杂质包括式K1~式 K4-SRS中的一种或几种：
【文档编号】G01N30/02GK105938123SQ201510955476
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2015年12月18日
【发明人】周敏, 王青山, 费洪, 石功名, 贺耘
【申请人】重庆两江药物研发中心有限公司