一种表面等离子共振仪芯片及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种表面等离子共振仪芯片及其制备方法；芯片是基于多巴胺接枝透明质酸和谷胱甘肽修饰的表面等离子共振仪芯片；包括玻璃片基底，上面镀有铬层和金膜层。首先通过酰胺化反应合成多巴胺接枝透明质酸，然后通过多巴胺氧化聚合时的粘附性将透明质酸连接到金膜表面，进一步通过迈克尔加成反应将谷胱甘肽修饰到透明质酸表面，从而获得一种基于多巴胺接枝透明质酸与谷胱甘肽修饰的表面等离子共振仪芯片。本发明的芯片在单一蛋白(牛血清蛋白、溶菌酶、β?乳球蛋白)以及复杂体系牛奶中均具有比多巴胺接枝透明质酸修饰的芯片更好的抗污染性能。本发明的芯片具有优良的抗污染性能，且制备方法简便，原料易于合成，有很好的可行性和实用性。
【专利说明】
-种表面等离子共振仪巧片及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于表面等离子共振谱仪抗污染忍片的设计和制备方法;特别是一种基于 多己胺接枝透明质酸和谷脫甘肤修饰的表面等离子共振仪忍片及其制备方法，
【背景技术】
[0002] 表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,简称SPR)仪是20世纪80年代出现 的一种生物传感器技术，当入射光从高折射率介质入射到低折射率介质时，会发生全反射， 此时若在介质交界面处锻一层金属薄膜(金或银），入射光产生的渐逝波会引起金属表面自 由电子发生集体振荡，进而形成等离子体，当渐逝波与表面等离子体振荡的频率和波数相 等时，即产生共振现象(SPR)，导致能量从渐逝波转移到表面等离子波中，使反射光的强度 大大减弱，呈现衰减全反射现象，当反射光的强度为零时的入射角称为共振角。共振角与金 属薄膜界面介质折射率有关，而折射率又随结合在金属薄膜表面的分子质量而变化，故可 通过分析共振角来获得分子间相互作用的信息，由于其具有检测快速且无需标记等特点， 已被广泛应用于蛋白质组学、药物研发、临床诊断、食品安全和环境监测等领域，并且显示 出广阔的应用前景。
[0003] SPR忍片是表面等离子共振仪最为核屯、的组件，提供产生SPR信号的必须物理条 件，主要包括禪合器件、金属膜和表面基质。然而，应用表面等离子共振仪进行分析测试时， 传感忍片的表面污染是一个普遍存在的问题，来自样品中的生物分子或微生物的非特异性 吸附将降低定量检测的准确性，产生假阳性结果。因此，开发有效抵抗非特异性吸附的表面 是提高表面等离子共振传感器灵敏度和精确度的首要问题。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于提供一种基于多己胺接枝透明质酸(HADA)和谷脫甘肤(G甜)修饰 的表面等离子共振仪忍片及其制备方法。该忍片制备成本低，修饰方法简单且不依赖于表 面的材料，相比单独的多己胺接枝透明质酸具有更好的抗蛋白能力。
[0005] 本发明是通过W下技术方案加 W实现的：
[0006] -种表面等离子共振仪忍片;是基于多己胺接枝透明质酸和谷脫甘肤修饰的表面 等离子共振仪忍片。
[0007] 本发明的表面等离子共振仪忍片；如图1所示，在玻璃片基底（1)上设置有涂层2- 3nm厚的铭层(2)，在铭层上设置有45-50nm厚的金膜层(3);在金膜(3)上修饰一层多己胺接 枝透明质酸层(4)，在多己胺接枝透明质酸层(4)上修饰一层谷脫甘肤层(5)。
[000引和可W在金膜层（3)和多己胺接枝透明质酸层(4)之间设置一层5-10皿厚的二氧 化娃层(6)。
[0009]本发明的表面等离子共振仪忍片的制备方法;步骤如下：
[0010] 1)用抑=7.4的憐酸盐缓冲液配制浓度为5-15111旨/111诚多己胺接枝透明质酸溶液； 将清洗干净的SH?忍片浸入上述多己胺接枝透明质酸溶液中，常溫下浸泡2-1化后取出，用 乙醇和去离子清洗使忍片表面清洗洁净，并用氮气吹干备用；
[OOW 2)用抑=8.5的立径甲基氨基甲烧-盐酸盐缓冲液配制浓度为5-15mg/mL的谷脫甘 肤溶液;将修饰有透明质酸的Sra忍片浸入上述谷脫甘肤溶液中，常溫下浸泡12-24h后取 出；用乙醇和去离子清洗使忍片表面清洗洁净，并用氮气吹干。
[0012] 憐酸盐缓冲液包括IOmM憐酸盐、138mM氯化钢和2.7mM氯化钟。
[0013 ] S径甲基氨基甲烧-盐酸盐缓冲液包括SOmMS径甲基氨基甲烧。
[0014] =径甲基氨基甲烧-盐酸盐缓冲液预先用高纯氮进行脱气处理。
[0015] 本发明的有益效果
[0016] 1)本发明研制的基于多己胺接枝透明质酸修饰的sra忍片化ADA-Au)具有较好的 抗蛋白能力。在溶菌酶、牛血清蛋白、e-乳球蛋白中非特性吸附量分别为2.27ng/cm2、 21.4211旨/畑12、16.0〇11旨/畑12，见附图3，远低于各蛋白在5邸裸金忍片表面的非特异性吸附量， 见附表1。而在牛奶中的非特异性吸附量为175.75ng/cm2,相比牛奶中的蛋白在裸金表面上 的非特异性吸附量提高了近一倍。
[0017] 2)本发明研制的基于多己胺接枝透明质酸与谷脫甘肤修饰的SPR忍片化ADA-G- Au)具有相比单纯多己胺接枝透明质酸修饰的Sra忍片化ADA-Au)具有更好的抗蛋白能力。 在溶菌酶、牛血清蛋白、0-乳球蛋白中非特异性吸附量分别为0.59ng/cm2、7.51ng/cm2、 1.5化旨/畑12，在牛奶中的非特异性吸附量为34.41叫/畑12，见附图3，相比于多己胺接枝透明 质酸修饰的SPR忍片(HADA-Au)抗蛋白能力提高一倍W上。
[0018] 3)本发明研制的基于多己胺接枝透明质酸与还原性谷脫甘肤修饰的SH?忍片 (HADA-G-Au)具有生物功能化作用，如可通过固载牛血清蛋白抗体进而检测其抗原。
[0019] 4)本发明研制的基于多己胺接枝透明质酸与还原性谷脫甘肤修饰的SH?忍片 化ADA-G-Au)具有高稳定性，干燥状态下储存3个月或抑为7.4憐酸盐缓冲液中储存7天后， 抗污染性能无变化。
[0020] 5)相比传统商业化的抗污染材料SH?忍片的制备方法，本发明研制的基于多己胺 接枝透明质酸与谷脫甘肤修饰的Sra忍片化ADA-G-Au)的制备方法更为简便，且成本低廉， 生物相容性好。
【附图说明】
[0021] 图1基于多己胺接枝透明质酸与还原性谷脫甘肤修饰的SPR忍片化ADA-G-Au);其 中，1-玻璃片基底，2-铭层，3-金膜层，4-多己胺接枝透明质酸层（HADA) ,5-谷脫甘肤层 (G甜)。
[0022] 图2基于多己胺接枝透明质酸与还原性谷脫甘肤修饰的sra忍片化ADA-G-Si〇2); 其中，1-玻璃片基底，2-铭层，3-金膜层，4-多己胺接枝透明质酸层化ADA), 5-谷脫甘肤层 (G甜），6-二氧化娃层。
[0023] 图3多己胺接枝透明质酸修饰的SPR忍片化ADA-Au)及多己胺接枝透明质酸与谷脫 甘肤修饰的Sra忍片(HADA-G-Au)对Img/mL的溶菌酶化ysozyme)、牛血清蛋白（BSA)、e-乳球 蛋白溶液W及牛奶中蛋白的非特异性吸附量。
[0024] 表1SPR裸金忍片对Img/mL的溶菌酶化ysozyme)、牛血清蛋白（BSA)、0-乳球蛋白 (P-Iactoglobulin)、牛奶中蛋白的非特异性吸附量。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明：
[00%]在玻璃片基底（1)上涂覆一层2-化m厚的铭层（2)和45-50皿厚的金膜层(3)，即获 得SH?裸金忍片。然后通过疏水相互作用在金膜（3)上修饰一层多己胺接枝透明质酸层 (HADAK4)，再利用多己胺基团氧化聚合时形成的酿基与还原型谷脫甘肤上的琉基之间的 迈克尔加成反应，将谷脫甘肤修饰在多己胺透明质酸层上，形成一层谷脫甘肤层(GSHK5)。 或在SPR裸金忍片的基础上先修饰一层其他材料的薄层，如附图2:在金膜层(3)上涂覆一层 5-lOnm厚的二氧化娃层(6)，然后利用多己胺基团与基底间的氨键作用在二氧化娃层(6)上 修饰一层多己胺接枝透明质酸层化ADAK4)，再通过迈克尔加成反应在多己胺透明质酸层 上修饰一层谷脫甘肤层(G甜)（5 )，即获得SPR二氧化娃忍片。
[0027]基于多己胺接枝透明质酸化ADA)和谷脫甘肤(G甜)修饰的表面等离子共振仪忍片 制备方法，步骤如下：
[002引a)多己胺接枝透明质酸(HADA)的修饰
[0029] 用抑=7.4的憐酸盐缓冲液(包括1 OmM憐酸盐，13SmM氯化钢和2.7mM氯化钟)配制 浓度为5-15mg/血的多己胺接枝透明质酸(HADA)溶液;将清洗干净的Sra忍片浸入上述多己 胺接枝透明质酸(HADA)溶液中，常溫下浸泡2-1化后取出，用乙醇和去离子清洗使忍片表面 清洗洁净，并用氮气吹干备用；
[0030] b)透明质酸表面谷脫甘肤(G甜)的修饰
[0031] 用pH = 8.5的S径甲基氨基甲烧-盐酸盐缓冲液(包括SOmMS径甲基氨基甲烧)配 制浓度为5-15mg/mL的谷脫甘肤(G細)溶液;将修饰有透明质酸的Sra忍片浸入上述谷脫甘 肤(G甜)溶液中，常溫下浸泡12-24h后取出；用乙醇和去离子清洗使忍片表面清洗洁净，并 用氮气吹干即可。
[0032] 实施例1
[0033] 1)裸金忍片制备
[0034] 如附图1所示，采用电子束蒸发锻膜技术在BK7玻璃基底（1)上涂覆一层2-3nm厚铭 层(2)和一层45-50nm厚金膜(3)，获得了裸金忍片。
[0035] 2)裸金忍片预处理
[0036] 将步骤1)获得的裸金忍片置于紫外臭氧清洗仪中，紫外灯光照30min后取出，用乙 醇、水依次清洗=次，氮气吹干备用。
[0037] 3)多己胺接枝透明质酸(HADA)的合成
[0038] 用十二水合憐酸氨二钢和憐酸二氨钟配制pH = 7.4的IOmM憐酸盐缓冲液。取1.2g 透明质酸化A)溶于120mL上述憐酸盐缓冲液中，用1.OM盐酸将溶液的抑调至5.5,然后向溶 液中加入575. lmg(3mmol)l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，揽拌15min后加入 568.92mg( 3mmol)多己胺，用IM盐酸将溶液的抑值维持在5.5且在室溫下揽拌反应2小时。将 反应后的溶液置于透析袋(MWC0:8000-14000)中，且在抑=5.0的水溶液中透析2天，再在去 离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到粉末状的产物(HADA)，于-20°C下储存备用。
[0039] 4)裸金忍片表面多己胺接枝透明质酸修饰
[0040] 将30mg多己胺接枝透明质酸化ADA)溶于6mL的憐酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为 5mg/mL。然后将2)获得的忍片浸泡在上述溶液中，在水浴摇床中于37°C且l(K)rpm的摇速下 反应地。反应后的忍片用无水乙醇、水依次清洗=次，氮气吹干。即获得基于多己胺接枝透 明质酸(如附图1中的4所示)修饰的SPR忍片(HADA-Au)。
[0041] 5)透明质酸忍片表面谷脫甘肤修饰
[0042] 用S径甲基氨基甲烧和盐酸配制抑= 8.5的50mM立径甲基氨基甲烧-盐酸缓冲液。 用预先脱气的上述S径甲基氨基甲烧-盐酸盐缓冲液配制浓度为5mg/mL的谷脫甘肤溶液， 将4)获得的透明质酸修饰的SH?忍片浸入上述溶液中，常溫下浸泡12h后取出。用乙醇和去 离子水依次清洗3次，并用氮气吹干备用，即获得如附图1中的透明质酸与谷脫甘肤(如附图 1中的4，5所示)修饰的Sra忍片(HADA-G-Au);
[0043] 6)多己胺接枝的透明质酸与谷脫甘肤修饰的SPR忍片化ADA-G-Au)表面蛋白吸附 量检测
[0044] 将步骤5)获得的多己胺接枝透明质酸与谷脫甘肤修饰的SPR忍片化ADA-G-Au)用 柏油贴合到sra系统的棱镜上。W抑为7.4的憐酸缓冲液为流动相，流速为25化/min。待基线 平稳后，往定量环中注入25化L Img/mL的牛血清白蛋白，经流动相推动蛋白溶液到达忍片 表面，由sra系统测定共振角实时变化曲线，2〇min后读取sra共振角变化值，并计算非特异 性吸附量。
[0045] 实施例2
[0046] 具体操作方法如下：
[0047] 1)裸金忍片制备
[0048] 如附图1所示，采用电子束蒸发锻膜技术在BK7玻璃基底（1)上涂覆一层2-3nm厚铭 层(2)和一层45-50nm厚金膜(3)，获得了裸金忍片。
[0049] 2)裸金忍片预处理
[0050] 将步骤1)获得的裸金忍片置于紫外臭氧清洗仪中，紫外灯光照30min后取出，用乙 醇、水依次清洗=次，氮气吹干备用。
[0051] 3)多己胺接枝透明质酸(HADA)的合成
[0052] 用十二水合憐酸氨二钢和憐酸二氨钟配制pH = 7.4的IOmM憐酸盐缓冲液。取1.2g 透明质酸化A)溶于120mL上述憐酸盐缓冲液中，用1.OM盐酸将溶液的抑调至5.5,然后向溶 液中加入575. lmg(3mmol)l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，揽拌15min后加入 568.92mg( 3mmol)多己胺，用IM盐酸将溶液的抑值维持在5.5且在室溫下揽拌反应2小时。将 反应后的溶液置于透析袋(MWC0:8000-14000)中，且在抑=5.0的水溶液中透析2天，再在去 离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到粉末状的产物(HADA)，于-20°C下储存备用。
[0053] 4)裸金忍片表面多己胺接枝透明质酸修饰
[0054] 将30mg多己胺接枝透明质酸化ADA)溶于3mL的憐酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为 lOmg/mL。然后将2)获得的忍片浸泡在上述溶液中，在水浴摇床中于37°C且l(K)rpm的摇速下 反应化。反应后的忍片用无水乙醇、水依次清洗=次，氮气吹干。即获得基于多己胺接枝透 明质酸(如附图1中的4所示)修饰的SPR忍片(HADA-Au)。
[0055] 5)透明质酸忍片表面谷脫甘肤修饰
[0056] 用S径甲基氨基甲烧和盐酸配制抑=8.5的SOmMS径甲基氨基甲烧-盐酸缓冲液。 用预先脱气的上述=径甲基氨基甲烧-盐酸盐缓冲液配制浓度为IOmg/血的谷脫甘肤溶液， 将4)获得的透明质酸修饰的SH?忍片浸入上述溶液中，常溫下浸泡24h后取出。用乙醇和去 离子水依次清洗3次，并用氮气吹干备用，即获得如附图1中的透明质酸与谷脫甘肤(如附图 1中的4，5所示)修饰的Sra忍片(HADA-G-Au);
[0057] 6)多己胺接枝的透明质酸与谷脫甘肤修饰的SPR忍片化ADA-G-Au)表面蛋白吸附 量检测
[0化引将步骤5)获得的多己胺接枝透明质酸与谷脫甘肤修饰的SPR忍片化ADA-G-Au)用 柏油贴合到Sra系统的棱镜上。W抑为7.4的憐酸缓冲液为流动相，流速为25化/min。待基线 平稳后，往定量环中注入25化L Img/mL的牛血清白蛋白，经流动相推动蛋白溶液到达忍片 表面，由sra系统测定共振角实时变化曲线，20min后读取sra共振角变化值，并计算非特异 性吸附量为16.98ng/cm2。
[0化9]实施例3
[0060] 具体操作方法如下：
[0061] 1)裸金忍片制备
[0062] 如附图1所示，采用电子束蒸发锻膜技术在BK7玻璃基底（1)上涂覆一层2-3nm厚铭 层(2)和一层45-50nm厚金膜(3)，获得了裸金忍片。
[0063] 2)裸金忍片预处理
[0064] 将步骤1)获得的裸金忍片置于紫外臭氧清洗仪中，紫外灯光照30min后取出，用乙 醇、水依次清洗=次，氮气吹干备用。
[0065] 3)多己胺接枝透明质酸(HADA)的合成
[0066] 用十二水合憐酸氨二钢和憐酸二氨钟配制pH = 7.4的IOmM憐酸盐缓冲液。取1.2g 透明质酸化A)溶于120mL上述憐酸盐缓冲液中，用1.OM盐酸将溶液的抑调至5.5,然后向溶 液中加入575. lmg(3mmol)l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，揽拌15min后加入 568.92mg( 3mmol)多己胺，用IM盐酸将溶液的抑值维持在5.5且在室溫下揽拌反应2小时。将 反应后的溶液置于透析袋(MWC0:8000-14000)中，且在抑=5.0的水溶液中透析2天，再在去 离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到粉末状的产物(HADA)，于-20°C下储存备用。
[0067] 4)裸金忍片表面多己胺接枝透明质酸修饰
[006引将30mg多己胺接枝透明质酸化ADA)溶于3mL的憐酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为 lOmg/mL。然后将2)获得的忍片浸泡在上述溶液中，在水浴摇床中于37°C且l(K)rpm的摇速下 反应地。反应后的忍片用无水乙醇、水依次清洗=次，氮气吹干。即获得基于多己胺接枝透 明质酸(如附图1中的4所示)修饰的SPR忍片(HADA-Au)。
[0069] 5)透明质酸忍片表面谷脫甘肤修饰
[0070] 用S径甲基氨基甲烧和盐酸配制抑=8.5的SOmMS径甲基氨基甲烧-盐酸缓冲液。 用预先脱气的上述=径甲基氨基甲烧-盐酸盐缓冲液配制浓度为IOmg/血的谷脫甘肤溶液， 将4)获得的透明质酸修饰的SH?忍片浸入上述溶液中，常溫下浸泡2地后取出。用乙醇和去 离子水依次清洗3次，并用氮气吹干备用，即获得如附图1中的透明质酸与谷脫甘肤层(如附 图1中的4，5所示)修饰的Sra忍片(HADA-G-Au);
[0071] 6)多己胺接枝透明质酸修饰的SPR忍片(HADA-Au)表面蛋白吸附量检测
[0072] 将步骤4)获得的多己胺接枝透明质酸修饰的SPR忍片化ADA-Au)用柏油贴合到SPR 系统的棱镜上。W抑为7.4的憐酸缓冲液为流动相，流速为25化/min。待基线平稳后，往定量 环中注入25化L Img/mL的溶菌酶或牛血清白蛋白或(6-乳球蛋白或牛奶(30mg/mL)，经流动 相推动蛋白溶液到达忍片表面，由sra系统测定共振角实时变化曲线，2〇min后读取sra共振 角变化值，并计算非特异性吸附量。如附图3所示，在溶菌酶或牛血清白蛋白或0-乳球蛋白 中非特异性吸附量分别为2.27ng/cm2、21.4化g/cm2、16. OOng/cm2，远低于各蛋白在SPR裸金 忍片表面的非特异性吸附量，见附表1。而对于来自牛奶中的蛋白，表面的非特异性吸附量 为175.75ng/cm2,相比裸金表面上牛奶的非特异性吸附量提高了近一倍。
[0073] 表1蛋白在SPR裸金忍片表面的非特异性吸附量
[0074]
[0075] 7)多己胺接枝透明质酸与谷脫甘肤修饰的Sra忍片化ADA-G-Au)表面蛋白吸附量 检测
[0076] 将步骤5)获得的多己胺接枝透明质酸与谷脫甘肤修饰的SPR忍片化ADA-G-Au)用 柏油贴合到sra系统的棱镜上。W抑为7.4的憐酸缓冲液为流动相，流速为25化/min。待基线 平稳后，往定量环中注入250化Img/mL的溶菌酶或牛血清白蛋白或0-乳球蛋白或牛奶 (30mg/mL)中，经流动相推动蛋白溶液到达忍片表面，由Sra系统测定共振角实时变化曲线， 20min后读取Sra共振角变化值，并计算非特异性吸附量。如附图3所示，表面蛋白的非特异 性吸附量分别为0.59ng/cm2、7.51ng/cm2、1.5化g/cm2,34.41ng/cm 2。相比于多己胺接枝透 明质酸修饰的SPR忍片(HADA-Au)抗蛋白能力提高一倍W上。
[0077] 实施例4
[007引具体操作方法如下：
[00巧]1)裸金忍片制备
[0080] 如附图1所示，采用电子束蒸发锻膜技术在服7玻璃基底（1)上涂覆一层2-3nm厚铭 层(2)和一层45-50nm厚金膜(3)，获得了裸金忍片。
[0081] 2)裸金忍片预处理
[0082] 将步骤1)获得的裸金忍片置于紫外臭氧清洗仪中，紫外灯光照30min后取出，用乙 醇、水依次清洗=次，氮气吹干备用。
[0083] 3)多己胺接枝透明质酸的合成
[0084] 用十二水合憐酸氨二钢和憐酸二氨钟配制pH = 7.4的IOmM憐酸盐缓冲液。取1.2g 透明质酸化A)溶于120mL上述憐酸盐缓冲液中，用1. OM盐酸将溶液的抑调至5.5，然后向溶 液中加入575.1mg(3mmol)l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，揽拌15min后加入 568.92mg( 3mmol)多己胺，用IM盐酸将溶液的抑值维持在5.5且在室溫下揽拌反应2小时。将 反应后的溶液置于透析袋(MWCO: 8000-14000)中，且在抑=5.0的水溶液中透析2天，再在去 离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到粉末状的产物(HADA)，于-20°C下储存备用。
[0085] 4)裸金忍片表面多己胺接枝透明质酸修饰
[0086] 将30mg多己胺接枝透明质酸化ADA)溶于3mL的憐酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为 lOmg/mL。然后将2)获得的忍片浸泡在上述溶液中，在水浴摇床中于37°C且l(K)rpm的摇速下 反应12h。反应后的忍片用无水乙醇、水依次清洗=次，氮气吹干。即获得基于多己胺接枝透 明质酸(如附图1中的4所示)修饰的SPR忍片(HADA-Au)。
[0087] 5)透明质酸忍片表面谷脫甘肤修饰
[00则用S径甲基氨基甲烧和盐酸配制抑=8.5的SOmMS径甲基氨基甲烧-盐酸缓冲液。 用预先脱气的上述=径甲基氨基甲烧-盐酸盐缓冲液配制浓度为IOmg/血的谷脫甘肤溶液， 将4)获得的透明质酸修饰的SH?忍片浸入上述溶液中，常溫下浸泡2地后取出。用乙醇和去 离子水依次清洗3次，并用氮气吹干备用，即获得如附图1中的透明质酸与谷脫甘肤层(如附 图1中的4，5所示)修饰的Sra忍片(HADA-G-Au);
[0089] 6)多己胺接枝透明质酸与谷脫甘肤修饰的sra忍片化ADA-G-Au)表面蛋白吸附量 检测将步骤5)获得的多己胺接枝透明质酸与谷脫甘肤修饰的Sra忍片化ADA-G-Au)用柏油 贴合到Sra系统的棱镜上。W抑为7.4的憐酸缓冲液为流动相，流速为25化/min。待基线平稳 后，往定量环中注入25化L Img/血的牛血清白蛋白，经流动相推动蛋白溶液到达忍片表面， 由SPR系统测定共振角实时变化曲线，20min后读取Sra共振角变化值，并计算非特异性吸附 量为 15.9 化 g/cm2。
[0090] 实施例5
[0091 ]具体操作方法如下：
[0092] 1)二氧化娃忍片的制备
[0093] 如附图2所示，采用电子束蒸发锻膜技术在BK7玻璃基底（1)上涂覆一层2-3nm厚铭 层(2)和一层45-50皿厚金膜(3)，然后在金膜上涂覆一层5-lOnm厚的二氧化娃层(6)，获得 了表面为二氧化娃的忍片。
[0094] 2)二氧化娃忍片预处理
[00M]将步骤1)获得的二氧化娃忍片置于紫外臭氧清洗仪中，紫外灯光照30min后取出， 用乙醇、水依次清洗=次，氮气吹干备用。
[0096] 3)多己胺接枝透明质酸的合成
[0097] 用十二水合憐酸氨二钢和憐酸二氨钟配制pH = 7.4的IOmM憐酸盐缓冲液。取1.2g 透明质酸化A)溶于120mL上述憐酸盐缓冲液中，用1.OM盐酸将溶液的抑调至5.5,然后向溶 液中加入575. lmg(3mmol)l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，揽拌15min后加入 568.92mg( 3mmol)多己胺，用IM盐酸将溶液的抑值维持在5.5且在室溫下揽拌反应2小时。将 反应后的溶液置于透析袋(MWC0:8000-14000)中，且在抑=5.0的水溶液中透析2天，再在去 离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到粉末状的产物(HADA)，于-20°C下储存备用。
[0098] 4)二氧化娃忍片表面多己胺接枝透明质酸修饰
[0099] 将45mg多己胺接枝透明质酸化ADA)溶于3mL的憐酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为 15mg/mL。然后将2)获得的忍片浸泡在上述溶液中，在水浴摇床中于37°C且l(K)rpm的摇速下 反应12h。反应后的忍片用无水乙醇、水依次清洗=次，氮气吹干。即获得基于多己胺接枝透 明质酸(如附图2中的4所示)修饰的Sra忍片(HADA- Si〇2)。
[0100] 5)透明质酸忍片表面谷脫甘肤修饰
[0101] 用S径甲基氨基甲烧和盐酸配制抑= 8.5的50mM立径甲基氨基甲烧-盐酸缓冲液。 用预先脱气的上述=径甲基氨基甲烧-盐酸盐缓冲液配制浓度为15mg/血的谷脫甘肤溶液， 将4)获得的透明质酸修饰的SH?忍片浸入上述溶液中，常溫下浸泡12h后取出。用乙醇和去 离子水依次清洗3次，并用氮气吹干备用，即获得如附图2中的透明质酸与谷脫甘肤层(如附 图2中的4，5所示)修饰的Sra忍片(HADA-G-S i 〇2);
[0102] 6)多己胺接枝透明质酸与谷脫甘肤修饰的Sra忍片化ADA-G-Au)表面蛋白吸附量 检测
[0103] 将步骤5)获得的多己胺接枝透明质酸与谷脫甘肤修饰的SPR忍片化ADA-G-Au)用 柏油贴合到sra系统的棱镜上。W抑为7.4的憐酸缓冲液为流动相，流速为25化/min。待基线 平稳后，往定量环中注入25化L Img/mL的牛血清白蛋白，经流动相推动蛋白溶液到达忍片 表面，由SPR系统测定共振角实时变化曲线并计算蛋白吸附量。
[0104] 本发明公开和提出的一种表面等离子共振仪忍片及其制备方法，本领域技术人员 可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通 过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对 本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出 的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括 在本发明精神、范围和内容中。
【主权项】
1. 一种表面等离子共振仪芯片;其特征是基于多巴胺接枝透明质酸和谷胱甘肽修饰的 表面等离子共振仪芯片。2. 如权利要求1所述的芯片；其特征是在玻璃片基底（1)上设置有涂层2-3nm厚的铬层 (2)，在铬层上设置有45-50nm厚的金膜层(3);在金膜(3)上修饰一层多巴胺接枝透明质酸 层(4)，在多巴胺接枝透明质酸层(4)上修饰一层谷胱甘肽层(5)。3. 如权利要求2所述的芯片，其特征在金膜层(3)和多巴胺接枝透明质酸层(4)之间设 置一层5-1 Onm厚的二氧化娃层(6) 〇4. 权利要求1的表面等离子共振仪芯片的制备方法;其特征是： 1) 用pH = 7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为5-15mg/mL的多巴胺接枝透明质酸溶液;将清 洗干净的SPR芯片浸入上述多巴胺接枝透明质酸溶液中，常温下浸泡2-12h后取出，用乙醇 和去离子清洗使芯片表面清洗洁净，并用氮气吹干备用； 2) 用pH = 8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液配制浓度为5-15mg/mL的谷胱甘肽溶 液;将修饰有透明质酸的SPR芯片浸入上述谷胱甘肽溶液中，常温下浸泡12-24h后取出；用 乙醇和去离子清洗使芯片表面清洗洁净，并用氮气吹干。5. 如权利要求4所述的方法，其特征是磷酸盐缓冲液包括IOmM磷酸盐、138mM氯化钠和 2.7mM氯化钾。6. 如权利要求4所述的方法，其特征是三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液为50mM三羟甲 基氨基甲烷。7. 如权利要求4所述的方法，其特征是三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液进行预先脱气 处理。
【文档编号】G01N21/552GK105954237SQ201610268204
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】苏荣欣, 黄仁亮, 叶慧君, 齐崴
【申请人】天津大学