一种无酶超氧阴离子电化学传感器及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供一种无酶超氧阴离子电化学传感器的制备方法，是先用L?半胱氨酸对多壁碳纳米管进行功能化，得到Cys?MWCNTs，然后采用电化学法将银纳米粒子沉积到Cys?MWCNTs修饰电极的表面得到的。本发明还提供应用该方法制备得到的无酶超氧阴离子电化学传感器及其应用。本发明首次利用银纳米粒子对活性氧的催化作用代替SOD酶以达到对超氧阴离子的检测目的，方法简单、易操作，且不易失活，可以长期保存使用。并且将该修饰电极成功应用于检测活细胞（PC12）释放的超氧阴离子。本发明构建的修饰电极对O2·?有很好的电化学响应，具有线性范围宽、灵敏度高、响应时间短、稳定性以及重复性好等特点。
【专利说明】
-种无酶超氧阴离子电化学传感器及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种无酶超氧阴离子电化学传感器及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 活性氧(ROS)是重要的细胞内信号分子，主要调节DNA损伤、蛋白质合成、细胞调亡 等等。其中，超氧阴离子(〇2 ?-)作为最重要且最活跃的ROS之一，参与了许多生理和病理过 程，会对生物器官造成损伤。近年来，〇2 ? 1 农度与人类健康之间的关系引起了极大关注，从 体内应用学的角度，要求化?-的动态检测线性范围宽，不仅在毫摩尔、微摩尔的摩尔浓度， 甚至需要延伸至纳摩尔级别的摩尔浓度。与此同时，由于化?-极不稳定，很容易衰变为其 它活性氧单元，因此，建立高效、可靠的定性定量检测方法仍是一个难点。
[0003] 近年来电化学方法由于其简单易用、低成本、可靠性高、灵敏度高、选择性好、检出 限低而受到广泛关注。研究较为广泛的是将铜-锋超氧化物歧化酶(化-Zn SOD)固定在电极 表面构建酶传感器。然而，由于酶的活性中屯、被表面蛋白质覆盖，造成电子传递困难。此外， 酶的价格昂贵，容易失活，对环境要求较高，酶电极的制备较为繁琐且不易储存，运些不足 都大大限制了酶传感器的发展。因此，研制具有低检测限的无酶化传感器就显得尤为重 要。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种无酶超氧阴离子电化学传感 器及其制备方法和应用。
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种无酶超氧阴离子电化学传感器的制备方法，是先 用心半脫氨酸化-切S)对多壁碳纳米管(MWCNTs)进行功能化，得到切S-MWCNTs，然后采用电 化学法将银纳米粒子(AgNPs)沉积到Cys-MWCNTs修饰电极的表面得到的。
[0006] 作为优选，所述用心半脫氨酸化-切S)对多壁碳纳米管(MWCNTs)进行功能化的具 体方法为:将纯化后的多壁碳纳米管与k半脫氨酸分散于超纯水中，加入1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳酷二亚胺盐酸盐和N-径基班巧酷亚胺，室溫揽拌20-2化，离屯、后水洗，配成 分散液;作为优选，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酷二亚胺盐酸盐和N-径基班巧酷亚 胺的加入量均为多壁碳纳米管质量的20倍。
[0007] 作为优选，所述多壁碳纳米管与心半脫氨酸的质量比为1:1。
[000引作为优选，所述采用电化学法将银纳米粒子(AgNPs)沉积到切S-MWCNTs修饰电极 的表面的具体方法为:将心半脫氨酸功能化的多壁碳纳米管分散液滴涂于预处理的裸玻碳 电极，烤干后，得到k半脫氨酸功能化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极;再将此修饰电极插入 含有硝酸银的硝酸钟电解质溶液中，进行电化学沉积，制得沉积有银纳米粒子的无酶超氧 阴离子电化学传感器。
[0009]作为优选，所述电化学沉积是在OV下用计时电流法电化学沉积1-300S;作为优选， 电化学沉积200s。
[0010]在该电化学沉积时间内，均能得到修饰电极，当电化学沉积时间为200s时，修饰电 极对超氧阴离子的电化学响应峰电流最大。
[0011]作为优选，所述硝酸银的浓度为0.01-3111111〇1/1;作为优选，浓度为1mmol/L。
[0012] 在该浓度范围内，均能得到修饰电极，当硝酸银的浓度为1mmol/L时，修饰电极对 超氧阴离子的电化学响应峰电流最大。
[0013] 本发明的第二个目的是提供应用上述方法制备得到的无酶超氧阴离子电化学传 感器。
[0014] 本发明的第=个目的是提供上述无酶超氧阴离子电化学传感器在检测超氧阴离 子中的应用。
[0015] 作为优选，所述超氧阴离子为被AA刺激的PC12细胞释放的。
[0016] 作为优选，所述超氧阴离子为细胞PC12直接释放的。
[0017] 本发明优点和产生的有益效果是： 1、本发明构建了一个基于心半脫氨酸功能化碳纳米管和银纳米粒子的无酶化传感 器，首次利用银纳米粒子对活性氧的催化作用代替SOD酶W达到对超氧阴离子的检测目的， 相比于传统酶传感器的价格昂贵，容易失活，制备繁琐且不易储存等缺点，该传感器制备方 法简单，易操作，且不易失活，可W长期保存使用。
[001引2、本发明的修饰电极对化?-有超灵敏的电化学响应，响应时间短，宽的线性范围： 7X10-ll~7.41X10-5mol/L，低的检测限：2.33X10-llmol/L，W及好的稳定性和重复性等 优点。
[0019] 3、本发明的传感器不仅能够检测到被AA刺激的PC12细胞释放的〇2' -，还能直接检 测细胞PC12释放的化运表明该修饰电极在生命病理分析中具有极大的潜在价值，并有望 应用于与化?-有关的医学疾病诊断。
[0020]表1本发明与现有的〇2?节感器对测性能的比较
【附图说明】
[0021] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为本发明的修饰电极Ag化s/切s-MWCNTs/GCE的扫描电镜图（SEM); 图2为a:裸电极;b: AgNPs/切s-MWCNTs/GCE分别在含有l.OmM的化?-的化饱和的0.2M PBS(pH=7.0)中的循环伏安曲线。C是Ag化s/切s-MWCNTs/GCE在不含〇2 ?-的化饱和的0.2M PBS(pH=7.0)中的循环伏安曲线。扫速:50mV/s; 图3为AgNPs/切s-MWCNTs/GCE对不同浓度的化?-检测的计时电流曲线图（图3A，3B， 3D，3E)及化?-的还原峰电流与其浓度之间的线性关系图（图3C，3巧； 图4为Ag化s/切s-MWCNTs/GCE在含有1 X IO5个鼠肾上腺嗜铭细胞(PC12)的生理PBS缓 冲溶液中，通过连续滴加 IyM抗坏血酸(AA)刺激，检测PC12释放出的化?的计时电流曲线 图。
【具体实施方式】
[0022] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0023] 本发明实施过程中所使用的仪器和药品： CHI 660C电化学工作站(上海辰华仪器公司）用于进行循环伏安、计时电流的实验，石 英管加热式自动双重纯水蒸馈器（1810B，上海亚太技术玻璃公司）用于蒸超纯水。电子天平 (北京赛多利斯仪器有限公司），用于称量药品。超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司）。 =氧化二侣打磨粉(0.30曲1，0.05曲1，上海辰华仪器试剂公司）用于处理玻碳电极。饱和甘隶 参比电极，销对电极，憐酸二氨钢、憐酸氨二钢、氯化钟、硝酸银、硝酸钟(西安化学试剂厂）； 多壁碳纳米管(深圳纳米港有限公司）。实验过程中使用的水均为超纯水，实验所用的试剂 均为分析纯。
[0024] 本发明的一种无酶超氧阴离子电化学传感器的制备方法如下： a. 多壁碳纳米管的纯化：W混酸为氧化剂对多壁碳纳米管(MWCNTs)进行纯化，将 MWCNTs与体积比为3:1的浓硫酸和浓硝酸的混合溶液超声后，70°C加热回流化，用超纯水洗 涂至中性，50°C真空干燥； b. 制备k半脫氨酸-多壁碳纳米管复合材料:取等质量纯化后的多壁碳纳米管与心半 脫氨酸分散于超纯水中，随后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酷二亚胺盐酸盐和N-径 基班巧酷亚胺，两者的加入量均为碳纳米管(或心半脫氨酸）质量的20倍。1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳酷二亚胺盐酸盐和N-径基班巧酷亚胺为交联剂，可W促进碳纳米管上的簇 基和k半脫氨酸上的氨基发生酷胺化反应产生酷胺键，室溫揽拌2地，12000rmp离屯、，水洗4 次，配成l.Omg ? mL-i的分散液，待用； C.制备Ag化s/切S-MWCNTs修饰电极:将化L的心半脫氨酸功能化的多壁碳纳米管分 散液滴涂于预处理的裸玻碳电极，置于红外灯下烤干，制得k半脫氨酸功能化多壁碳纳米 管修饰的玻碳电极;再将此修饰电极插入含有0.01-3mM硝酸银的0 . IM硝酸钟电解质溶液 中，在OV下用计时电流法电化学沉积1-300S，从而制得沉积有银纳米粒子的心半脫氨酸功 能化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极(AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE)。
[0025] 实施例1 本发明的一种无酶超氧阴离子电化学传感器的制备方法如下： a. 多壁碳纳米管的纯化：W混酸为氧化剂对多壁碳纳米管(MWCNTs)进行纯化，将 MWCNTs与体积比为3:1的浓硫酸和浓硝酸的混合溶液超声后，70°C加热回流化，用超纯水洗 涂至中性，50°C真空干燥； b. 制备k半脫氨酸-多壁碳纳米管复合材料:取等质量纯化后的多壁碳纳米管与心半 脫氨酸分散于超纯水中，随后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酷二亚胺盐酸盐和N-径 基班巧酷亚胺，两者的加入量均为碳纳米管(或心半脫氨酸）质量的20倍。1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳酷二亚胺盐酸盐和N-径基班巧酷亚胺为交联剂，可W促进碳纳米管上的簇 基和k半脫氨酸上的氨基发生酷胺化反应产生酷胺键，室溫揽拌2地，12000rmp离屯、，水洗4 次，配成l.Omg ? mL-i的分散液，待用； C.制备Ag化s/切S-MWCNTs修饰电极:将化L的心半脫氨酸功能化的多壁碳纳米管分 散液滴涂于预处理的裸玻碳电极，置于红外灯下烤干，制得k半脫氨酸功能化多壁碳纳米 管修饰的玻碳电极;再将此修饰电极插入含有0.1 mM硝酸银的0.1 M硝酸钟电解质溶液中，在 OV下用计时电流法电化学沉积200s，从而制得沉积有银纳米粒子的心半脫氨酸功能化多壁 碳纳米管修饰的玻碳电极(AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE)。
[0026] 图1为本发明所制备修饰电极(Ag化s/切s-MWCNTs/GCE)的扫描电镜图（SEM)。从图 中可W看出通过电沉积合成银纳米粒子-1^-半脫氨酸功能化多壁碳纳米管修饰电极中，尺 寸约在20nm的球形银纳米粒子均匀地分布在多壁碳纳米管壁上，且没有团聚现象。
[0027] d.采用步骤C所得到的修饰电极为工作电极、销柱为对电极、饱和甘隶电极为参 比电极，组成S电极体系，将其共同浸入含有l.OmM化的化饱和的0.2M pH=7.0的憐酸盐 缓冲溶液中进行循环伏安扫描，循环伏安技术的电位窗设置为-0.8V-0.2V，得到修饰电极 对化?的电化学响应。
[002引图2为a:裸电极;b: AgNPs/切s-MWCNTs/GCE分别在含有l.OmM的02 ?-的化饱和的 0.2M PBS(pH=7.0)中的循环伏安曲线。C是Ag化s/切s-MWCNTs/GCE在不含02 ?-的化饱和的 0.2M PBS(pH=7.0)中的循环伏安曲线，扫速为50mV/s。
[0029] 由图可得:相比于裸电极，〇2 ?-在AgNPs /切s-MWCNTs/GCE上的还原峰电位发生了 明显的正移，且还原峰电流显著的增大，运表明AgNPs /切s-MWCNTs/GCE对化?-的还原有明 显的电催化作用，运主要归因于银纳米粒子对化的还原有很强的催化性能，而且Cys- MWCNTs作为支持基质，不仅可W有效的提高修饰电极的导电性，其大的比表面积还可W负 载更多的的银纳米粒子，运将进一步提高化?-在修饰电极上的电化学响应。
[0030] 实施例2 本实施例与实施例1的不同之处在于:硝酸银的浓度为0.0 lmM,在OV下用计时电流法电 化学沉积时间为300s。其余步骤均与实施例1相同。
[0031] 实施例3 本实施例与实施例1的不同之处在于:硝酸银的浓度为3mM，在OV下用计时电流法电化 学沉积时间为1S。其余步骤均与实施例1相同。
[0032] 实施例4 本实施例与实施例1的不同之处在于:硝酸银的浓度为2mM，在OV下用计时电流法电化 学沉积时间为20s。其余步骤均与实施例1相同。
[0033] 实施例5 本实施例与实施例1的不同之处在于:硝酸银的浓度为1.5mM，在OV下用计时电流法电 化学沉积时间为100s。其余步骤均与实施例1相同。
[0034] 实施例6本发明的修饰电极AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE对化测的线性范围 W本发明实施例1制备的修饰电极为工作电极，销柱为对电极、饱和甘隶电极为参比电 极，组成S电极体系，在化饱和的0.2M pH=7.0的憐酸盐缓冲溶液中，对不同浓度化?-进行 循环伏安扫描，电位窗设置为-0.8V-0.2V，结果参见图3。
[0035] 图3为AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE对不同浓度的〇2 ?-检测的计时电流曲线图（A、B、D、 E，图B为图A的局部放大图，图E为图D的局部放大图）、化的还原峰电流与其浓度的线性关 系图（C、F)。由图可知，对02?-检测的线性范围为7X10-ll~7.57X10-8mol/L、5.59X10-7 ~7.41X10-5mol/L，检测限为2.33X10-llmol/L。本发明与其他02?-传感器相比，检测范围 宽，检测限低，检测过程简单，灵敏度高、快速简便。
[0036] 实施例7应用本发明的修饰电极AgNPs/切s-MWCNTs/GCE对活细胞中超氧阴离子 (化?-)的电化学检测 a. 鼠肾上腺嗜铭细胞(PCl2)在湿度为95%的37°C恒溫的DMEM培养基中培育24小时，该 培养基的主要成分包括：10%热灭活的胎牛血清，lOOU/mL的青霉素，lOOmg/mL的链霉素，5% 的C〇2。将培养好的PC12细胞的培养基移除，用憐酸盐缓冲溶液洗涂S次，后加入3mL憐酸盐 缓冲溶液于待测细胞中。PC12细胞数目约为1 X IO5个/孔板； b. W本发明实施例1制备的修饰电极为工作电极、销柱为对电极、饱和甘隶电极为参 比电极，组成S电极体系，将此S电极体系共同浸入含有鼠肾上腺嗜铭细胞(PC12)的0.2M PBS(PH=7.4)中，连续滴加化M心抗坏血酸(AA)刺激PC12释放化?-，并用计时电流法进行检 ，得到修饰电极对化的计时电流曲线； C.采用origin软件作图，绘制步骤a、b所得循环伏安曲线、计时电流曲线W及化? 电流与其浓度对数、浓度之间的线性关系图。
[0037] 图4显示了 Ag化s/Cys-MWCNTs/GCE在含有1X105个鼠肾上腺嗜铭细胞(PC12)的 0.2M PBS(PH=7.4)中，通过连续滴力日IiiM抗坏血酸(AA)刺激，检测PC12释放出的化?-的计时 电流曲线图。作为对照实验，图曰，b，d分别对应着在空白0.2M PBS(pH=7.0)中滴加 IiiM AA, PC12W及在含有300U/mL SOD的PC12中滴力日化M AA的计时电流检测图。
[003引由图可知，当在空白PBS中滴加 IiiM AA(图a)或未刺激的PCm图b)时，均无明显电 流变化产生，且图b的稳态电流明显高于图曰，运可能是因为超灵敏的修饰电极可W检测到 PC12自身所产生的R0S。当连续加入化M AA刺激PC12时，电流响应明显增加（图C)。运说明 PC12在刺激下能够短时间内释放大量化?-。为了证实增加的电流响应是由刺激的PC12所释 放的化?-引起的，将300U/血超氧阴离子的特异性酶(SOD)与PC12混合，并加入化M AA刺激。 由图d可知，此时响应电流变为平缓，说明本修饰电极能够成功检测到PC12所释放的化?-， 且图d的稳态电流依旧高于空白PBS(图曰），运说明SOD酶特异性消除了细胞溶液中的化?-， 其他ROS仍然存在。运为进一步研究与化?-相关的生理学及病理学奠定了基础。
[0039]最后应说明的是：W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 W对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种无酶超氧阴离子电化学传感器的制备方法，其特征在于:是先用L-半胱氨酸对 多壁碳纳米管进行功能化，得到Cys-MWCNTs，然后采用电化学法将银纳米粒子沉积到Cys-MffCNTs修饰电极的表面得到的。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述用L-半胱氨酸对多壁碳纳米管进 行功能化的具体方法为:将纯化后的多壁碳纳米管与L-半胱氨酸分散于超纯水中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌20-28h，离心 后水洗，配成分散液;作为优选，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的加入量均为多壁碳纳米管质量的20倍。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:所述多壁碳纳米管与L-半胱氨酸的质 量比为1: 1。4. 根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于:所述采用电化学法将银纳米粒 子沉积到Cys-MffCNTs修饰电极的表面的具体方法为:将L-半胱氨酸功能化的多壁碳纳米管 分散液滴涂于预处理的裸玻碳电极，烤干后，得到L-半胱氨酸功能化多壁碳纳米管修饰的 玻碳电极;再将此修饰电极插入含有硝酸银的硝酸钾电解质溶液中，进行电化学沉积，制得 沉积有银纳米粒子的无酶超氧阴离子电化学传感器。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述电化学沉积是在OV下用计时电流法电 化学沉积l-300s;作为优选，电化学沉积200s。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述硝酸银的浓度为0.01-3mmol/L;作为 优选，浓度为lmmol/Lo7. 应用权利要求1-6任一所述的方法制备得到的无酶超氧阴离子电化学传感器。8. 权利要求7所述的无酶超氧阴离子电化学传感器在检测超氧阴离子中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述超氧阴离子为被AA刺激的PC12细胞释 放的。10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述超氧阴离子为细胞PC12直接释放的。
【文档编号】G01N27/333GK105954336SQ201610291747
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】刘秀辉, 刘岳麟, 郭志盼, 刘丹, 刘一丹, 卢小泉
【申请人】西北师范大学