基于人尿液甘氨酸、3-磷酸甘油酸和胞嘧啶的膀胱癌诊断试剂盒和检测方法

文档序号:10592561阅读:469来源:国知局
基于人尿液甘氨酸、3-磷酸甘油酸和胞嘧啶的膀胱癌诊断试剂盒和检测方法
【专利摘要】本发明涉及医学生物检测技术领域,具体是甘氨酸、3?磷酸甘油酸和胞嘧啶在制备膀胱癌诊断试剂或试剂盒中的新用途,通过本发明中的试剂及方法可以检测人尿液中氨酸、3?磷酸甘油酸和胞嘧啶的含量。本发明进一步提供了一种利用气相色谱?质谱检测尿液中甘氨酸、3?磷酸甘油酸和胞嘧啶含量的方法,可用于膀胱癌的诊断。本发明的试剂盒和检测方法简便,可靠,周期短,特异性高,易于临床推广。
【专利说明】
基于人尿液甘氨酸、3-磯酸甘油酸和胞略暗的膀脯癌诊断试 剂盒和检测方法
技术领域
[0001 ]本发明设及医学生物检测技术领域,具体地说,是基于人尿液甘氨酸、3-憐酸甘油 酸和胞喀晚的膀脫癌诊断试剂盒和诊断方法。
【背景技术】
[0002] 膀脫癌为我国也是世界范围内泌尿系统发病率最高的肿瘤。由于膀脫癌具有高发 病率、高复发率和高进展率的特点,因此,在临床工作中能够诊断早期新发膀脫癌人群并准 确评估和监测术后高危膀脫癌患者显得尤为必要。其诊断依靠尿脱落细胞和膀脫镜检查。 尿脱落细胞敏感性低;膀脫镜检属于有创操作,能够引起患者的疼痛、尿道黏膜损伤、出血、 感染等并发症,而且增加患者的痛苦和经济负担。理想的肿瘤标志物特点应该是快速、有 效、方便、安全、经济、无创伤。
[0003] 代谢组学是系统生物学中相对新兴的学科,是一个W研究细胞、组织或器官生物 代谢后产生的代谢产物为研究目的科学领域。由于代谢产物相对稳定的存在于体液内,因 此近年来内源性代谢谱分析更多的应用于肿瘤的早期诊断研究,比如前列腺癌、肝细胞癌。 在诸多恶性肿瘤中,膀脫癌是理想的运用代谢组学方法分析尿液内源性代谢谱作为早期诊 断的恶性肿瘤,因为膀脫腔内尿液直接接触病损处的肿瘤组织。另外,尿液的收集更为方 便、简单和无创。
[0004] 中国专利文献CN102323351A-种建立膀脫癌患者尿液特异性代谢物谱的方法对 尿样进行代谢谱分析,数据采用多变量数据统计软件建立数学模型,比较正常人与膀脫癌 患者代谢物谱的差异,从而确定特异性代谢物谱。该研究是采用代谢物谱识别膀脫癌患者, 操作较复杂。虽然给出了可用作诊断的潜在生物标志物,但基于生物标志物的诊断效果并 未给出,且该实验无外部验证。林云径等建立了一种衍生化与气相色谱-质谱联用相结合的 尿样代谢组分析方法,成功应用于膀脫癌患者的尿液代谢组学分析,发现4种潜在的生物标 记物:苏糖酸、乌头酸、马尿酸和D-葡萄糖(林云径等.气相色谱-质谱法分析膀脫癌患者尿 液代谢组.分析化学[J],2008,36 (9 ),1257-1260.)。然而并未给出基于运4种潜在生物标志 物的诊断效果,且无验证实验。
[0005] 基于W上研究存在的问题,本发明采用气相色谱-质谱联用的选择离子扫描方法, 该方法具有重复性好,灵敏度高,且数据匹配简单的优点。采用从发现到验证的策略筛选潜 在的诊断标志物,成功的筛选出基于人尿液甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚的膀脫癌组合 诊断标志物,该组合标志物的诊断灵敏度和特异性均良好,且该组合诊断标志物的试剂盒 目前还未见报道。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是针对膀脫癌诊断灵敏度低或具有创伤性等问题,提供一种组合的 小分子代谢物在膀脫癌诊断中的应用,同时提供了可用于上述组合的小分子代谢物的分析 检测方法。
[0007] 为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
[0008] (1)采用气相色谱-质谱联用的代谢组学技术,对正常人和膀脫癌患者的尿液进行 代谢轮廓分析,对代谢物进行筛选,筛选条件包括P值、可信的置信区间、变化倍率及AUC值 等,保留满足条件的差异代谢物。
[0009] (2)对(1)中保留的差异代谢物,采用数据统计软件SPSS,通过二元逻辑回归分析 方法,回归为组合标志物变量,采用ROCXreceiver operating characteristic)曲线来评 价组合标志物的灵敏性和特异性。
[0010] (3)组合标志物的使用:在膀脫癌患者中甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚的含量下 调。使用数据统计软件SPSS,通过二元逻辑回归分析方法,将甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀 晚回归为组合标志物变量X,二元逻辑回归方程为:
[0011] X = 1.3333-8.891* 甘氨酸 *1〇-8-4.8113* 憐酸甘油酸 *1〇-5-5.6 巧胞喀晚 *1〇-5,
[0012] p = l/(l+e_x)
[001引其中P为膀脫癌的概率,当P值大于0.6245时,诊断为膀脫癌。
[0014] (4)应用另一批独立的样本对(3)中发现的组合标志物进行验证,确定甘氨酸、3- 憐酸甘油酸和胞喀晚可作为辅助诊断膀脫癌的组合标志物;
[001引(5)诊断系统所包括的装置:色谱柱为安捷伦DB-5 MS色谱柱(30mX0.25mmX0.25 皿);检测仪器为气相色谱-质谱联用仪。
[0016] (6)确定试剂盒组成:
[0017] a.尿样前处理试剂包括:A液,15mg/mL脈酶;B液,甲醇;C液,溶于化晚的浓度为 20mg/血的甲氧胺溶;的夜,市售N-甲基-N(S甲基娃烷基)S氣乙酷胺。其中,A液的目的是去 除尿中的尿素,因为尿素含量很高,严重影响了其它代谢物的分析检测;B液是为了去除脈 酶活性,并提取尿中的代谢物;C液是对含幾基的代谢物进行目亏化反应,W防止其开环闭环; 的夜是对代谢物进行硅烷化衍生,W增加代谢物的挥发性,利于气相色谱-质谱检测。
[001引b.仪器分析条件:
[0019] 所述的气相色谱条件:参考文献报道的尿样代谢轮廓分析气相条件(Ye, G.;Zhu, B.;Yao,Z.;Yin,P.;Lu,X.;Kong,H.;Fan,F.;Jiao,B.;Xu,G.,Analysis of urinary metabolic signatures of early hepatocellular carcinoma recurrence after surgical removal using gas chromatography-mass spectrometry.J Proteome Res 2012,11(8) ,4361-72.),具体如下:DB-5 MS色谱柱(30mX0.25mmX0.25wii,Agilent Technologies, USA);柱溫采用程序升溫,70°C保持3min,W4°C/min的速度升至220°C,再W 8°C/min的速度升至300°C,保持IOmin。进样口溫度300°C,进样体积化L,分流比1: 10。W氮 气(99.9995%,化1113)作为载气,柱内流速为1.191111/111111,保持恒速模式。
[0020] 所述的质谱条件:EI源,70eV,传输线和离子源溫度分别是280°C和230°C。采用全 扫描模式采集数据(m/z 33-600)或选择离子模式采集数据,扫描速度为0.25s/scan。检测 器电压设定为为1.09kV,溶剂切除时间为5min,起始数据采集时间为5min。
[0021] 根据对尿样全扫描模式采集的数据进行处理,选择代谢物的特征离子,对样本进 行选择离子扫描采集数据,灵敏度高,重复性好,可提高数据质量。其中甘氨酸、胞喀晚、3- 憐酸甘油酸的特征离子分别是m/z 174、254、357。全扫描模式及选择离子扫描模式的总离 子流图及甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚峰,如图l(a-h)所示。
[0022] 所述气相色谱-质谱检测时,根据全扫描模式的数据对代谢物定性,将质谱图与 NISTll质谱库里甘氨酸、胞喀晚、3-憐酸甘油酸的标准质谱图进行比对,匹配程度达到70% W上时认为是甘氨酸、胞喀晚、3-憐酸甘油酸,并采用标准品验证。
[0023] (7)采用尿样样本测试本发明的应用效果。分别采用两批次的正常人和膀脫癌患 者的尿样样本,其中膀脫癌包含尿路上皮癌、膀脫肉瘤、膀脫鱗癌、膀脫腺癌、膀脫转移瘤等 恶性肿瘤。使用组合标志物正常人与膀脫癌患者可得到良好的区分:在发现阶段,其AUC值 分别为88.0 %,灵敏度78.1 %,特异度96.2 %,如图2所示;在大批样本独立验证阶段,其AUC = 0.705,灵敏度为62.0%,特异度为72.5%。
[0024] 针对W上技术方案,本发明的第一方面,提供甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚作为 诊断标志物在制备膀脫癌诊断试剂或试剂盒中的应用。
[0025] 所述的诊断试剂或试剂盒检测尿液中甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚的含量。对 检测结果赋予如下权重,Y= 1.3333-8.891*甘氨酸*l〇-S-4.8113*憐酸甘油酸*l〇-S-5.62* 胞喀晚*1〇-5,通过得到的Y值诊断膀脫癌。当Y值大于0.6245时,诊断为膀脫癌。
[0026] 所述的诊断试剂或试剂盒为采用气相色谱-质谱检测尿液中甘氨酸、3-憐酸甘油 酸和胞喀晚的含量的试剂的组合。
[0027] 所述的采用气相色谱-质谱检测尿液中甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚的含量的 试剂包括:A液,15mg/ml脈酶;B液,市售甲醇;C液,溶于化晚的浓度为20mg/mL的甲氧胺溶;D 液,市售甲基甲基-甲娃烷基=氣乙酷胺。
[0028] 所述的膀脫癌为尿路上皮癌、膀脫肉瘤、膀脫鱗癌、膀脫腺癌、膀脫转移瘤等恶性 肿瘤。
[0029] 本发明的第二方面,提供一种膀脫癌诊断试剂或试剂盒,所述的诊断试剂或试剂 盒中包括检测尿液中甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚的含量的试剂。
[0030] 所述的诊断试剂或试剂盒包括:A液,15mg/ml脈酶;B液,市售甲醇;C液,溶于化晚 的浓度为20mg/mL的甲氧胺溶;的夜,市售甲基-S甲基-甲娃烷基S氣乙酷胺。
[0031] 本发明的第=方面,提供检测尿液中甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚的含量的试 剂在制备膀脫癌诊断试剂盒中的应用。
[0032] 所述的检测尿液中甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚的含量的试剂为采用气相色 谱-质谱检测尿液中甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚的含量的试剂。所述的试剂包括:A液, 15mg/ml脈酶;B液,市售甲醇;C液,溶于化晚的浓度为20mg/mL的甲氧胺溶;的夜,市售甲基- =甲基-甲娃烷基=氣乙酷胺。
[0033] 本发明的第四方面,提供一种尿液中甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚含量的检测 方法,包括W下步骤:将尿液样品在上述A、B、C、的夜依次处理后,用气相色谱-质谱检测尿液 样品中甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚的含量。
[0034] 所述气相色谱-质谱检测时,测尿液标本差异代谢物荷质比和峰指数,将荷质比与 NIST05质谱库里标准代谢物甘氨酸、胞喀晚、3-憐酸甘油酸进行比较,匹配程度达到70% W 上时认为是甘氨酸、胞喀晚、3-憐酸甘油酸。W对应的峰指数得出含量。
[00对所述的气相色谱条件:DB-5 MS色谱柱(30mX0.25mmX0.25ym,Agilent Technologies, USA);柱溫采用程序升溫,70°C保持3min,W4°C/min的速度升至220°C,再W 8°C/min的速度升至300°C,保持IOmin。进样口溫度300°C,进样体积化L,分流比I: IO。W氮 气(99.9995%,化1113)作为载气,柱内流速为1.191111/111111,保持恒速模式。
[0036] 所述的质谱条件:EI源,70eV,传输线和离子源溫度分别是280°C和230°C。采用全 扫描模式(m/z 33-600)或选择离子模式采集数据(甘氨酸、胞喀晚、3-憐酸甘油酸的特征离 子分别是m/z 174、254、357),扫描速度为0.253/3。日11。检测器电压设定为1.09^,溶剂切除 时间为5min,起始数据采集时间为5min。
[0037] 本发明的第五方面,提供一种利用上述诊断试剂或诊断试剂盒检测膀脫癌的方 法,包括W下步骤:将尿液样品在上述A、B、C、的夜依次处理后,用气相色谱-质谱检测尿液样 品中甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚的含量,对检测结果赋予如下权重,Y=I. 3333-8.891* 甘氨酸*l〇-S-4.8113*憐酸甘油酸*l〇-S-5.62*胞喀晚*1〇-5,通过得到的Y值诊断膀脫癌。当Y 值大于0.6245时,诊断为膀脫癌。
[003引本发明优点在于:
[0039] 1、本发明采用了大量的膀脫癌临床尿液样本,并采用从发现到验证的研究策略, 为本发明的研究提供了有力的保障;
[0040] 2、本发明所采用基本检测方法是定量气相色谱-质谱技术,运一技术在现代实验 诊断学中已被证实是高灵敏度、高准确度的检测方法,采用选择离子扫描进一步提高了灵 敏度,改善了重复性,W利于发现低含量的重要代谢物。并且本发明采用的是运一技术中 AMDIS软件(automated mass spectral deconvolution and identification system,自 动解卷积软件)和化romaTOF软件及相似性捜索软件(NIST Mass Spectral Search Program Version 2.0),可W准确地对各种样品中甘氨酸,3-憐酸甘油酸和胞喀晚做定性 分析;选择离子扫描模式检测甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚,本质上是一种尿液代谢组学 的定量技术检测,具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点;
[0041] 3、本发明所设及的组合标志物包含甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚,在发现阶段, 其AUC值分别为88.0%,灵敏度78.1%,特异度95.2% ;在大批样品独立验证阶段,其AUC = 0.705,灵敏度为62.0 %,特异度为72.5%,相比于尿液脱落细胞学检测,其临床参考价值和 可信度较高。所W,本发明的检测试剂盒,可W提高膀脫癌的检出率和准确率,对于膀脫癌 的临床治疗有着重大的意义;
[0042] 4、本发明提供了一种W定量气相色谱-质谱为基础的膀脫癌检测试剂盒,可W通 过检测病人晨尿中甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚的含量所形成的峰强度来对膀脫癌做出 诊断。采用离体样本进行检测,检测方法特别简便、周期短、灵敏度高,是现行检测试剂的有 效补充。
【附图说明】
[0043] 图1尿样样本的谱图。(a)全扫描模式的总离子流图;(b)选择离子扫描模式的总离 子流图;(c-h)甘氨酸、3-憐酸甘油酸和胞喀晚分别在全扫描模式及选择离子模式的离子 峰。
[0044] 图2发现阶段(Training Phase)诊断模型;图注:Sensitivity-敏感度, Specif icit厂特异度,Cr iter ion( cut-off 值)-界值。
[0045] 图3验证阶段(Test F*hase)诊断模型;图注:Sensitivity-敏感度,Specificity- 特异度。
【具体实施方式】
[0046] 下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0047] 实施例1:
[004引取100化尿液Wl: 1比例加入浓度为本试剂盒A液(15mg/mL脈酶),用满旋混合仪震 荡混匀10秒,37°C下水浴中酶解15分钟。向上述混合液中1:4加入本试剂盒B液(甲醇),用满 旋混合仪震荡混匀30秒,在高速离屯、机中离屯、(14000巧m、15min、4°C),吸取上清液冻干。于 冻干样本中,加入50化本试剂盒C液(溶于化晚的浓度为20mg/mL的甲氧胺溶液),满旋混合 仪震荡混匀1分钟,再室溫超声15分钟,放置于37°C下水浴90分钟。然后加入本试剂盒40化 的夜(N-甲基-N-(S甲基娃烷基)S氣乙酷胺),满旋混合仪震荡混匀10秒,于37°C下水浴60 分钟。高速离屯、机离屯、(14000巧m、1 Omin、4 °C ),取上清液进样分析。
[0049] 气相色谱-质谱联用仪的条件如下:
[0050] 色谱条件:DB-5 MS色谱柱(30mX0.25mmX0.25皿,Agilent l'echnologies,USA); 柱溫采用程序升溫,70°C保持3min,W4°C/min的速度升至220°C,再W8°C/min的速度升至 300°C,保持IOmin。进样口溫度300°C,进样体积1化,分流比1:10。W氮气(99.9995%, 化ina)作为载气,柱内流速为1.19mL/min,保持恒速模式。
[0051] 质谱条件:EI源,70eV,传输线和离子源溫度分别是280°C和230°C。电子轰击能量 为70eV,扫描速度为0.25s/scan。检测器电压设定为1.09kV,溶剂切除时间为5分钟,起始数 据采集时间为5分钟。
[0052] 对尿样样本采用全扫描模式分析,质谱扫描范围的m/z在33-600,总离子流图见图 1(a)。采用自动解卷积AMDIS软件和化romaTOF软件对谱图进行处理,将质谱图与NISTll库 里标准代谢物甘氨酸、胞喀晚、3-憐酸甘油酸质谱图进行比对,匹配程度达到70% W上时认 为是甘氨酸、胞喀晚、3-憐酸甘油酸,最后采用标准品对其进行验证。并筛选出代谢物的特 征离子,建立选择离子扫描方法,总离子流图见图1 (b),该方法灵敏度高,重复性好,有利于 低含量的代谢物。其中甘氨酸、胞喀晚、3-憐酸甘油酸的特征离子分别是m/z 174、254、357, 在全扫描模式分析时胞喀晚与3-憐酸甘油酸峰均低于定量限(信噪比小于10),检测困难, 而采用选择离子模式分析,使其灵敏度分别提高了 19.0、10.9、18.9倍,从而实现准确定量 分析,峰形也得到很大改善,具体见图1 (c-h)。
[0化3]实施例2:
[0054]尿样样品收集采集前,纳入志愿者签署知情同意书。
[00对留取膀脫癌患者他例)和正常人(21例)的晨尿,取100化尿液Wl: 1比例加入浓度 为本试剂盒A液(15mg/mL脈酶),用满旋混合仪震荡混匀10秒,37°C下水浴中酶解15分钟。向 上述混合液中1:4加入本试剂盒B液(甲醇),用满旋混合仪震荡混匀30秒,在高速离屯、机中 离屯、(14000巧m、15min、4°C),吸取上清液冻干。于冻干样本中,加入50化本试剂盒C液(溶于 化晚的浓度为20mg/mL的甲氧胺溶液),满旋混合仪震荡混匀1分钟,再室溫超声15分钟,放 置于37°C下水浴90分钟。然后加入本试剂盒40化的夜(N-甲基-N-(S甲基娃烷基)S氣乙酷 胺),满旋混合仪震荡混匀10秒,于37°C下水浴60分钟。高速离屯、机离屯、(14000巧m、10min、4 °C),取上清液进样分析。
[0056] 气相色谱-质谱联用仪的条件如下:
[0057] 色谱条件:DB-5 MS色谱柱(30mX0.25mmX0.25皿,Agilent l'echnologies,USA); 柱溫采用程序升溫,70°C保持3min,W4°C/min的速度升至220°C,再W8°C/min的速度升至 300°C,保持IOmin。进样口溫度300°C,进样体积1化,分流比1:10。W氮气(99.9995%, 化ina)作为载气,柱内流速为1.19mL/min,保持恒速模式。
[005引质谱条件:EI源,70eV,传输线和离子源溫度分别是280°C和230°C。电子轰击能量 为70eV,采用选择离子模式扫描(甘氨酸、胞喀晚、3-憐酸甘油酸的特征离子分别是m/z 174、254、357),扫描速度为0.253/3。日11。检测器电压设定为1.09^,溶剂切除时间为5分钟, 起始数据采集时间为5分钟。
[0059] 用本试剂盒处理尿样并通过气相色谱-质谱联用仪分析,对原始数据总面积归一 化后进行单变量分析,发现32例膀脫癌患者与21例健康人的尿液中共有101个代谢物存在 显著性差异,剔除具有消极置信区间的代谢物后剩余75个差异代谢物(p<0.05);进一步筛 选变化倍率大于1.4或小于0.714的,共有34个差异代谢物;再采用统计分析软件SPSS,筛选 单个代谢物的AUC值大于0.7的,共有22个差异代谢物;最后对保留的22个差异代谢物进行 二元逻辑回归分析,最终筛选出甘氨酸、胞喀晚、3-憐酸甘油酸组合的变量X值,回归方程如 下:
[0060] X = 1.3333-8.891* 甘氨酸 *10-8-4.8113* 憐酸甘油酸 *10-5-5.6 巧胞喀晚 *1〇-5 [0061 ] p = l/a+e_x)
[0062] 其中P为膀脫癌的概率,当P值大于0.6245时,诊断为膀脫癌。该组合标志物可W用 于区别膀脫癌患者群和健康人群,诊断效果见表1。
[0063] 表 1
[0065] 为验证上述应用,本发明重新收集了79例膀脫癌患者与51例健康人的尿液,经过 样本预处理,用本试剂盒测定甘氨酸、胞喀晚W及3-憐酸甘油酸含量后,通过前述的计算方 法,验证P值诊断膀脫癌的效果。结果提示采用本发明试剂盒及应用方法,甘氨酸、胞喀晚W 及3-憐酸甘油酸的组合标志物诊断膀脫癌的诊断曲线AUC = O.705,灵敏度为62.0%,特异 度为72.5%,阳性预测值77.8%和阴性预测值55.2%,具体见表2,明显优于现有的尿脱落 细胞学膀脫癌诊断方法。
[0066] 表 2 「nnA7l

[006引实施例3
[0069] -位健康人59岁男性,采用本发明的试剂和检测方法得到的Y值是0.3974,小于 0.6245;-位血尿患者76岁男性,采用本发明的试剂和检测方法得到的Y值是1.1184,怀疑 为膀脫癌,行膀脫镜检查并做病理组织学检查后证实为膀脫尿路上皮癌,与Y值得到的验证 一致。
[0070] W上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述 实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的 变型或替换,运些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 甘氨酸、3-磷酸甘油酸和胞嘧啶在制备膀胱癌诊断试剂或试剂盒中的应用。2. 根据权利要求1所述的甘氨酸、3-磷酸甘油酸和胞嘧啶在制备膀胱癌诊断试剂或试 剂盒中的应用,其特征在于,所述的诊断试剂或试剂盒检测尿液中甘氨酸、3-磷酸甘油酸和 胞嘧啶的含量。3. 根据权利要求1所述的甘氨酸、3-磷酸甘油酸和胞嘧啶在制备膀胱癌诊断试剂或试 剂盒中的应用,其特征在于,所述的诊断试剂或试剂盒为采用气相色谱-质谱检测尿液中甘 氨酸、3-磷酸甘油酸和胞嘧啶的含量的试剂的组合。4. 根据权利要求3所述的甘氨酸、3-磷酸甘油酸和胞嘧啶在制备膀胱癌诊断试剂或试 剂盒中的应用,其特征在于,所述的采用气相色谱-质谱检测尿液中甘氨酸、3-磷酸甘油酸 和胞嘧啶的含量的试剂包括:A液,15mg/mL脲酶;B液,甲醇;C液,溶于吡啶的浓度为20mg/mL 的甲氧胺溶;D液,N-甲基-N(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。5. 根据权利要求1-4任一所述的甘氨酸、3-磷酸甘油酸和胞嘧啶在制备膀胱癌诊断试 剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的膀胱癌为尿路上皮癌、膀胱肉瘤、膀胱鳞癌、膀胱 腺癌、膀胱转移瘤等恶性肿瘤。6. -种膀胱癌诊断试剂或试剂盒,其特征在于,所述的诊断试剂或试剂盒包括检测尿 液中甘氨酸、3_磷酸甘油酸和胞嘧啶的含量的试剂。7. 根据权利要求6所述的一种膀胱癌诊断试剂或试剂盒,其特征在于,所述的诊断试剂 或试剂盒包括:A液,15mg/mL脲酶;B液,甲醇;C液,溶于吡啶的浓度为20mg/mL的甲氧胺溶;D 液,N-甲基-N(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。8. 检测尿液中甘氨酸、3-磷酸甘油酸和胞嘧啶的含量的试剂在制备膀胱癌诊断试剂盒 中的应用。9. 一种尿液中甘氨酸、3-磷酸甘油酸和胞嘧啶含量的检测方法,包括以下步骤:将尿液 样品在A、B、C、D液依次处理后,用气相色谱-质谱检测尿液样品中甘氨酸、3-磷酸甘油酸和 胞嘧啶的含量; 其中,A液,15mg/mL脲酶;B液,甲醇;C液,溶于吡啶的浓度为20mg/mL的甲氧胺溶;D液, N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。10. 根据权利要求9所述的一种尿液中甘氨酸、3-磷酸甘油酸和胞嘧啶含量的检测方 法,其特征在于,所述的气相色谱条件:DB-5MS色谱柱;柱温采用程序升温,70 °C保持3min, 以4°C/min的速度升至220°C,再以8°C/min的速度升至300°C,保持IOmin;进样口温度300 °C,进样体积lyL,分流比1:10;以氦气作为载气,柱内流速为1.19ml/min,保持恒速模式; 所述的质谱条件:EI源,70eV,传输线和离子源温度分别是280°C和230°C。采用全扫描 模式m/z 33-600,或选择离子模式采集数据,甘氨酸、胞嘧啶、3-磷酸甘油酸的特征离子分 别是m/z 174、254、357,扫描速度为0.258/8(^11;检测器电压设定为1.091^,溶剂切除时间 为5min,起始数据采集时间为5min。
【文档编号】G01N30/02GK105954389SQ201610257966
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】许传亮, 许国旺, 宋瑞祥, 周洋, 马重, 路鑫, 曾蜀雄, 赵欣婕, 张振声, 尹沛源, 孙颖浩
【申请人】中国人民解放军第二军医大学, 中国科学院大连化学物理研究所
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