一种中药中赭曲霉毒素的高效液相色谱-荧光检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种中药中赭曲霉毒素的高效液相色谱?荧光检测方法，包括粉碎、溶解、提取、纯化和高效液相色谱?荧光检测步骤。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述高效液相色谱?荧光检测方法能够准确检测出中药中赭曲霉毒素的含量；(2)本发明所述高效液相色谱?荧光检测方法专一性强、灵敏度高、可操作性好。
【专利说明】
-种中药中赫曲霉毒素的高效液相色谱-黄光检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于分析化学领域，设及真菌毒素的检测，尤其设及一种中药中髓曲霉毒 素的高效液相色谱-巧光检测方法。
【背景技术】
[0002] 髓曲霉毒素是一组结构类似的真菌毒素，有014、018、01'(：、(^0四种化合物，其中分 布最广、产毒量最高、毒性最大、与人类健康关系最密切，且对农作物的污染最严重的是髓 曲霉毒素 AdOTA的分子量为403.8,烙点为169°C，为无色晶体，易溶于极性有机溶剂和稀碳 酸氨钢溶液，微溶于水。在紫外光下的OTA呈绿色巧光，最大吸收波长为332nm.该化合物相 当稳定，一般的烹调和加工方法只有部分破坏。
[0003] OTA首先是在玉米中发现，W后又相继从谷物和大豆中检出。粮谷类、水果、酒类、 咖啡、调味料及中草药等多种植物产品和食品均可被OTA污染。OTA主要是由髓曲霉、纯绿青 霉、炭黑霉运=种真菌所产生的次生代谢产物。研究发现，运=种产毒真菌生长繁殖所需的 生态环境、污染农作物的种类、W及污染率等情况，依地域的不同而异。在热带和亚热带地 区，农作物在田间和储存过程中污染的OTA主要是由髓曲霉产生;在加拿大等寒冷地区，粮 食及其制品中的OTA主要来源于纯绿青霉;炭黑霉则W侵染水果为主，是新鲜葡萄、葡萄干、 葡萄酒和咖啡中的OTA的主要产菌。另外，动物饲料中的OTA的污染也很严重，动物进食被 OTA污染的饲料后导致体内的OTA的蓄积，而且不易被代谢降解，因此动物性食品，尤其是猪 的肾脏、肝脏、肌肉、血液W及如和乳制品中常有OTA检出，随后又通过食物链对人类健康构 成威胁。
[0004] 用于检测OTA的方法有很多，概括起来有生物鉴定法、化学分析法、免疫分析法和 仪器分析法等。生物鉴定法是利用真菌毒素能影响微生物、水生动物、家禽等生物体的细胞 代谢来鉴定真菌毒素的存在。其方法专一性差、灵敏度低、一般只作为化学分析法的佐证。 OTA的化学分析法主要是薄层色谱法，该方法应用范围广，易普及但结果不精确。免疫分析 法W抗原抗体免疫学反应为基础，该方法具有高度特异性、灵敏性和快速简便等优点，但 OTA属于半抗原，抗原性弱，因而检测结果难判断。
【发明内容】
[0005] 本发明解决的技术问题是:为了克服上述现有技术的缺陷，获得一种专一性强、灵 敏度高、可操作性好的中药中髓曲霉毒素检测方法，本发明提供了一种中药中髓曲霉毒素 的高效液相色谱-巧光检测方法。
[0006] 技术方案：一种中药中髓曲霉毒素的高效液相色谱-巧光检测方法，包含W下步 骤：
[0007] (1)将中药样品加入粉碎机中，功率为1.4~2. IkW/h、转速为2600~3200转/分钟、 每小时投入饮片量为3~化g，粉碎研磨至粉状，粉末粒径为200~400目；
[000引（2)将步骤（1)获得的粉末与甲醇溶液按1~2:10混合，其中甲醇溶液为甲醇与水 按体积比7~9:2混合，超声提取28~35分钟;采用玻璃纤维滤纸过滤提取液；
[0009] (3)将步骤(2)获得的提取液在36~42°C条件下减压旋蒸15~30分钟，再加入双蒸 水稀释至澄清状;采用免疫亲和柱纯化，其中洗脱液为甲醇，收集洗脱液后在45~52°C条件 下吹干，用乙腊定容至
[0010] (4)采用高效液相色谱测定步骤（3)获得的溶液，其中流动相为体积分数为16~ 21 %的乙酸乙腊溶液，柱溫为32~36°C，激发波长为332皿，发射波长为465nm，进样体积为 15~2姐Ld
[0011] 优选的，步骤（1)中将中药样品加入粉碎机中，功率为1. SkWA、转速为2900转/分 钟、每小时投入饮片量为4kg，粉碎研磨至粉状，粉末粒径为300目；
[0012] 优选的，步骤(2)中将步骤（1)获得的粉末与甲醇溶液按1.5:10混合，其中甲醇溶 液为甲醇与水按体积比9:2混合，超声提取32分钟;采用玻璃纤维滤纸过滤提取液。
[0013] 优选的，步骤(3)中将步骤(2)获得的提取液在38°C条件下减压旋蒸26分钟，再加 入双蒸水稀释至澄清状;采用免疫亲和柱纯化，其中洗脱液为甲醇，收集洗脱液后在48 °C条 件下吹干，用乙腊定容至2mL。
[0014] 优选的，步骤(4)中采用高效液相色谱测定步骤(3)获得的溶液，其中流动相为体 积分数为19%的乙酸乙腊溶液，柱溫为34°C，激发波长为332nm，发射波长为465nm，进样体 积为20化。
[0015] 有益效果：（1)本发明所述高效液相色谱-巧光检测方法能够准确检测出中药中髓 曲霉毒素的含量；（2)本发明所述高效液相色谱-巧光检测方法专一性强、灵敏度高、可操作 性好。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1
[0017] -种中药中髓曲霉毒素的高效液相色谱-巧光检现巧法，包含W下步骤：
[001引（1)将中药样品加入粉碎机中，功率为1.4kW/h、转速为2600转/分钟、每小时投入 饮片量为3kg，粉碎研磨至粉状，粉末粒径为200目；
[0019] (2)将步骤(1)获得的粉末与甲醇溶液按1:10混合，其中甲醇溶液为甲醇与水按体 积比7:2混合，超声提取28分钟;采用玻璃纤维滤纸过滤提取液；
[0020] (3)将步骤(2)获得的提取液在36°C条件下减压旋蒸15分钟，再加入双蒸水稀释至 澄清状;采用免疫亲和柱纯化，其中洗脱液为甲醇，收集洗脱液后在45°C条件下吹干，用乙 腊定容至2ni;
[0021] (4)采用高效液相色谱测定步骤(3)获得的溶液，其中流动相为体积分数为16%的 乙酸乙腊溶液，柱溫为32°C，激发波长为332nm，发射波长为465nm，进样体积为15化。
[0022] 实施例2
[0023] -种中药中髓曲霉毒素的高效液相色谱-巧光检测方法，包含W下步骤：
[0024] (1)将中药样品加入粉碎机中，功率为l.SkW/h、转速为2900转/分钟、每小时投入 饮片量为4kg，粉碎研磨至粉状，粉末粒径为300目；
[0025] (2)将步骤(1)获得的粉末与甲醇溶液按1.5:10混合，其中甲醇溶液为甲醇与水按 体积比9:2混合，超声提取32分钟;采用玻璃纤维滤纸过滤提取液；
[0026] (3)将步骤(2)获得的提取液在38°C条件下减压旋蒸26分钟，再加入双蒸水稀释至 澄清状;采用免疫亲和柱纯化，其中洗脱液为甲醇，收集洗脱液后在48°C条件下吹干，用乙 腊定容至2ni;
[0027] (4)采用高效液相色谱测定步骤(3)获得的溶液，其中流动相为体积分数为19%的 乙酸乙腊溶液，柱溫为34°C，激发波长为332nm，发射波长为465nm，进样体积为20化。
[0028] 实施例3
[0029] -种中药中髓曲霉毒素的高效液相色谱-巧光检测方法，包含W下步骤：
[0030] (1)将中药样品加入粉碎机中，功率为2. IkW/h、转速为3200转/分钟、每小时投入 饮片量为化g，粉碎研磨至粉状，粉末粒径为400目；
[0031] (2)将步骤(1)获得的粉末与甲醇溶液按2:10混合，其中甲醇溶液为甲醇与水按体 积比9:2混合，超声提取35分钟;采用玻璃纤维滤纸过滤提取液；
[0032] (3)将步骤(2)获得的提取液在42°C条件下减压旋蒸30分钟，再加入双蒸水稀释至 澄清状;采用免疫亲和柱纯化，其中洗脱液为甲醇，收集洗脱液后在52°C条件下吹干，用乙 腊定容至2ni;
[0033] (4)采用高效液相色谱测定步骤(3)获得的溶液，其中流动相为体积分数为21%的 乙酸乙腊溶液，柱溫为36°C，激发波长为332nm，发射波长为465nm，进样体积为2如L。
[0034] 采用实施例1~3所述的检测方法对中药中髓曲霉毒素进行检测，结果如下表所 示：
[0035]
【主权项】
1. 一种中药中赭曲霉毒素的高效液相色谱-荧光检测方法，其特征在于，包含以下步 骤： (1) 将中药样品加入粉碎机中，功率为1.4~2. lkW/h、转速为2600~3200转/分钟、每小 时投入饮片量为3~5kg，粉碎研磨至粉状，粉末粒径为200~400目； (2) 将步骤（1)获得的粉末与甲醇溶液按1~2:10混合，其中甲醇溶液为甲醇与水按体 积比7~9:2混合，超声提取28~35分钟;采用玻璃纤维滤纸过滤提取液； (3) 将步骤(2)获得的提取液在36~42°C条件下减压旋蒸15~30分钟，再加入双蒸水稀 释至澄清状;采用免疫亲和柱纯化，其中洗脱液为甲醇，收集洗脱液后在45~52°C条件下吹 干，用乙腈定容至2mL; (4) 采用高效液相色谱测定步骤(3)获得的溶液，其中流动相为体积分数为16~21%的 乙酸乙腈溶液，柱温为32~36°C，激发波长为332nm，发射波长为465nm，进样体积为15~25μ L02. 根据权利要求1所述的中药中赭曲霉毒素的高效液相色谱-荧光检测方法，其特征在 于，步骤(1)中将中药样品加入粉碎机中，功率为1.8kW/h、转速为2900转/分钟、每小时投入 饮片量为4kg，粉碎研磨至粉状，粉末粒径为300目。3. 根据权利要求1所述的中药中赭曲霉毒素的高效液相色谱-荧光检测方法，其特征在 于，步骤(2)中将步骤（1)获得的粉末与甲醇溶液按1.5:10混合，其中甲醇溶液为甲醇与水 按体积比9:2混合，超声提取32分钟;采用玻璃纤维滤纸过滤提取液。4. 根据权利要求1所述的中药中赭曲霉毒素的高效液相色谱-荧光检测方法，其特征在 于，步骤(3)中将步骤(2)获得的提取液在38°C条件下减压旋蒸26分钟，再加入双蒸水稀释 至澄清状;采用免疫亲和柱纯化，其中洗脱液为甲醇，收集洗脱液后在48°C条件下吹干，用 乙腈定容至2mL。5. 根据权利要求1所述的中药中赭曲霉毒素的高效液相色谱-荧光检测方法，其特征在 于，步骤(4)中采用高效液相色谱测定步骤(3)获得的溶液，其中流动相为体积分数为19% 的乙酸乙腈溶液，柱温为34°C，激发波长为332nm，发射波长为465nm，进样体积为20yL〇
【文档编号】G01N30/06GK105954410SQ201610272251
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】李建华
【申请人】苏州市天灵中药饮片有限公司