牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法
【专利摘要】一种牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征在于：采用正己烷/氢氧化钠水溶液体系将牛肝菌中的烟碱提取出来后，再经过阳离子交换固相萃取对萃取液进行净化，并采用配有毛细管色谱柱的气相色谱仪将烟碱和萃取液中的其他杂质分开，利用气相色谱—同位素质谱仪GC?IRMS分析牛肝菌中烟碱的碳稳定同位素比值δ13C，氢稳定同位素比值δD和氮稳定同位素比值δ15N，再根据烟碱同位素标准物质中的δ12C、δD和δ15N测定值，校准计算牛肝菌中烟碱的δ12C、δD和δ15N值。本发明利用GC?IRMS技术，实现了牛肝菌中烟碱的碳、氢、氮稳定同位素比值的准确测定，为相关产品中烟碱的溯源提供了技术支持和科学依据。
【专利说明】
牛肝菌中烟碱碳、氨、氮稳定同位素比值的测定方法
技术领域
[0001] 本发明属于稳定同位素分析技术领域，具体设及一种牛肝菌中烟碱碳、氨、氮稳定 同位素比值的测定方法。
【背景技术】
[0002] 当前，判定市售烟草提取物及不同纯度烟碱中烟碱的来源，具有重要的意义。除烟 草外，牛肝菌等作物也含有烟碱，虽然牛肝菌的烟碱含量相对很低，但与其他茄科类植物相 比，其烟碱含量相对较高，所W，牛肝菌是自然界中烟碱的重要来源之一。当前，许多市售戒 烟产品、电子烟、保健产品等都含有烟碱，但是，对于其中烟碱的来源，尚无统一定论。所W， 烟碱溯源技术的开发，具有重要的理论及现实意义。
[0003] 在产品品种、产地等溯源的方法中，稳定同位素技术是一项相对高效的分析手段。 由于生物体内的同位素组成受气候，环境和生物代谢类型等因素的影响，不同种类及不同 地域来源的食品原料中同位素自然丰度存在差异，利用运种差异可W对不同种类及来源的 产品进行溯源(林光辉，稳定同位素生态学.高等教育出版社，2013)。但是，目前尚未见牛 肝菌中烟碱碳、氨、氮稳定同位素比值的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的正是基于上述技术空白，建立了一种牛肝菌中烟碱碳、氨、氮稳定同 位素比值的测定方法。本方法通过液液萃取、固相萃取等过程对牛肝菌中的烟碱进行提取、 浓缩和净化，且一次样品前处理过程即可同时测定牛肝菌中烟碱的碳、氨、氮稳定同位素比 值。
[0005] 本发明的目的是通过W下技术方案来实现的：一种牛肝菌中烟碱碳、氨、氮稳定同 位素比值的测定方法，采用正己烧/氨氧化钢水溶液体系将牛肝菌中的烟碱提取出来后，再 经过阳离子交换固相萃取对萃取液进行净化，并采用配有毛细管色谱柱的气相色谱仪将烟 碱和萃取液中的其他杂质分开，利用气相色谱一同位素质谱仪GC-IRMS分析牛肝菌中烟碱 的碳稳定同位素比值81化，氨稳定同位素比值如和氮稳定同位素比值Si5N,再根据烟碱同位 素标准物质中的Si化、如和Si5N测定值，校准计算牛肝菌中烟碱的51化、如和Si5N值。
[0006] 其具体步骤如下： (1) 牛肝菌中的烟碱的提取、浓缩与净化:采用正己烧/氨氧化钢水溶液体系将牛肝菌 中的烟碱提取出来后，再经过阳离子交换固相萃取对烟碱进行净化； (2) 采用带有毛细管气相色谱柱的气相色谱仪将烟碱与萃取液中的其他杂质分开； (3) 用在线燃烧装置将烟碱中的C转化成C〇2,将烟碱中的N转化成的，用同位素质谱仪 (IRM^测定烟碱产生C〇2中的扣化和化中的8?值； (4) 将在线燃烧装置切换为热转化模式，用同位素质谱仪(IRMS)测定烟碱产生也中的5 D值(即 S2h)。
[0007] (5)通过标准物质已标定的扣化，如和^5N值，得到牛肝菌中烟碱的如化，如和S15n 值。
[000引步骤(1)中的提取与净化过程如下： 提取:称取约5 g牛肝菌样品，置于50 mL离屯、管中，分别加入30 mL 1%氨氧化钢水溶液 和5 mL正己烧，2000巧m下满旋10 min后，在10000巧m下离屯、2 min,将上层有机相转移至 另一个50 mL离屯、管中，再W5 mL正己烧萃取两次，合并有机相； 浓缩、净化：用甲酸将有机相的抑值调至3-4,然后在40°C下将其氮吹浓缩近干，加入3 ml 2%甲酸水溶液溶解残渣后，使用阳离子交换固相萃取小柱(60 mg，Waters Oasis MCX) 进行净化处理，其步骤为：萃取柱使用前分别用3 mL甲醇、3 mL水和3 ml 2%甲酸水溶液活 化，之后将待净化溶液转移至柱中，依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，然后用10 mL 5%氨化甲 醇洗脱，收集洗脱液;洗脱液用甲酸调pH值至3-4，40°C下氮吹浓缩近干，残渣用5%氨氧化钢 水溶液调抑值至碱性，加入1.5 mL二氯甲烧，在2000巧m下满旋2 min后，WlOOOO rpm离屯、 1 min,再取有机相进行GC-IRMS分析。
[0009]所述方法的仪器分析条件为： (1) 气相色谱条件： 色谱柱：中等极性毛细管色谱柱（30 m X 0.32 mm X 0.25 Ml);检测器溫度：250 °(：;进样口溫度:250 °(：;载气：氮气(纯度>99.999%)，恒流流速:2.0血/111111;进样量：1^ L，不分流进样;升溫程序:初始溫度80 °C，保持1 min, W15 TVmin的速率至260 °C，保持6 min. (2) 燃烧转化装置条件： 测定Si3C或Si5N:使用氧化燃烧管，设置溫度为looor。管内填装儀/氧化儀（Ni/NiO)， 氧化儀作弱氧化剂，将样品中的C氧化成C〇2，将样品中N氧化成NxOy，同时，氧化儀转化为儀 单质，充入化可再生氧化儀，另外，儀单质可作特殊还原剂，将NxOy转化为化，样品最终反应 生成C〇2和化。氧化燃烧管使用前应注入化一个小时用于氧化管的再生。
[0010]巧憶Si5N,需使用液氮冷阱冻结除去C〇2高凝固点气体，防止C〇2进入离子源打出碎 片离子[CO+ ] m/z 28，29对[化+ ]m/z 28，29造成干扰。
[0011] 测定如:使用高溫裂解管，设置溫度为1450°c。高溫裂解管使用前应注入CH4-个 小时用于反应管涂炭。
[0012] (3)质谱条件为： 离子源真空为1.8x 1〇-6 HiBar，电压3.04 kV，电流1.50 mA。
[0013] 本方法通过液液萃取、阳离子交换固相萃取等步骤对牛肝菌中的烟碱进行提取、浓缩 和净化，且一次样品前处理过程即可同时测定牛肝菌中烟碱的碳、氨、氮稳定同位素比值， 具有效率高、重复性好的优点，为烟草提取物中烟碱的溯源提供了技术支持和科学依据。
【附图说明】
[0014] 图1为GC-IRMS测定标准溶液烟碱中Si3C的离子流图谱，其中上图纵坐标是比率 (Ratio)，下图纵坐标是强度（Intensity [mV]); 图2为GC-IRMS测定标准溶液烟碱中Si5N的离子流图谱，其中上图纵坐标是比率 (Ratio)，下图纵坐标是强度（Intensity [mV]); 图3为GC-IRMS测定标准溶液烟碱中如的离子流图谱，其中上图纵坐标是比率(Ratio)， 下图纵坐标是强度（Intensity [mV])。
【具体实施方式】
[0015] 本发明通过W下具体实施例作进一步描述，但不限制本发明。
[0016] 实施例1: 1、仪器及试剂 同位素质谱仪(AS1310自动进样器，Trace GC叫tra气相色谱仪，GC IsoLink燃烧与热 转化装置(燃烧装置用来测定烟碱中的碳和氮，热转化装置用来测定烟碱中的氨）,Delta V Advantage稳定同位素比质谱仪。美国Hiermo Fisher公司）；AE163电子天平（感量：0.0 OOl g，瑞±Mettler公司）;全自动氮吹仪(型号:JTZD-DCY12S，杭州聚同电子有限公司）；高速粉 碎机（武汉银彩科技有限公司）；縱满振荡器（美国Coleparmer Votex-Genie);高速台式冷 冻型离屯、机(德国SIGMA 3-30K);高纯氮气(99.999%，载气）;烟碱标准物质来自于美国印第 安纳大学同位素实验室，#2(51化=7.72±0.02%。，515片-5.94±0.15°/〇。），#3(51化=-30.05 ±0.02%〇,5^=-33.62±0.18%〇),#4(51? =-2.06±0.02%〇,5^=-15.49±0,13%〇) ,#5(5 "C 二-29.63 ±0.01%〇，沪片一6.03 ±0.04%〇，如=-161.30 ± 1.7%〇);正己烧（色谱纯，美国 T抓IA公司）；氨氧化钢(分析纯，国药集团）；超纯水(Milli-Q Integral超纯水系统制）；阳 离子交换固相萃取小柱(60 mg ,Waters Oasis MCX)。
[0017] 2、样品前处理 (1) 将牛肝菌样品置于40吧烘箱中，1小时后取出，粉碎后过0.45毫米孔径标准筛； (2) 称取约5 g牛肝菌样品，置于50 mL离屯、管中，分别加入30 mL 1%氨氧化钢水溶液和 5血正己烧，2000巧m下满旋10 min后，在10000 rpm下离屯、2 min,将上层有机相转移至另 一个50 mL离屯、管中，再W5 mL正己烧萃取两次，合并有机相。
[001引（3)用甲酸将有机相的抑值调至3-4,然后在40°C下将其氮吹浓缩近干，加入3 ml 2%甲酸水溶液溶解残渣后，使用阳离子交换固相萃取小柱(60 mg，Waters Oasis MCX)进行 净化处理，其步骤为:萃取柱使用前分别用3 mL甲醇、3 mL水和3 ml 2%甲酸水溶液活化，之 后将待净化溶液转移至柱中，依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，然后用10 ml 5%氨化甲醇洗 脱，收集洗脱液;洗脱液用甲酸调pH值至3-4，40°C下氮吹浓缩近干，残渣用5%氨氧化钢水溶 液调pH值至碱性，加入1.5 mL二氯甲烧，在2000 rpm下满旋2 min后，W10000 rpm离屯、1 min，再取有机相进行GC-IRMS分析。
[0019] 本案中的%若无特别说明，均为质量％。
[0020] 3、仪器分析条件 (1) 气相色谱条件： 色谱柱：中等极性毛细管色谱柱（30 m X 0.32 mm X 0.25 Ml);检测器溫度：250 °(：;进样口溫度:250 °(：;载气：氮气(纯度>99.999%)，恒流流速:2.0血/111111;进样量：1^ 1，分流比：10:1;升溫程序:初始溫度80°(：，保持1111111，^15°(：/111111的速率至260°(：，保持 6 min. (2) 燃烧转化装置条件： 测定Si3C或Si5N:使用氧化燃烧管，设置溫度为looor。管内填装儀/氧化儀（Ni/NiO)， 氧化儀作弱氧化剂，将样品中的C氧化成C〇2，将样品中N氧化成NxOy，同时，氧化儀转化为儀 单质，充入化可再生氧化儀，另外，儀单质可作特殊还原剂，将NxOy转化为化，样品最终反应 生成C〇2和化。氧化燃烧管使用前应注入化一个小时用于氧化管的再生。
[0021] 测定Si5N,需使用液氮冷阱冻结除去C〇2高凝固点气体，防止C〇2进入离子源打出碎 片离子[CO+ ] m/z 28，29对[化+ ]m/z 28，29造成干扰。
[0022] 测定如:使用高溫裂解管，设置溫度为1450°C。高溫裂解管使用前应注入CH4-个 小时用于反应管涂炭。
[0023] (3)质谱条件为： 离子源真空为1.8x 1〇-6 HiBar，电压3.04 kV，电流1.50 mA。
[0024] 4、精密度测定 将牛肝菌样品稀释萃取后，通过本发明所述GC-IRMS技术重复测定牛肝菌中烟碱的5 1化，如和Si5N值(n = 6)，测定结果的相对标准偏差(RSD)分别为1.16%，0.36%和1.02%(表 1)，测定精度均能达到要求。
[0025] 表1.牛肝菌中烟碱C、H、N立种元素稳定同位素比值的精密度测定
根据上述GC-IRMS测定方法，测得牛肝菌样品中烟碱的51化，如和Si5N分别为-30.82、- 215.60和-9.54。
【主权项】
1. 一种牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征在于:采用正己烷/ 氢氧化钠水溶液体系将牛肝菌中的烟碱提取出来后，再经过阳离子交换固相萃取对萃取液 进行净化，并采用配有毛细管色谱柱的气相色谱仪将烟碱与萃取液中的其他杂质分开，利 用气相色谱一同位素质谱仪GC-IRMS分析牛肝菌中烟碱的碳稳定同位素比值δ 13(：，氢稳定同 位素比值SD和氮稳定同位素比值δ15Ν，再根据烟碱同位素标准物质中的S 12CjD和δ15Ν测定 值，校准计算牛肝菌中烟碱的S12CjD和δ 15Ν值。2. 根据权利要求1所述的牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征 在于:该方法的具体步骤如下： (1) 牛肝菌中的烟碱的提取、浓缩与净化:采用正己烷/氢氧化钠水溶液体系将牛肝菌 中的烟碱提取出来后，再经过阳离子交换固相萃取对烟碱进行净化； (2) 采用带有毛细管气相色谱柱的气相色谱仪将烟碱与萃取液中的其他杂质分开； (3) 用在线燃烧装置将烟碱中的C转化成C02,将烟碱中的N转化成Ν2,用同位素质谱仪 (IRMS)测定烟碱产生CO 2中的S13C和N2中的δ15Ν值； (4) 将在线燃烧装置切换为热转化模式，用同位素质谱仪IRMS测定烟碱产生H2中的δ? 值； (5) 通过标准物质已标定的S13CJD和δ15Ν值，得到牛肝菌中烟碱的S13CJD和δ 15Ν值。3. 根据权利要求1所述的牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征 在于:步骤(1)中的提取与净化过程如下： 提取:称取5 g牛肝菌样品，置于50 mL离心管中，分别加入30 mL 1%氢氧化钠水溶液和 5 mL正己烧，2000 rpm下祸旋10 min后，在10000 rpm下离心2 min，将上层有机相转移至另 一个50 mL离心管中，再以5 mL正己烷萃取两次，合并有机相； 浓缩、净化：用甲酸将有机相的pH值调至3-4,然后在40°C下将其氮吹浓缩近干，加入3 mL 2%甲酸水溶液溶解残渣后，使用阳离子交换固相萃取小柱进行净化处理，其步骤为:萃 取柱使用前分别用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 2%甲酸水溶液活化，之后将待净化溶液转移至 柱中，依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，然后用10 mL 5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液;洗脱液 用甲酸调pH值至3-4，40 °C下氮吹浓缩近干，残渣用5%氢氧化钠水溶液调pH值至碱性，加入 1.5 mL二氯甲烧，在2000 rpm下祸旋2 min后，以10000 rpm离心I min，再取有机相进行GC-IRMS分析。4. 根据权利要求2所述的牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征 在于:步骤(2)中的气相色谱条件为： 色谱柱：中等极性毛细管色谱柱，规格30 m X 0.32 mm X 0.25 μπι;检测器温度:250 °C;进样口温度:250 °C;载气:氮气，恒流流速:2.0 mL/min;进样量:1 yL，分流比：10:1，测 定δ?和δ15Ν时采用不分流模式;升温程序:初始温度80 °C，保持I min，以15 °C/min的速率 至260 °C，保持6 min。5. 根据权利要求2所述的牛肝菌中烟碱碳、氢、氮稳定同位素比值的测定方法，其特征 在于:步骤(3)、（4)所用的在线燃烧装置条件为： 测定S13C或δ15Ν:使用氧化燃烧管，设置温度为1000°C，管内填装镍/氧化镍（Ni/NiO)， 氧化镍作弱氧化剂，将样品中的C氧化成CO2，将样品中N氧化成NxOy，同时，氧化镍转化为镍 单质，充入O 2可再生氧化镍，另外，镍单质可作特殊还原剂，将NxOy转化为N2，样品最终反应 生成CO2和N2，氧化燃烧管使用前应注入〇2 -个小时用于氧化管的再生； 测定S15N,需使用液氮冷阱冻结除去CO2高凝固点气体，防止CO2进入离子源打出碎片离 子[CO+ ] m/z 28，29对[N2+ ]m/z 28，29造成干扰； 测定SD:使用高温裂解管，设置温度为1450Γ，高温裂解管使用前应注入CH4-个小时用 于反应管涂炭。
【文档编号】G01N30/02GK105954428SQ201610518597
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】韩书磊, 陈欢, 马潇, 付亚宁, 刘彤, 侯宏卫, 胡清源
【申请人】国家烟草质量监督检验中心