提取、检测烟草特有亚硝胺的方法、试剂盒及用图
【专利摘要】本发明属于检测分析领域，涉及提取、检测烟草特有亚硝胺的方法、试剂盒及用途，具体涉及一种提取烟草特有亚硝胺的方法，包括如下步骤：向含烟草特有亚硝胺的样品中加入抗坏血酸和提取溶剂进行浸提，分离得到提取液；所述提取溶剂选自水、缓冲盐水溶液和甲醇中的一种或多种。本发明还涉及检测烟草特有亚硝胺的方法以及试剂盒。本发明提取方法能有效提取出烟草特有亚硝胺。本发明检测方法能提高检测的灵敏度、降低检出限。本发明试剂盒可用于提取和/或检测烟草特有亚硝胺。
【专利说明】
提取、检测烟草特有亚硝胺的方法、试剂盒及用途
技术领域
[0001] 本发明属于检测分析领域，具体设及一种提取烟草特有亚硝胺的方法，还设及检 测烟草特有亚硝胺的方法、试剂盒及用途。
【背景技术】
[0002] 烟草特有亚硝胺(TSNAs)是烟草中N-亚硝胺含量最丰富的一类亚硝胺物质，存在 于烟草、烟草制品和卷烟烟气中。检测卷烟烟气中TSNAs的释放量对正确评价吸烟对健康的 危害具有重要意义。国际癌症研究署（IARC)对加拿大政府名单中有害成分的毒性评价结果 表明，4-(N-甲基-N-亚硝胺)-1-(3-化晚基)-下酬和N-亚硝基去甲基烟碱纯化学成分为可 疑的人体致癌成分。为了减少烟草特有亚硝胺对吸烟者和被动吸烟者健康可能造成的危 害，控制TSNAs在烟草及烟草制品中的含量，已成为一项重要的课题。目前，研究较为深入的 烟草特有亚硝胺包括N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)、N-亚硝基新烟 草碱(NAT)和4-(N-甲基-N-亚硝胺)-1-(3-化晚基)-下酬(NNK)，它们的化学结构式如下：
[00C
[0004] 现有主流烟气中烟草特有亚硝胺的检测方法主要包括国家标准GB/T 23228-2008 规定的气相色谱-热能检测器法(GC-TEA)和液相色谱串联S重四级杆质谱法化化C-MS/ MS)。其中，气相色谱-热能检测器法(GC-TEA)的检测步骤主要包括:捕集二十支卷烟的主流 烟气总粒相物，由二氯甲烧萃取S次，过活化的碱性氧化侣柱、浓缩，进行GC-TEA检测。该方 法较成熟，但存在前处理纯化步骤多、分析时间长、溶剂耗费大、环境受污染、检测器专属性 强及样品通量低的缺点。液相色谱串联S重四级杆质谱法化PLC-MS/MS)，通常W乙酸锭溶 液为萃取剂，振荡30min后，由HPLC-MS/MS联用仪分析检测样品中的TSNAs。虽然该方法缩短 了分析时间，提高了效率，但实际上样品中的TSNAs含量较低，杂质干扰严重，特别是目前国 内大力发展的低焦油烤烟型卷烟的主流烟气中TSNAs含量更低，使得HPLC-MS/MS方法的定 量限往往不能满足检测要求。
[0005] 抗坏血酸又名维生素 C，是含有6个碳原子的酸性多径基化合物，化学结构式为：
[0006]
[0007]目前，尚需一种能提高灵敏度和降低检出限的提取或检测烟草特有亚硝胺的方 法。
【发明内容】
[000引本发明人获得了一种有效提取样品中烟草特有亚硝胺的方法。在此基础上，本发 明人还获得了一种能提高灵敏度、降低检出限的检测烟草特有亚硝胺的方法；同时，还得到 一种试剂盒，该试剂盒能用于提取和/或检测烟草特有亚硝胺。
[0009] 本发明第一方面设及一种提取烟草特有亚硝胺的方法，包括如下步骤：向含烟草 特有亚硝胺的样品中加入抗坏血酸和提取溶剂进行浸提，分离得到提取液;所述提取溶剂 选自水、缓冲盐水溶液和甲醇中的一种或多种;优选地，提取溶剂为缓冲盐水溶液。
[0010] 本发明第一方面的任一实施方式中，向样品中同时加入提取溶剂和抗坏血酸。
[0011] 本发明第一方面的任一实施方式中，所述抗坏血酸和样品的重量比为(0.4-10): 1;优选为（0.4-3) :1、（0.5-4) :1、（1-8): 1、（2-9):1、（2-7): 1、（2-5):1 或者（2-4):1;更优选 为 0.4:1、0.5:1、3:1、2:1、4:1 或者5:1。
[0012] 本发明第一方面的任一实施方式中，所述提取方法包括如下A至H中的任意一项或 者多项：
[0013] A.所述样品选自烟草、烟草制品和卷烟烟气粒相物中的一种或多种;优选地，所述 样品为卷烟烟气粒相物，更优选为卷烟主流烟气粒相物；
[0014] B.所述烟草特有亚硝胺选自NNN、NAB、NAT和NNK中的一种或多种；
[0015] C.所述缓冲盐水溶液的pH值为6.5-7.5，优选为7;
[0016] D .所述缓冲盐水溶液为乙酸锭水溶液；优选地，乙酸锭水溶液的浓度为0.05- Imo 1/L，更优选为0.08-0.5mo 1/L，进一步优选为0.1 mo 1/L;
[0017] E.所述提取溶剂的添加量为0.04-3mL/(mg样品），优选为0. l-2mL/(mg样品），更优 选为0.3mL/(mg样品）；
[0018] F.所述浸提在超声条件下进行;优选地，超声时间为20-60分钟，更优选为30分钟；
[0019] G.所述分离的方式为过滤处理，优选采用0.22皿的滤膜过滤；
[0020] H.还包括，在分离前进行静置的步骤;优选地，静置3-10分钟，更优选静置5分钟。
[0021] 本发明第二方面设及一种检测烟草特有亚硝胺的方法，包括按照本发明第一方面 任一所述方法提取得到提取液的步骤;优选地，还包括用液相色谱串联质谱检测提取液的 步骤。
[0022] 不拘于理论的限制，抗坏血酸能提高烟草特有亚硝胺的离子化效率，抑制烟草特 有亚硝胺的氧化分解，从而提高了烟草特有亚硝胺的灵敏度，降低了检出限。并且，抗坏血 酸有助于从样品中更加有效地提取出烟草特有亚硝胺。
[0023] 本发明第二方面的任一实施方式中，所述检测为定量检测，优选W内标法定量检 巧U;更优选地，内标物为烟草特有亚硝胺的気代物;进一步优选地，所述烟草特有亚硝胺的 気代物含4个気原子。
[0024] 本发明第二方面的任一实施方式中，液相色谱操作条件选自如下a至e中的任意一 项或者多项：
[0025] a.液相色谱柱为C18液相色谱柱;优选为菲罗口 C18液相色谱柱；
[0026] b.液相色谱柱的规格为IOOmm X 2. Imm i . d.，1.7皿粒径；
[0027] 。.色谱柱溫度为20-70°(：，优选为30-60°(：，更优选为40°(：;
[002引 d.进样量3-1化L，优选为4-祉L，更优选为化L
[0029] e.流动相包括流动相A和流动相B;优选地，流动相A为甲醇，流动相B为0.2% (V/V) 乙酸水溶液;更优选地，流动相的洗脱程序如下表：
[0030]
[0031] 本发明第二方面的任一实施方式中，质谱操作条件或检测参数选自如下（1)至 (13)中的任意一项或者多项：
[0032] (1)离子源为电喷雾电离源；
[0033] (2)扫描方式为正离子扫描；
[0034] (3)电喷雾电压为4500-6000V，优选为5500V;
[0035] (4)离子源溫度为550-700°C，优选为650°C ;
[0036] (5)辅助气压力为50psi-60psi，优选为50psi或60psi ;
[0037] (6)NAB 的定性离子对为 192.1/133.1;
[0038] (7)NAB 的定量离子对为 192.1/162.2;
[0039] (S)NAT 的定性离子对为 190.2/106.1;
[0040] (9)NAT 的定量离子对为 190.2/160.2;
[0041 ] (10)NNK 的定性离子对为 208.2/148.1;
[0042] (11 )NNK 的定量离子对为 208.2/122.2;
[0043] (12) N順的定性离子对为178.2/120.1;
[0044] (13) N順的定量离子对为178.2/148.2。
[0045] 本发明的一个实施方案中，质谱检测参数还包括如下任意一项或者多项：
[0046] (1 )NAB-d4 的定性离子对为196.2/137.2;
[0047] (2)NAB-d4 的定量离子对为 196.2/166.2;
[004引（3)NAT-d4 的定性离子对为 194.1/110.1;
[0049] (4) NAT-d4 的定量离子对为 194.1/164.2;
[0化0] (5作服-(14的定性离子对为212.2/110.1;
[0化1] (6)NNK-d4 的定量离子对为 212.2/126.1;
[0化2] (7作順-(14的定性离子对为182.1/124.1;
[0化3] (8作順-(14的定量离子对为182.1/152.2。
[0054] 本发明第=方面设及一种试剂盒，包含乙酸锭水溶液和抗坏血酸;优选地，乙酸锭 水溶液的浓度为 0.05-lmol/L，更优选为 0.05-0.6mol/L、0.08-0.5mol/L、0.07-0.7mol/L、 0.08-0.8mol/L、0.09-0.9mol/L 或者 0.1-lmol/L，进一步优选为 0. lmol/L、0.2mol/L、 0.3mol/L、0.4mo 1/L或者0.7mol/l;优选地，还包含甲醇和0.2% (v/v)乙酸水溶液;优选地， 还包含C18液相色谱柱。
[0055] 本发明第四方面设及本发明第=方面所述的试剂盒在提取和/或检测样品中烟草 特有亚硝胺中的用途；
[0056] 优选地，所述样品选自烟草、烟草制品和卷烟烟气粒相物中的一种或多种;更优选 地，所述样品为卷烟烟气粒相物，进一步优选为卷烟主流烟气粒相物；
[0化7] 优选地，所述烟草特有亚硝胺选自NNN、NAB、NAT和NNK中的一种或多种。
[0058] 本发明第五方面设及抗坏血酸在提取和/或检测烟草特有亚硝胺，或者在提高烟 草特有亚硝胺的检出限和/或灵敏度中的用途；
[0059] 优选地，所述烟草特有亚硝胺选自NNN、NAB、NAT和NNK中的一种或多种；
[0060] 优选地，含有烟草特有亚硝胺的样品选自烟草、烟草制品和卷烟烟气粒相物;更优 选地，所述样品为卷烟烟气粒相物，进一步优选为卷烟主流烟气粒相物或卷烟主流烟气总 粒相物。
[0061] 本发明中如无特别说明，"烟草特有亚硝胺"是指存在于烟草中的，含有-N-N = O功 能基团的亚硝胺类物质。
[0062] 本发明中如无特别说明，"主流烟气"是指从烟支吸端形成的烟气。
[0063] 本发明中如无特别说明，"主流烟气粒相物"是指从烟支吸端形成的烟气被吸烟机 上剑桥滤片或玻璃纤维滤片所捕集的物质。
[0064] 本发明取得的有益效果：
[0065] 1、本发明提取烟草特有亚硝胺的方法，能有效提取出样品中的烟草特有亚硝胺物 质。
[0066] 2、本发明检测烟草特有亚硝胺的方法，能提高灵敏度、降低检出限。
[0067] 3、本发明中，抗坏血酸提高了烟草特有亚硝胺检测的灵敏度，降低了检出限。
[0068] 4、本发明中，抗坏血酸提高了烟草特有亚硝胺的离子化效率，并抑制了烟草特有 亚硝胺的氧化分解。
【附图说明】
[0069] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0070] 图IA实施例1的样品溶液色谱图中NAB-d4内标物的色谱峰；
[0071] 图IB实施例1的样品溶液色谱图中NAT-d4内标物的色谱峰；
[0072 ]图1C实施例1的样品溶液色谱图中NNK-d4内标物的色谱峰；
[0073 ]图ID实施例1的样品溶液色谱图中NNN-d4内标物的色谱峰；
[0074]图2A实施例1的样品溶液色谱图中NAB的色谱峰；
[00巧]图2B实施例1的样品溶液色谱图中NAT的色谱峰；
[0076] 图2C实施例1的样品溶液色谱图中NNK的色谱峰；
[0077] 图2D实施例1的样品溶液色谱图中的色谱峰；
[007引图3A对比例的样品溶液色谱图中NAB-d4内标物的色谱峰；
[0079] 图3B对比例的样品溶液色谱图中NAT-d4内标物的色谱峰；
[0080] 图3C对比例的样品溶液色谱图中NNK-d4内标物的色谱峰；
[0081 ]图3D对比例的样品溶液色谱图中NNN-d4内标物的色谱峰；
[0082] 图4A对比例的样品溶液色谱图中NAB的色谱峰；
[0083] 图4B对比例的样品溶液色谱图中NAT的色谱峰；
[0084] 图4C对比例的样品溶液色谱图中NNK的色谱峰；
[0085] 图4D对比例的样品溶液色谱图中N順的色谱峰。
【具体实施方式】
[0086] 实施例1
[0087] 1.试剂
[008引 （1)混合内标溶液:称取NAB-d4、NAT-d4、NNK-d4和NNN-d4(百灵威科技有限公司） 各10.0 mg，分别置于4个IOmL栋色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为1. Omg/mL的 内标储备液。将4种内标储备液用甲醇同倍数稀释，将稀释后的4种内标储备液混合，得到 NAB-d4、NAT-d4、NNK-d4和NNN-d4浓度均为1. Oiig/mL的混合内标溶液。
[0089] (2)提取溶剂:称取3.85g乙酸锭置于500血容量瓶中（精确至0.1 mg)，加入5.0血混 合内标溶液，用水稀释至刻度，配制成含10.0 ng/mL内标的0.1mol/L乙酸锭水溶液。
[0090] (3)混合标准溶液:称取NAB、NAT、NNK和順N (百灵威科技有限公司）各10.0 mg，分别 置于4个10血栋色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为1.Omg/血的标准储备液。将4 种标准储备液分别用甲醇进行稀释，将稀释后的4种标准储备液混合，配制得到NAB、NAT、 NNK和NN脚农度分别为0. ^ig/mL、1. Oiig/mL、1. Oiig/mL和1. Oiig/mL的混合标准溶液。
[0091] (4)标准工作溶液:移取0.1 mL、0.2mL、0.5mL、1. OmL、2. OmL和5. OmL混合标准溶液 置于不同的IOOmL容量瓶中，再分别加入1.OmL混合内标溶液和Ig抗坏血酸（百灵威科技有 限公司），用O.lmol/L乙酸锭水溶液定容至刻度，即配制成如表1所示的6级标准工作溶液， 其内标浓度均为10.Ong/mL。如样品浓度超出标准工作溶液覆盖范围，可适当扩展标准工作 溶液覆盖范围。该TSNAs标准工作溶液应在使用前配制。
[0092] 表1系列标准工作溶液 ^nnnol
[0094] 2.提取
[OOM]按照国家标准GB/T 19609的方法，用直径为44mm的玻璃纤维滤片捕集5支卷烟的 主流烟气总粒相物，每个样品应平行测定2次，所捕集的5支卷烟主流烟气总粒相物约为 SOmg。将滤片置于50mL锥形瓶中，准确加入15 . OmL提取溶剂和O . 15g抗坏血酸，超声萃取 SOmin后，静置5min。取ImL液体过0.22皿滤膜，得到样品溶液，移至色谱分析瓶中待分析。
[0096] 3.检测
[0097] 用高效液相色谱-串联质谱仪(美国AB公司，型号为Qtrap 5500)分别对标准工作 溶液和样品溶液进行检测分析。得到的样品溶液色谱图中，内标物的色谱峰如图1A-1D所 示，四种TSNAs物质的色谱峰如图2A-2D所示。
[009引色谱操作条件：色谱柱采用菲罗口 C18液相色谱柱，规格为IOOmm X 2.1mm i.d.， 1.7曲I粒径;色谱柱溫度为40°C ;进样量为扣L流动相:流动相A为甲醇，流动相B为0.2% (体 积比）的乙酸溶液;流动相的梯度洗脱程序见表2。
[0099] 表2快速型高效液相色谱梯度洗脱程序
[0100]
[0101] 质谱操作条件:离子源：电喷雾电离源化SI);扫描方式:正离子扫描;检测方式:多 反应监测(MRM);电喷雾电压：5500V;离子源溫度:650°C ;辅助气Gas 1压力：6化Si ;辅助气 Gas2压力：SOpsi。
[0102] 各分析物的定量离子对、定性离子对及碰撞能量(CE)见表3。
[0103] 表3质谱检测参数表
[0104]
[0105] 4.计算
[0106] (1)根据上面3.中标准工作溶液的检测结果，得到NAB、NAT、NNK和N順的标准曲线 方程，见表4。其中，横坐标表示TSNAs浓度与内标物浓度比值，纵坐标表示TSNAs峰面积与内 标物峰面积比值。
[0107] 表4四种TSNAs的标准曲线方程和定量检出限 [010 引
[0109] (2)检巧嗎到的样品溶液中NAB、NAT、NNK和NNN的峰面积如表5所示。
[0110] 表5四种TSNAs的峰面积检测结果 「01111
LO112」（3)化惦巧化浴汲的四种TSMsi^其内称物的峰曲积粒测结呆，结合上曲（1)中四 种TSNAs的标准曲线方程，计算得到样品溶液中四种TSNAs的浓度。再根据下式计算得到每 支卷烟丰流烟气中TSNAs的传输量，结果见表6。
[0113]
[0114] 式中；
[0115] m-每支卷烟主流烟气中TSNAs的传输量，单位为纳克每支(ng/cig);
[0116] A-样品溶液中TSNAs的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mU ;
[0117] V-样品溶液体积，单位为毫升(mU ;
[011引n-烟支数量，单位为支(Cig)。
[0119] 表6每支卷烟主流烟气中TSNAs的传输量
[0120] LUIZI」 刈化例
[0122] 在配制标准工作溶液和提取得到样品溶液的步骤中不加入抗坏血酸。其它操作参 照实施例1进行。
[0123] 得到的样品溶液色谱图中，内标物的色谱峰如图3A-3D所示，四种TSNAs物质的色 谱峰如图4A-4D所示。四种TSNAs物质的峰面积见表5。计算得到的每支卷烟主流烟气中 TSNAs的传输量见表6。
[0124] 由表5可知，与对比例不加抗坏血酸相比，本发明加入抗坏血酸之后，NAT、NNK、NNN 物质检测的峰面积大大增加，而且对于对比例无法检测到峰面积的NAB物质，本发明也检测 到 了较大的峰面积，因此，本发明方法提高了四种TSNAs检测的灵敏度，降低了检出限。
[0125] 由表6可知，与对比例相比，本发明可定量检测出对比例无法定量的卷烟主流烟气 中NAB传输量，本发明方法提高了 TSNAs检测的灵敏度，降低了检出限。并且，本发明和对比 例所检测到卷烟主流烟气中其它几种TSNAs物质的传输量结果相近。
[0126] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可W做出其它不同形式的变化或 变动。运里无需也无法对所有的实施方式予W穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种提取烟草特有亚硝胺的方法，包括如下步骤： 向含烟草特有亚硝胺的样品中加入抗坏血酸和提取溶剂进行浸提，分离得到提取液； 所述提取溶剂选自水、缓冲盐水溶液和甲醇中的一种或多种； 优选地，抗坏血酸和提取溶剂同时加入； 优选地，提取溶剂为缓冲盐水溶液。2. 根据权利要求1所述的提取方法，其中，所述抗坏血酸和样品的重量比为(0.4-10): 1;优选为(1-8):1;更优选为3:1。3. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于如下A至Η中的任意一项或者多项： Α.所述样品选自烟草、烟草制品和卷烟烟气粒相物中的一种或多种;优选地，所述样品 为卷烟烟气粒相物，更优选为卷烟主流烟气粒相物； Β.所述烟草特有亚硝胺选自NNN、NAB、NAT和ΝΝΚ中的一种或多种； C. 所述缓冲盐水溶液的pH值为6.5-7.5，优选为7; D. 所述缓冲盐水溶液为乙酸铵水溶液;优选地，乙酸铵水溶液的浓度为0.05-lmol/L， 更优选为〇. 08-0.5mol/L，进一步优选为0. lmol/L; E. 所述提取溶剂的添加量为0.04-3mL/(mg样品），优选为0. l-2mL/(mg样品），更优选为 0.3mL/(mg样品）； F. 所述浸提在超声条件下进行;优选地，超声时间为20-60分钟，更优选为30分钟； G. 所述分离的方式为过滤处理，优选采用0.22μπι的滤膜过滤； Η.还包括，在分离前进行静置的步骤;优选地，静置3-10分钟，更优选静置5分钟。4. 一种检测烟草特有亚硝胺的方法，包括按照权利要求1至3中任一项所述方法提取得 到提取液的步骤;优选地，还包括用液相色谱串联质谱检测提取液的步骤。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其中，所述检测为定量检测，优选以内标法定量检 测;更优选地，内标物为烟草特有亚硝胺的氘代物;进一步优选地，所述烟草特有亚硝胺的 氖代物含4个氖原子。6. 根据权利要求4或5所述的检测方法，其中，液相色谱操作条件选自如下a至e中的任 意一项或者多项： a. 液相色谱柱为C18液相色谱柱;优选为菲罗门C18液相色谱柱； b. 液相色谱柱的规格为100_X2.1mm i.d.，1·7μηι粒径； c. 色谱柱温度为20-70 °C，优选为30-60 °C，更优选为40 °C ; d. 进样量为3-10yL，优选为4-8yL，更优选为5yL; e. 流动相包括流动相A和流动相B;优选地，流动相A为甲醇，流动相B为0.2% (V/V)乙酸 水溶液;更优选地，流动相的洗脱程序如下表：7. 根据权利要求4或5所述的方法，质谱操作条件或检测参数选自如下（1)至（13)中的 任意一项或者多项： (1) 离子源为电喷雾电离源； (2) 扫描方式为正离子扫描； (3) 电喷雾电压为4500-6000V，优选为5500V; (4) 离子源温度为550-700°C，优选为650°C ; (5) 辅助气压力为50-60psi，优选为50psi或60psi ; (6) NAB的定性离子对为192 · 1/133 · 1; (7) NAB的定量离子对为192.1/162.2; (8) NAT的定性离子对为190 · 2/106 · 1; (9) NAT的定量离子对为190 · 2/160 · 2; (10) NNK的定性离子对为208.2/148.1; (11 )NNK的定量离子对为208.2/122.2; (12) NNN的定性离子对为178.2/120.1; (13) NNN的定量离子对为178.2/148.2。8. -种试剂盒，包含乙酸铵水溶液和抗坏血酸;优选地，乙酸铵水溶液的浓度为0.05-1111〇1/1，更优选为0.08-0.51]1〇1/1，进一步优选为0.11]1〇1/1 ;优选地，还包含甲醇和0.2%(>/ V)乙酸水溶液;优选地，还包含C18液相色谱柱。9. 权利要求8所述试剂盒在提取和/或检测样品中的烟草特有亚硝胺中的用途； 优选地，所述样品选自烟草、烟草制品和卷烟烟气粒相物中的一种或多种;更优选地， 所述样品为卷烟烟气粒相物，进一步优选为卷烟主流烟气粒相物； 优选地，所述烟草特有亚硝胺选自NNN、NAB、NAT和NNK中的一种或多种。10. 抗坏血酸在提取和/或检测烟草特有亚硝胺，或者在提高烟草特有亚硝胺的检出限 和/或灵敏度中的用途;优选地，所述烟草特有亚硝胺选自NNN、NAB、NAT和NNK中的一种或多 种。
【文档编号】G01N30/06GK105954444SQ201610581289
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月22日
【发明人】邓其馨, 黄延俊, 黄朝章, 张建平, 黄华发, 叶仲力, 刘泽春, 许寒春, 谢卫
【申请人】福建中烟工业有限责任公司