一种基于f2蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于F2蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒。该试剂盒包括表达F2蛋白的293T细胞，FITC标记的羊抗鸡抗体，样品稀释液和洗涤液。本发明试剂盒具有良好的特异性。该试剂盒不仅能用于血清4型禽腺病毒感染状况流行病学调查，而且能有效用于监测免疫鸡群血清4型禽腺病毒抗体水平，用于评价免疫保护性抗体水平等。
【专利说明】
一种基于F2蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试 剂盒
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于F2蛋白的检测4型禽腺病毒抗 体的间接免疫荧光试剂盒。
【背景技术】
[0002] 禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)， 12个血清型。虽然在世界各地均有报道，FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引 起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、 心包积液病例逐渐增多。到2015年，FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前FAdV爆发不仅 发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给国内养鸡业造成了严重经济损失。病毒 分离鉴定发现，目前高致病性4型FAdV在国内鸡群流行较广泛。然目前尚无针对4型FAdV血 清学抗体检测的快速方法及其试剂盒。在FAdV的编码蛋白中，F2纤突蛋白为FAdV的表面蛋 白，在介导FAdV病毒感染宿主细胞中起重要作用，能有效刺激机体产生体液免疫，甚至中和 抗体。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是在于提供一种基于F2蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧 光试剂盒。本发明的原理和最核心的关键技术是构建了血清4型禽腺病毒F2蛋白基因真核 表达质粒，并将转染该质粒的表达F2蛋白的293T细胞作为抗原建立试剂盒，检测血清4型禽 腺病毒特异性抗体。
[0004] 本发明所述的一种基于F2蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒， 包括表达F2蛋白的293T细胞，FITC标记的羊抗鸡抗体，样品稀释液，洗涤液。
[0005] 其中，所述表达F2蛋白的293T细胞，是转染F2蛋白真核表达质粒的表达4型禽腺病 毒F2蛋白的293T细胞。
[0006] 其中，所述稀释液及洗涤液，是10mM pH7.2的磷酸缓冲液。
[0007] 所述表达F2蛋白的293T细胞，通过下述步骤得到：
[0008] (1)禽腺病毒F2蛋白真核表达质粒构建：以pcDNA3.1真核表达载体以及血清4型禽 腺病毒基因组为模板，分别以SEQ ID N0.1-2和SEQ ID N0.3-4的序列为引物，分别PCR扩增 出线性化的pcDNA3.1载体以及血清4型禽腺病毒F2蛋白基因（SEQIDN0.5);随后利用重组 酶ExnaseTM II将线性化的pc DNA3.1载体以及血清4型禽腺病毒F2蛋白基因的PCR产物进 行快速体外重组克隆（参见图1，图2)，重组克隆经序列验证后，命名为pcDNA3. l-FAdV_F2。 [0009] (2)制备检测血清4型禽腺病毒抗体的抗原：将pCDNA3.1 -FAdV_F2重组质粒，用 MIRUS转染液转染293T细胞。细胞转染48小时后，用丙酮乙醇固定液固定细胞5分钟；固定的 表达细胞血清4型禽腺病毒F2蛋白的293T细胞自然干燥后置-20度待用，即为检测血清4型 禽腺病毒抗体的抗原。
[0010] 检测血清4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒:该试剂盒成分包括固定在96 孔中的表达F2蛋白的293T细胞，商品化的FITC标记的羊抗鸡抗体，样品稀释液以及洗涤液。 该试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：固定在96孔中的表达F2 蛋白的293T细胞用roS洗涤一遍后，加入稀释的血清样品，37度反应1小时;PBS洗涤3遍后， 加入稀释的FITC标记的羊抗鸡抗体，37度反应1小时;PBS洗涤3遍后，进行倒置荧光显微镜 下观察。若出现细胞核内亮绿色特异荧光，则该样品判为阳性;否则为阴性。
[0011] 本发明的有益效果体现在：
[0012]为建立快速检测4型FAdV血清学的技术，本发明对4型FAdV的F2纤突蛋白进行了克 隆，构建了F2纤突蛋白真核表达质粒，将转染F2纤突蛋白表达质粒、且表达4型FAdV的F2纤 突蛋白的293T细胞作为检测用抗原，组装了检测4型FAdV抗体的间接免疫荧光试剂盒。检测 结果发现，该检测4型FAdV抗体的间接免疫荧光试剂盒具有良好的4型FAdV特异性、敏感性， 在4型FAdV病毒流行病学调查及免疫监测中具有良好的应用价值，填补了国内外空白。
[0013] 本发明建立的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒能特异性的检查 出抗血清4型禽腺病毒抗体，而不能检测出抗其它病原的抗体。因此，该试剂盒具有良好的 特异性。该试剂盒不仅能用于血清4型禽腺病毒感染状况流行病学调查，而且能有效用于监 测免疫鸡群血清4型禽腺病毒抗体水平，用于评价免疫保护性抗体水平等。
【附图说明】
[0014] 图1，PCR扩增线性化PCDNA3.1载体
[0015] 1:线性化的pcDNA3.1载体;M: 1Kb DNA Ladder。
[0016] 图2，PCR扩增F2基因
[0017] 1:FAdv-F2;M:1Kb DNA Ladder。
[0018] 图3，pcDNA3. l-FAdV_F2重组表达载体鉴定
[0019] l:pcDNA3.卜FAdV_F2;M:DL5000 DNA Marker。
[0020] 图4，pcDNA3. l-FAdV_F2在293T细胞表达效果
[0021] Μ:Protein Marker; 1:293T细胞裂解产物；2:pcDNA3 · l-FAdV_F2转染293T细胞的 裂解产物。
[0022] 图5,检测4型FAdV抗体的间接免疫荧光试剂盒检测效果
[0023] A:转染pcDNA3.1-FAdV_F2的293T细胞与FAdV血清反应;B:未转染质粒的293T细胞 与FAdV血清反应；C:转染pcDNA3. l-FAdV_F2的293T细胞与SPF鸡血清反应；D:转染 pcDNA3.1-FAdV_F2的293T细胞与抗马立克氏病病毒血清反应;E:转染pcDNA3.1-FAdV_F2的 293T细胞与抗禽白血病病毒血清反应;F:转染pcDNA3. l-FAdV_F2的293T细胞与抗禽流感病 毒血清反应;G:转染pcDNA3 . l-FAdV_F2的293T细胞与抗鸡新城疫病毒血清反应;Η:转染 pcDNA3. l-FAdV_F2的293Τ细胞与抗传染性法氏囊病病毒血清反应;I:转染pcDNA3. l-FAdV_ F2的293T细胞与抗传染性支气管炎病毒血清反应。
【具体实施方式】 [0024] 实施例：
[0025] 1，血清4型禽腺病毒分离:取疑似4型禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后用按 1 : 5的比例加入PBS制成悬液；5000r/min离心15min，取上清；加入青霉素和链霉素各 1000IU/ml，37°C反应30min;经0.45um微孔滤器过滤后，以0.2ml/胚的剂量，经尿囊腔接种8 日龄SPF鸡胚，接种后96-120小时后收取尿囊液;尿囊液经鉴定为4型禽腺病毒后，一 20 °C保 存。
[0026] 2,设计扩增出含pcDNA3.1线性化载体与血清4型禽腺病毒F2蛋白基因片段的引 物:具体引物序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
[0027] 表1 PCR扩增线性化pcDNA3.1及血清4型禽腺病毒F2蛋白基因引物
[0028]
[0029] 3,血清4型禽腺病毒基因组的制备：取血清4型禽腺病毒分离毒株病毒上清400uL 于1.5mL指形管内，加入400uL细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0,20mmol/L EDTA pH 8.0，2% SDS和蛋白酶K)，充分混匀后放置56°C水浴锅作用4小时;加入400uLTris平衡酚，充 分混勾后l〇〇〇〇r/min离心10分钟，取上清于另一 1.5mL指形管;加入400uL酸:氯仿:异戊醇， 充分混匀后l〇〇〇〇r/min离心5分钟，取上清于另一 1.5mL指形管；加入800uL无水乙醇，颠倒 混匀后放入-20 °C孵育30分钟，12000r/min离心15分钟，弃尽上清;室温自然干燥后向沉淀 加入30uL灭菌超纯水和2uLRNA酶，充分溶解后，即得血清4型禽腺病毒基因组，置-20°C备 用。
[0030] 4，PCR扩增pcDNA3.1线性化载体以及血清4型禽腺病毒F2蛋白基因片段：分别以 PCDNA3.1载体质粒（Invitrogen公司）以及以上制备的4型禽腺病毒基因组为模板，表1所述 相应引物为引物分别进行PCR扩增出线性化的pcDNA3.1载体以及血清4型禽腺病毒F2蛋白 基因。？0財广增反应体系为 :模板1此，5\8证€611〇1^，1〇111]\1(1犯13]^111^，上游引物为1(^ mol 2uL，下游引物为ΙΟμ mol 2uL，高保真酶luL，加入灭菌超纯水至SOuI^PCR扩增反应循环 参数为:95 °C预变性4分钟，随后进行30个循环(95 °C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸3分 钟），72°C延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶中进行电泳分析(如图1，图2 所示）。
[0031] 5，pcDNA3. l-FAdV_F2重组表达载体构建:将以上纯化的线性化载体PCDNA3.1以及 血清4型禽腺病毒F2蛋白基因片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTMII的作用下进行重组 克隆。具体重组反应体系如下:纯化的血清4型禽腺病毒F2蛋白基因片段PCR产物50-100ng， 纯化的pcDNA3.1线性化载体50ng，2yL商品化的ExnaseTMΠ 酶，4yL5倍的缓冲液，其它补加 水至20yL。反应物于37°C作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20yL反应物转化到常规感受 态细菌，涂LB板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，并进行PCR鉴定(如图3所示）。
[0032] 6,制备检测血清4型禽腺病毒抗体的抗原：在96孔细胞板中培养293T细胞至形成 80%-90%单层；随即参照转染试剂TransIT-LTl说明书的步骤进行pcDNA3.1-FAdV_F2重组 表达质粒转染。具体步骤：先将48ug质粒溶于1.6ml的OPTI-MEM培养基，然后加入72uL的 TransIT-LTl转染试剂，混匀后室温放置;45分钟后加入6.4ml的OPTI-MEM培养基;混匀后滴 加到96孔细胞板，每孔80ul。细胞转染48小时后，弃去96孔细胞板中培养基，并用丙酮乙醇 固定液固定细胞5分钟；固定的表达细胞血清4型禽腺病毒F2蛋白的293T细胞自然干燥后 置-20度待用，即为检测血清4型禽腺病毒抗体的抗原。
[0033] 7,检测血清4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒组装及应用：该试剂盒成分 包括1块固定的表达F2蛋白的293T细胞96孔板，lml商品化的FITC标记的羊抗鸡抗体，200ml 样品稀释液以及洗涤液(PBS)，lml阳性血清及lml阴性血清。该试剂盒检测血清4型禽腺病 毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：先用PBS洗涤一遍固定有表达F2蛋白的293T细胞96孔 板，然后加入1:100稀释的血清样品（同时设立1:100的阳性血清及阴性血清对照），50ul/ 孔，37度反应45min; roS洗涤3遍后，加入1:100稀释的FITC标记的羊抗鸡抗体，50ul/孔，37 度反应30min; PBS洗涤3遍后，进行倒置荧光显微镜下观察。若出现细胞核内亮绿色特异荧 光，则该样品判为阳性;否则为阴性。
【主权项】
1. 一种基于F2蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括 表达F2蛋白的293T细胞，FITC标记的羊抗鸡抗体，样品稀释液，洗涤液。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述表达F2蛋白的293T细胞，是转染F2蛋白 真核表达质粒的表达4型禽腺病毒F2蛋白的293T细胞。3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述稀释液及洗涤液，是10mMpH7.2的磷酸 缓冲液。
【文档编号】G01N33/53GK105973854SQ201610327763
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】叶建强, 王伟康, 邵红霞, 梁广成, 万志敏, 秦爱建
【申请人】扬州大学