一种高效液相色谱拆分手性药物拉米夫定的方法
【专利摘要】本发明公布了一种高效液相色谱拆分手性药物拉米夫定的方法，以环糊精类手性柱作为固定相，以缓冲液磷酸三乙胺和有机改性剂作为流动相，采用正相流动相系统，在设定的温度、流速和紫外检测波长条件下，对手性药物拉米夫定进行拆分；所述的有机改性剂为甲醇和四氢呋喃的混合液，两者以体积比9:1混合，且在使用前使用0.22μm的有机过滤膜进行抽滤，并用超声波进行5～10min的脱气处理。本方法自动化程度高，具有操作简便，成本低，效率高的优点。本发明对拉米夫定在医药方面的研究使用具有重要的现实指导意义。
【专利说明】一种高效液相色谱拆分手性药物拉米夫定的方法 【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种手性药物拉米夫定的拆分方法。 【【背景技术】】
[0002] 手性药物是指药物分子结构中引入手性中心后，得到一对互为实物与镜像的对映 体。目前发现合成的很大一部分药物具有手性，而手性药物中的一个对映体可能是有效成 分，可以与人体的手性环境相匹配，从而发挥应有的药效;而另一个对映体可能是低效无效 甚至是有毒的。因此，开发和研究手性对映体的拆分技术以用于医药质量控制具有非常重 要的现实意义。
[0003] 拉米夫定是一种嘧啶核苷类抗病毒药物，主要用于慢性乙型肝炎的治疗，它也存 在两种异构体，拉米夫定(左旋体)和拉米夫定右旋体，其结构式如下：
[0004]
[0005] 杈木大疋（左肫1本）王安仰制HBV UNA多眾職，盎不个与人关UNA多聚酶发生反应， 是拉米夫定的有效成分。而拉米夫定右旋体可抑制人线粒体DNA的合成，引起周围神经病 变，属于拉米夫定的杂质部分。
[0006] 目前，常用于手性药物拆分的方法有酶法、化学法、超临界色谱法、气相色谱法、高 效液相色谱法、高效毛细管电泳法和分子印迹法等。与其他手性拆分方法相比，高效液相色 谱法具有分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化，应用范围广的优点，用它对手 性药物拉米夫定进行拆分，可以快速准确的将拉米夫定的两种对映体拆分开来，并且可进 一步对拉米夫定进行定量分析。 【
【发明内容】
】
[0007] 本发明的发明目的在于:提供一种手性药物拉米夫定的高效液相色谱系统的拆分 方法。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0009] -种高效液相色谱拆分手性药物拉米夫定的方法，是以环糊精类手性柱作为固定 相，以缓冲液磷酸三乙胺和有机改性剂作为流动相，采用正相流动相系统，在设定的温度、 流速和紫外检测波长条件下，对手性药物拉米夫定进行拆分;所述的有机改性剂为甲醇和 四氢呋喃的混合液，两者以体积比9 :1混合，且在使用前使用0.22μηι的有机过滤膜进行抽 滤，并用超声波进行5~lOmin的脱气处理。
[0010] 在本发明中，进一步地，所述的环糊精类手性柱的填料为双[-6-氧-(3-脱氧柠檬 酸单酯_4) ]-β-环糊精，缩写为β-〇)-Β2。
[0011] 在本发明中，进一步地，所述的缓冲液磷酸三乙胺的浓度为5Xl(T3m〇l/L，pH = 3.6-4.8，且在使用前使用0.22以111的水系膜进行抽滤，并用超声波进行5~1〇1^11的脱气处 理。
[0012] 在本发明中，进一步地，所述流动相中缓冲液磷酸三乙胺:有机改性剂的体积比为 40-50% :60-50% 〇〇
[0013]在本发明中，进一步地，所述的正相流动相系统的正相柱再生方法为:依次以20~ 30倍的色谱柱体积的正乙烷、异丙醇、二氯甲烷和甲醇(B栗，100%体积)作为流动相冲洗色 谱柱，然后再以相反的顺序冲洗;本发明使用的色谱柱体积为8mL，则上述每种流动相的使 用体积应为200mL(取25倍），以lmL/min的流速进行清洗，即每种流动相冲洗色谱柱200min， 且正乙烷、异丙醇、二氯甲烷和甲醇在使用前均需用〇.22μπι的有机过滤膜进行抽滤，并用超 声波进行5~lOmin的脱气处理。
[0014] 在本发明中，进一步地，所述的手性药物拉米夫定的浓度为2.26 Xl(T4m〇l/L，进样 量为20yL。
[0015] 在本发明中，进一步地，所述的温度为22-25°C。
[0016] 在本发明中，进一步地，所述的所述的流速为0.5-1 .OmL/min.。
[0017]在本发明中，进一步地，所述的紫外检测波长为260-275nm。
[0018] 综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
[0019] (1)采用的拆分方法为高效液相色谱法，与其他拆分方法相比，高效液相色谱法具 有分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化，应用范围广的优点。能够快速准确的 对手性药物进行拆分。
[0020] (2)本发明所使用的色谱柱为自己设计填充的类环糊精手性柱，填料为双[-6-氧-(3-脱氧柠檬酸单酯-4)]-β-环糊精，具有良好的刚性和热稳定性，使得色谱柱更加耐用和 高效，提高了拆分的效率和准确度。
[0021] (3)本发明采用高效液相色谱对手性药物拉米夫定进行拆分，是一个创新型的拆 分方法，根据检索的资料显示，对于手性药物拉米夫定拆分方面的研究寥寥无几，仅有一篇 资料显示过利用高效毛细管电泳法对拉米夫定进行了手性拆分，目前还没有利用高效液相 色谱对拉米夫定进行拆分的发明，因此，该发明无论是对于学术方面还是制药方面，都具有 重大的现实意义。 【【具体实施方式】】
[0022] 在不同的色谱条件下，使用高效液相色谱仪对手性药物拉米夫定进行拆分前，都 要先实施以下几个实验步骤：
[0023] 1)高效液相色谱仪的清洗
[0024] 以蒸馏水和甲醇作为流动相(均分别用0.22μπι的水系膜和有机过滤膜过滤，并进 行脱气处理），Α栗连接蒸馏水，Β栗连接甲醇。以流速为lmL/min进行清洗，流动相中蒸馏水 的比例从1〇〇%-〇% (依次增加15%)，甲醇的比例从0%-100% (依次增加15%)，每个比例 梯度清洗lh。
[0025] 2)色谱柱填料的选择
[0026]本发明选用的色谱柱填料为双[-6-氧-(3-脱氧柠檬酸单酯-4)]_β-环糊精(缩写 为0-CD-B2)〇
[0027] 3)色谱柱的清洗
[0028] 本发明选择正相流动相系统的再生:依次以20-30倍的色谱柱体积的正乙烷、异丙 醇、二氯甲烷和甲醇(Β栗，100%体积)作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗。 本实验使用的色谱柱体积为8 m L，则上述每种流动相的使用体积应为2 0 0m L (取2 5倍），以 lmL/min的流速进行清洗，即每种流动相冲洗色谱柱200min。
[0029] 4)药品前处理
[0030]将高浓度的手性药物拉米夫定用蒸馏水进行稀释，配制成2.26 X 10_4mol/L的样品 溶液，并用〇.22yL的微孔滤膜过滤;将有机改性剂甲醇和四氢呋喃以体积比9:1进行混合， 并用0.22μπι的有机过滤膜过滤;配制浓度为5 X l(T3m〇l/L，pH分别为3.6、4.2和4.8的缓冲液 磷酸三乙胺，并用〇.22μπι的水系膜过滤;流动相在使用前用超声波进行5-10min的脱气处 理。
[0031] 实施例1
[0032] 1.色谱条件的设定
[0033] (1)缓冲液磷酸三乙胺pH为3.6，流动相中缓冲液磷酸三乙胺:有机改性剂甲醇和 四氢呋喃混合液的体积比为40% :60%，并用超声波进行5min脱气处理。
[0034] (2)检测温度为22。(：。
[0035] (3)流动相的流速设为0.5mL/min。
[0036] (4)紫外检测波长设为260nm〇
[0037] 2.进样进行拆分
[0038] 按上述的色谱条件运行高效液相色谱柱，待基线平稳且基线波动在0.2mAu范围内 时，用微量进样器取处理好的手性药物拉米夫定20yL，注射到高效液相色谱仪的进样系统 中，进行拆分。
[0039] 实施例2
[0040] 1.色谱条件的设定
[0041] (1)缓冲液磷酸三乙胺pH为4.2，流动相中缓冲液磷酸三乙胺:有机改性剂甲醇和 四氢呋喃混合液的体积比为45% :55%，并用超声波进行7min脱气处理。
[0042] (2)检测温度为23°C。
[0043] (3)流动相的流速设为0 · 7mL/min。
[0044] (4)紫外检测波长设为270nm〇
[0045] 2.进样进行拆分
[0046] 按上述的色谱条件运行高效液相色谱柱，待基线平稳且基线波动在0.2mAu范围内 时，用微量进样器取处理好的手性药物拉米夫定20yL，注射到高效液相色谱仪的进样系统 中，进行拆分。
[0047] 实施例3
[0048] 1.色谱条件的设定
[0049] (1)缓冲液磷酸三乙胺pH为4.8，流动相中缓冲液磷酸三乙胺:有机改性剂甲醇和 四氢呋喃混合液的体积比为50% :50%，并用超声波进行lOmin脱气处理。
[0050] (2)检测温度为25。(：。
[0051 ] (3)流动相的流速设为1.0mL/min。
[0052] (4)紫外检测波长设为275nm〇
[0053] 2.进样进行拆分
[0054]按上述的色谱条件运行高效液相色谱柱，待基线平稳且基线波动在0.2mAu范围内 时，用微量进样器取处理好的手性药物拉米夫定20yL，注射到高效液相色谱仪的进样系统 中，进行拆分。
[0055]在上述3个实施例所设定的色谱条件下，对手性药物拉米夫定进行的拆分，都实现 了基线分离，分离度分别为4.36、4.43和4.40,且保留时间均在7min内，峰型好。
【主权项】
1. 一种高效液相色谱拆分手性药物拉米夫定的方法，其特征在于，以环糊精类手性柱 作为固定相，以缓冲液磷酸三乙胺和有机改性剂作为流动相，采用正相流动相系统，在设定 的温度、流速和紫外检测波长条件下，对手性药物拉米夫定进行拆分;所述的有机改性剂为 甲醇和四氢呋喃的混合液，两者以体积比9:1混合，且在使用前使用0.22μπι的有机过滤膜进 行抽滤，并用超声波进行5~lOmin的脱气处理。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的环糊精类手性柱的填料为双[-6-氧-(3-脱氧柠檬酸单酯-4)]-β-环糊精，缩写为β-〇)-Β2。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液磷酸三乙胺的浓度为5乂10_ 3111〇1/1^，？!1 = 3.6-4.8，且在使用前使用0.22以111的水系膜进行抽滤，并用超声波进行5~ lOmin的脱气处理。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相中缓冲液磷酸三乙胺:有机改 性剂的体积比为40-50% :60-50%。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的正相流动相系统的正相柱再生方法 为：依次以20~30倍的色谱柱体积的正乙烷、异丙醇、二氯甲烷和甲醇(B栗，100%体积)作 为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗;本发明使用的色谱柱体积为8mL，则上述 每种流动相的使用体积应为200mL(取25倍），以lmL/min的流速进行清洗，即每种流动相冲 洗色谱柱200min，且正乙烷、异丙醇、二氯甲烷和甲醇在使用前均需用0.22μπι的有机过滤膜 进行抽滤，并用超声波进行5~lOmin的脱气处理。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的手性药物拉米夫定的浓度为2.26 X ΙθΛιοΙ/L，进样量为 20yL。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的温度为22-25 °C。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流速为0.5-1. OmL/min。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的紫外检测波长为260-275nm。
【文档编号】G01N30/02GK105974003SQ201610263354
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】滕钜海
【申请人】滕钜海