一种检测水产品中加替沙星对映体的方法

文档序号:10611430阅读:268来源:国知局
一种检测水产品中加替沙星对映体的方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测水产品中加替沙星对映体的方法,本发明对固相萃取条件进行了优化,使得固相萃取的时间缩短、效率变高,而高效液相色谱方法分析加替沙星对映体的浓度精度高,速度快,操作简单、成本较低;检测方法对目标化合物的线性关系好,回收率高,相对偏差小,使用的试剂低毒,使用量少,对环境友好。
【专利说明】
一种检测水产品中加替沙星对映体的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种快速高效检测水产品中加替沙星对映体的方法。
【背景技术】
[0002]加替沙星为8-甲氧氟喹诺酮类外消旋化合物,体外具有应谱的抗革兰氏阴性和阳性微生物的活性,其R-和S-对映体抗菌活性相同。本品抗菌作用是通过抑制细菌的DNA旋转酶和拓扑异构酶IV,从而抑制细菌DNA复制、转录和修复过程。对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体、衣原体和军团杆菌等都有很好的抑制作用,此外,加替沙星还具有吸收良好、抑菌浓度低、抗菌活性高、不易产生耐药菌、低毒等优点,目前已在水产养殖中使用。
[0003]目前手性药物对映体的常用分离方法有结晶法、动力学方法、酶拆分法和色谱法等,这些方法应用广泛,促进了手性药物的研究和发展。然而,这些方法也存在一些不足之处,如结晶法操作繁琐、分离时间长、适用性窄,酶拆分法对酶的专一性有较高要求,分离成本较高,而色谱拆分法是目前应用最广泛的一种方法。

【发明内容】

[0004]本发明的目的在于为了解决现有结晶法检测加替沙星对映体成本高、分离时间长,适用性窄,操作复杂,精度不高的缺陷而提供一种快速、精度高,操作简单、成本较低的检测水产品中加替沙星对映体的方法。
[0005]为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种检测水产品中加替沙星对映体的方法,包括以下步骤:
1)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将加替沙星溶解并稀释配置成40-50yg/mL的溶液,并用微孔滤膜过滤;
2)取匀浆后的水产品置于离心管中,加入步骤I)配置的加替沙星溶液,料液比为Ig:120-150mL,振荡后加入硫酸铵及单乙醇胺,8000-12000rpm离心处理10-15min,取上清液,残渣用单乙醇胺溶解并离心处理,合并上清液备用;
3)在步骤2)的上清液中加入上清液体积2-3倍的正己烷溶液,静置分层后弃正己烷层,将剩余溶液过柱萃取,萃取完成后用去离子水淋洗,负压抽干,分2-5次洗脱,洗脱后的溶液在氮吹仪内于30-35°C水浴中,氮气吹干,残余物用乙醇复溶,微孔纳滤,滤液备用;
4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测;检测时选用CHIRALCELOD-H手性柱,该手性柱的填料为5μ硅胶表面涂布纤维素-L-4-羟基异亮氨酸。在本技术方案中,本发明所用的萃取方法效果好,时间短,降低了试剂的消耗量。
[0006]作为优选,步骤3)中,依次用甲醇、二氯乙酸甲酯,含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱。
[0007]作为优选,水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为5-6.5%,柠檬酸铁铵的质量分数为0.4-0.7% 0
[0008]作为优选,步骤3)洗脱液为含体积分数15%的甲醇溶液,过柱的流速为6-9mL/min,洗脱液流速为1.2-1.5mL/min。
[0009]作为优选,纤维素-L-4-羟基异亮氨酸的制备方法为:将纤维素纤维放入45_55°C的质量分数为25-30%的氢氧化钾溶液中,然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物,55-85kw的功率下超声处理20-30min,然后升温至150°C,加入纤维素纤维质量10倍的L-4-羟基异亮氨酸,反应2-4h,冷却后水洗,用醋酸中和至中性。
[0010]作为优选,纤维素纤维为粘胶纤维或棉纤维。
[0011]作为优选,硫酸铵的加入量为水产品的质量的3倍,单乙醇胺的加入量为Ig水产品加入20mL。
[0012]作为优选,高效液相色谱的条件为:色谱柱:CHIRALCEL0D-H;流动相:正己烷-乙醇(20:80,v/v,乙醇中含有体积比为0.4 %的冰乙酸和0.5 %的三乙胺);流速:0.7mL/min ;检测波长:294nm ;进样量:20yL ;柱温:25 °C。
[0013]本发明的有益效果是本发明对固相萃取条件进行了优化,使得固相萃取的时间缩短、效率变高,而高效液相色谱方法分析加替沙星对映体的浓度精度高,速度快,操作简单、成本较低;检测方法对目标化合物的线性关系好,回收率高,相对偏差小,使用的试剂低毒,使用量少,对环境友好。
【附图说明】
[0014]图1为实施例1的色谱图。
[0015]图中,I为左加替沙星;2为右加替沙星。
【具体实施方式】
[0016]下面通过【具体实施方式】对本发明做进一步的描述。
[0017]在本发明中,若非特指,所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的,下述实施例中的方法,如无特别说明,均为本领域常规方法。
[0018]高效液相色谱仪Agilent1200购自安捷伦(中国)科技有限公司;水浴氮吹仪WD-12购自河南天驰仪器设备有限公司;固相萃取仪HSE-12B购自天津市恒奥科技发展有限公司;固相萃取柱Waters Oasis HLB购自杭州伽钛科学仪器有限公司;冰乙酸(分析纯)、三乙胺(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司;加替沙星购自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司。
[0019]高效液相色谱的条件为:色谱柱:CHIRALCEL 0D-H;流动相:正己烷-乙醇(20:80,v/v,乙醇中含有体积比为0.4%的冰乙酸和0.5%的三乙胺);流速:0.7mL/min;检测波长:294nm ;进样量:20yL ;柱温:25 °C。
[0020]实施例1
一种检测水产品中加替沙星对映体的方法,包括以下步骤:
1)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将加替沙星溶解并稀释配置成50yg/mL的溶液,并用微孔滤膜过滤;
2)取匀浆后的水产品置于离心管中,加入步骤I)配置的加替沙星溶液,料液比为Ig:150mL,振荡后加入硫酸钱及单乙醇胺,12000rpm离心处理15min,取上清液,残渣用单乙醇胺溶解并离心处理,合并上清液备用;硫酸铵的加入量为水产品的质量的3倍,单乙醇胺的加入量为I g水产品加入20mL ;
3)在步骤2)的上清液中加入上清液体积3倍的正己烷溶液,静置分层后弃正己烷层,将剩余溶液过柱萃取,萃取完成后用去离子水淋洗,负压抽干,分5次洗脱,洗脱液为含体积分数15%的甲醇溶液,洗脱液流速为1.5mL/min,洗脱后的溶液在氮吹仪内于35°C水浴中,氮气吹干,残余物用乙醇复溶,微孔纳滤,滤液备用;依次用甲醇、二氯乙酸甲酯,含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱;水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为6.5%,柠檬酸铁铵的质量分数为0.7%;过柱的流速为9mL/min;
4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测;检测时选用CHIRALCELOD-H手性柱,该手性柱的填料为5μ硅胶表面涂布纤维素-L-4-羟基异亮氨酸。
[0021]纤维素-L-4-羟基异亮氨酸的制备方法为:将粘胶纤维或棉纤维放入55°C的质量分数为30%的氢氧化钾溶液中,然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物,85kw的功率下超声处理30min,然后升温至150°C,加入纤维素纤维质量10倍的L-4-羟基异亮氨酸,反应4h,冷却后水洗,用醋酸中和至中性。
[0022]实施例2
一种检测水产品中加替沙星对映体的方法,包括以下步骤:
1)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将加替沙星溶解并稀释配置成40yg/mL的溶液,并用微孔滤膜过滤;
2)取匀浆后的水产品置于离心管中,加入步骤I)配置的加替沙星溶液,料液比为Ig:120mL,振荡后加入硫酸钱及单乙醇胺,8000rpm离心处理lOmin,取上清液,残渣用单乙醇胺溶解并离心处理,合并上清液备用;硫酸铵的加入量为水产品的质量的3倍,单乙醇胺的加入量为I g水产品加入20mL ;
3)在步骤2)的上清液中加入上清液体积2倍的正己烷溶液,静置分层后弃正己烷层,将剩余溶液过柱萃取,萃取完成后用去离子水淋洗,负压抽干,分2次洗脱,洗脱液为含体积分数15%的甲醇溶液,洗脱液流速为1.2mL/min,洗脱后的溶液在氮吹仪内于30°C水浴中,氮气吹干,残余物用乙醇复溶,微孔纳滤,滤液备用;依次用甲醇、二氯乙酸甲酯,含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱;水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为5%,柠檬酸铁钱的质量分数为0.4% ;过柱的流速为6mL/min;
4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测;检测时选用CHIRALCELOD-H手性柱,该手性柱的填料为5μ硅胶表面涂布纤维素-L-4-羟基异亮氨酸。
[0023]纤维素-L-4-羟基异亮氨酸的制备方法为:将粘胶纤维或棉纤维放入45°C的质量分数为25%的氢氧化钾溶液中,然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物,55kw的功率下超声处理20min,然后升温至150°C,加入纤维素纤维质量10倍的L-4-羟基异亮氨酸,反应2h,冷却后水洗,用醋酸中和至中性。
[0024]实施例3
一种检测水产品中加替沙星对映体的方法,包括以下步骤:
I)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将加替沙星溶解并稀释配置成45yg/mL的溶液,并用微孔滤膜过滤;
2)取匀浆后的水产品置于离心管中,加入步骤I)配置的加替沙星溶液,料液比为Ig:130mL,振荡后加入硫酸钱及单乙醇胺,9000rpm离心处理12min,取上清液,残渣用单乙醇胺溶解并离心处理,合并上清液备用;硫酸铵的加入量为水产品的质量的3倍,单乙醇胺的加入量为I g水产品加入20mL ;
3)在步骤2)的上清液中加入上清液体积3倍的正己烷溶液,静置分层后弃正己烷层,将剩余溶液过柱萃取,萃取完成后用去离子水淋洗,负压抽干,分3次洗脱,洗脱液为含体积分数15%的甲醇溶液,洗脱液流速为1.3mL/min,洗脱后的溶液在氮吹仪内于33°C水浴中,氮气吹干,残余物用乙醇复溶,微孔纳滤,滤液备用;依次用甲醇、二氯乙酸甲酯,含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱;水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为5.4%,柠檬酸铁铵的质量分数为0.5 % ;过柱的流速为7mL/min;
4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测;检测时选用CHIRALCELOD-H手性柱,该手性柱的填料为5μ硅胶表面涂布纤维素-L-4-羟基异亮氨酸。
[0025]纤维素-L-4-羟基异亮氨酸的制备方法为:将粘胶纤维或棉纤维放入50°C的质量分数为28%的氢氧化钾溶液中,然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物,65kw的功率下超声处理24min,然后升温至150°C,加入纤维素纤维质量10倍的L-4-羟基异亮氨酸,反应3h,冷却后水洗,用醋酸中和至中性。
[0026]分别称取Img左加替沙星、右加替沙星,置于10mL容量瓶中,用空白海水定容,超声摇匀后,实施例1的步骤经高效液相色谱仪检测后,所得色谱图示于图1。
[0027]加替沙星对映体浓度在0.04mg/L-10mg//L范围内与其响应值呈良好的线性关系。以X表示浓度,Y表示加替沙星对映体峰面积,左加替沙星和右加替沙星的回归方程及相关系数分别为7=113.93叉-7.2217、妒=0.9994及7 = 117.71叉-9.9342、1?2 = 0.9998。在空白海水中添加0.lmg/L、5mg/L和15mg/L这3个浓度的加替沙星标准溶液,按本方法进行回收率实验。每个添加浓度平行操作3次,计算回收率和精密度,左加替沙星及右加替沙星的样品平均回收率分别为88.53 %和89.26 %,日间精密度分别为分别为5.71 %和4.25 %,定量限均为0.04mg/Lo
【主权项】
1.一种检测水产品中加替沙星对映体的方法,其特征在于,包括以下步骤: 1)用体积比90%:10%的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将加替沙星溶解并稀释配置成40-50yg/mL的溶液,并用微孔滤膜过滤; 2)取匀浆后的水产品置于离心管中,加入步骤I)配置的加替沙星溶液,料液比为Ig:120-150mL,振荡后加入硫酸铵及单乙醇胺,8000-12000rpm离心处理10-15min,取上清液,残渣用单乙醇胺溶解并离心处理,合并上清液备用; 3)在步骤2)的上清液中加入上清液体积2-3倍的正己烷溶液,静置分层后弃正己烷层,将剩余溶液过柱萃取,萃取完成后用去离子水淋洗,负压抽干,分2-5次洗脱,洗脱后的溶液在氮吹仪内于30-35°C水浴中,氮气吹干,残余物用乙醇复溶,微孔纳滤,滤液备用; 4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测;检测时选用CHIRALCELOD-H手性柱,该手性柱的填料为5μ硅胶表面涂布纤维素-L-4-羟基异亮氨酸。2.根据权利要求1所述的一种检测水产品中加替沙星对映体的方法,其特征在于,步骤3)中,依次用甲醇、二氯乙酸甲酯,含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱。3.根据权利要求2所述的一种检测水产品中加替沙星对映体的方法,其特征在于,水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为5-6.5%,柠檬酸铁铵的质量分数为0.4-0.7%。4.根据权利要求1或2所述的一种检测水产品中加替沙星对映体的方法,其特征在于,步骤3)洗脱液为含体积分数15 %的甲醇溶液,过柱的流速为6-9mL/min,洗脱液流速为1.2-1.5mL/min05.根据权利要求1或2或3所述的一种检测水产品中加替沙星对映体的方法,其特征在于,纤维素-L-异亮氨酸的制备方法为:将纤维素纤维放入45-55 V的质量分数为25-30 %的氢氧化钾溶液中,然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物,55-85kw的功率下超声处理20-30min,然后升温至150°C,加入纤维素纤维质量1倍的L-异亮氨酸,反应2-4h,冷却后水洗,用醋酸中和至中性。6.根据权利要求5所述的一种检测水产品中加替沙星对映体的方法,其特征在于,纤维素纤维为粘胶纤维或棉纤维。7.根据权利要求1或2或3所述的一种检测水产品中加替沙星对映体的方法,其特征在于,硫酸铵的加入量为水产品的质量的3倍,单乙醇胺的加入量为I g水产品加入20mL。8.根据权利要求1或2或3所述的一种检测水产品中加替沙星对映体的方法,其特征在于,高效液相色谱的条件为:色谱柱:CHIRALCEL 0D-H;流动相:正己烷-乙醇(20:80,v/v,乙醇中含有体积比为0.4%的冰乙酸和0.5%的三乙胺);流速:0.7mL/min;检测波长:294nm;进样量:20yL;柱温:25°C。
【文档编号】G01N30/06GK105974024SQ201610394961
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月5日
【发明人】杨立业, 欧阳小琨, 王阳光, 金如娜, 王艳飞, 卢娇
【申请人】浙江海洋大学
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