一种同时测定连花清瘟胶囊中六种环烯醚萜苷类成分的方法
【专利摘要】本发明公开了一种同时测定连花清瘟胶囊中六种环烯醚萜苷类成分的方法，首次基于DSPE?HPLC法同时检测连花清瘟胶囊中六种不同结构环烯醚萜苷类成分即马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛，使用该方法线性相关系数均大于0.999，检出限为0.024?0.061μg/mL，各目标成分回收率在92.7％～98.5％之间，相对标准偏差(RSD)在0.85％～1.91％范围内，具有有机溶剂用量少、净化和浓缩效果好、目标物回收率高、灵敏度高易操作等特点。本发明发展了一套适合含金银花的中成药中环烯醚萜苷类成分的快速、高效的提取、净化和分析方法，为对进一步研究中成药作用机制、建立质量标准，提高药材及相关成药质量控制水平，指导临床应用具有重要意义。
【专利说明】
一种同时测定连花清瘟胶囊中六种环烯醚萜苷类成分的方法
技术领域
[0001] 本发明属于医药分析技术领域，具体涉及一种同时测定连花清瘟胶囊中六种环烯 醚萜苷类成分的方法。
【背景技术】
[0002] 连花清瘟胶囊是2003年"非典"期间通过国家绿色通道审批的新药，是在中医络病 理论指导下，汲取古代中医药智慧，结合现代抗病毒、抑菌、提高免疫等研究成果创制而成 的中成药。连花清瘟胶囊是国家中药保护品种，其主要功效为清瘟解毒，宣肺泄热。用于治 疗流行性感冒属热毒袭肺证，近年来，多家科研机构对连花清瘟胶囊进行了大量科学研究， 证明了它的广谱抗病毒作用，尤其对甲型流感病毒(H1N1、H3N2)、禽流感病毒(H5N1、H9N2)、 乙型流感病毒、腺病毒、疱疹病毒等均有较强抑制杀灭作用。此外，这一药物还可有效抑制 多种细菌。因其疗效显著，已被列入国家中药保护品种。2015年，连花清瘟胶囊获批进入美 国FDA进行二期临床研究。
[0003] 连花清瘟胶囊以连翘、金银花、炙麻黄、炒苦杏仁、石膏、板蓝根、绵马贯众、鱼腥 草、广藿香、大黄、红景天等十余味中药配伍精制而成，成分相对复杂，产品质量受原料药影 响很大。因此如何建立一套评价体系，提高连花清瘟胶囊等中成药质量控制水平，对于临床 应用具有重要意义。
[0004] 在连花清痕胶囊中，金银花等药材中含有丰富的环稀醚砲苷类化合物，近年来，不 断有研究证明，环烯醚萜苷类化合物具有抗病毒、抗菌、抗氧化、保肝利胆、抗肿瘤、抗炎、增 强免疫等多种活性，因此开展对连花清瘟胶囊中环烯醚萜苷类成分的高效提取和分析方法 研究，对进一步研究其作用机制、建立质量标准，提高药材及相关成药质量控制水平显然具 有重要意义。然而由于连花清瘟胶囊所含化学成分种类较多、极性差异大，包含黄酮、有机 酸、环烯醚萜苷、皂苷等多种化学成分；同时，且加工过程中药用辅料的使用，造成其化学成 分更为复杂。因此，结合环稀醚砲苷类成分的结构特点，发展适合金银花成药中环稀醚砲苷 类成分的快速、高效的提取、净化和分析方法亟待解决。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术的不足，本发明提供一种同时测定连花清瘟胶囊中六种环烯醚 萜苷类成分的方法，所述六种环烯醚萜苷为马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子 苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛的方法，该方法操作简便、样品净化效果好，分析结果准确 且重复性好。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种同时测定连花清痕胶囊中六种环稀醚砲苷类成分的方法，测定的六种环稀醚 萜苷类成分是马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙 缩醛，具体步骤如下：
[0008] (1)取出连花清瘟胶囊中药粉，称取一定量药粉待用；
[0009] (2)向步骤(1)中的药粉中加入提取溶剂，摇匀后进行超声提取得上清液；
[0010] (3)向步骤(2)中的上清液中加入净化剂，涡流振荡；
[0011] (4)经步骤(3)处理后的上清液用微孔滤膜过滤得提取液；
[0012] (5)分别精密称取马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖 苷二甲基乙缩醛对照品，加50%甲醇溶解，制成浓度为200yg/mL混合标准溶液;使用时，按 一定比例逐级稀释，待用。
[0013] (6)将步骤（4)得到的提取液进行高效液相色谱分析，色谱条件如下：色谱柱： Kromasi 1 Cis(4 · 6 X 250mm，5μπι);流速：0 · 5-1 · OmL/min;检测波长：200-250nm;柱温：25-30 °C ;流动相:0.4%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱；
[0014] (7)以外标法进行连花清瘟胶囊中六种环烯醚萜苷类成分的定量分析，即以已知 浓度的环烯醚萜苷类的色谱峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对提取 液进行测定，测得检出提取液中六种环烯醚萜苷类成分的色谱峰面积，代入标准曲线，求得 连花清瘟胶囊中马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基 乙缩醛的含量。
[0015] 优选的，所述步骤(2)中提取溶剂为50%乙醇;所述药粉与提取溶剂的质量体积比 1 g: 30-50ml，进一步优选的，所述药粉与提取溶剂的质量体积比为1 g: 40ml;
[0016] 优选的，所述步骤(2)中超声提取时间为0.5-2min，进一步优选的，超声提取时间 为lmin;
[0017]优选的，所述步骤(3)中加入的净化剂为娃藻土和活性炭混合物;进一步优选的， 所述娃藻土和活性炭的质量比为90:10;
[0018]优选的，所述步骤(3)中所述净化剂与上清液的质量体积比为45-55g: 1ml;进一步 优选的，所述净化剂与上清液的质量体积比为50g: lml;
[0019] 优选的，所述步骤(3)中涡流振荡时间为0.5-2min;进一步优选的，所述涡流振荡 时间为lmin;
[0020] 优选的，所述步骤(4)中微孔滤膜规格为0.22μπι;
[0021] 优选的，所述步骤(6)中流速为0.8mL/min;检测波长为240nm;柱温:25°C ;
[0022] 优选的，所述步骤（6)中梯度洗脱程序如下：0~15min，10%~14%乙腈；15~ 35111；[11，14%~25%乙臆；35~45111；[11，25%~50%乙臆；45~50111；[11，50%~100%乙臆；50~ 65min，100% 乙臆。
[0023] 本发明还公开了上述方法在对含金银花成分中成药进行质量评价的应用。
[0024]本发明首次建立了分散固相萃取-高效液相色谱(DSPE-HPLC)法同时检测连花清 瘟胶囊中六种不同结构环烯醚萜苷类成分即马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱 子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛，使用该方法线性相关系数均大于0.999,检出限为 0.024-0.061yg/mL，各目标成分回收率在92.7 %~98.5 %之间，相对标准偏差（RSD)在 0.85 %~1.91 %范围内，本发明具有有机溶剂用量少、净化和浓缩效果好、目标物回收率 高、灵敏度高易操作等特点。
[0025] 本发明克服了现有技术的缺陷和条件的限制，对样品前处理方法和仪器检测条件 进行了优化，与现有技术相比本发明具有如下有益效果：
[0026] (1)本发明将六种不同结构环烯醚萜苷类成分即马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、 断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基乙缩醛经过分散固相处理的前处理方式，同时使用 高效液相色谱仪进行测定，大大节约了仪器设备与成本，可以满足不同条件实验室的工作 需求。
[0027] (2)本发明样品前处理流程简单，大大缩短了每个测试样品的检测时间，降低了分 析成本，有效避免死吸附现象发生，本发明采用分散固相萃取(DSPE)作为前处理技术，减少 了有机溶剂的使用量，缩短了前处理时间，使实验操作更加简便、快捷。
[0028] (3)本发明具有检测灵敏度高、准确及重现性好等优点。
[0029] 总之，本发明发展了一套适合含金银花的中成药中环烯醚萜苷类成分的快速、高 效的提取、净化和分析方法，为对进一步研究中成药作用机制、建立质量标准，提高药材及 相关成药质量控制水平，指导临床应用具有重要意义。
【附图说明】
[0030] 图1为混合对照品(A)、连花清瘟胶囊提取物(B)的HPLC图；
[0031] 其中，1为马钱酸色谱峰，2为莫诺苷色谱峰，3为马钱苷色谱峰，4为当药苷色谱峰， 5为断氧化马钱子苷色谱峰，6为开联番木鳖苷二甲基乙缩醛色谱峰。
【具体实施方式】
[0032]结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本 发明，并不对其内容进行限定。
[0033] 实施例1
[0034] -种同时测定连花清痕胶囊中六种环稀醚砲苷类成分的方法：
[0035] 1仪器与材料
[0036] Agilent 1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；KQ2400KDE型高功率数控超 声波仪，昆山市超声仪器有限公司；R201型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；BSA1245-CW型精密天平，德国Sartorius公司;Milli-Q(18.2MQ )超纯水处理系统，美国Millipore公 司。
[0037]甲醇(色谱纯)购于美国Tedia公司；乙腈(色谱纯)购于德国Merck公司；甲酸(色谱 纯)购于德国Riede 1公司；其余试剂均为分析纯，实验用水为Mi 11 i-Q超纯水（18.2M Ω )。购 置于天津大茂化学试剂厂;硅藻土(色谱用）、活性炭(色谱用)聚酰胺(30~60目，柱色谱)均 购置于国药集团化学试剂有限公司。
[0038]本实验所采用的连花清瘟胶囊购于山东省济南市漱玉平民大药房。6种环烯醚萜 苷化合物对照品（马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二甲基 乙缩醛）均由实验室分离制备，结构经过波谱数据鉴定，峰面积归一化法质量分数均大于 98% 〇
[0039] 2.样品提取液制备
[0040] 准确称取l.Og连花清瘟胶囊样品置于三角烧瓶中，加入50%乙醇40mL，提取lmin， 取2mL上清液，加净化剂娃藻土-活性炭(90:10) 100mg，祸流振荡lmin，过0.22μηι滤膜后，取3 yL样品提取液，供HPLC分析。
[0041 ] 3.对照品溶液的制备
[0042]分别精密称取马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二 甲基乙缩醛对照品2. Omg，置于10mL棕色容量瓶中，加50 %甲醇溶解，定容，摇匀，制成浓度 为200yg/mL混合标准溶液。使用时，按比例逐级稀释，待用。
[0043] 4.高效液相色谱条件
[0044] HPLC分析，进样体积3yL。具体色谱条件为:Kromasil Cis柱(4.6_X 250mm，5ym)， 流动相：0.4 %甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱程序:0~15min，10 %~14%乙腈；15~35min， 14%~25%乙臆；35~45111；[11，25%~50%乙臆；45~50111；[11，50%~100%乙臆；50~65111；[11， 100 %乙腈。检测波长240nm，流速0 · 8mL/miη，柱温25 °C。
[0045] 5.测定结果计算
[0046] 以外标法进行连花清瘟胶囊中六种环烯醚萜苷类成分的定量分析，即以已知浓度 的环烯醚萜苷类的色谱峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对提取液进 行测定，测得检出提取液中六种环烯醚萜苷类成分的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品 中马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩醛的含量。 实验结果如表1所示。
[0047] 表1样品中环稀醚砲苷的测定结果
[0048]
[0049] 6.方法学考察
[0050]在本研究优化的测定条件下，以连花清瘟胶囊药粉提取物中各环烯醚萜苷类成分 的保留时间和峰面积为考察指标，对该方法的精密度、重复性、稳定性和加标回收率分别进 行了考察。精密度试验表明，各环烯醚萜苷类成分保留时间的RSD值在0.45%~0.87%，峰 面积的RSD值在0.71 %~1.68%。重复性试验表明，各环烯醚萜苷类成分保留时间的RSD值 均低于0.91%，峰面积的RSD值均低于3.93%。2处内稳定性试验表明，各环烯醚萜苷类成分 保留时间的RSD值均低于0.95%，峰面积的RSD值均低于3.67%。加标回收率试验表明，各环 烯醚萜苷类成分加标回收率在92.7 %~98.5 %，RSD值在0.85 %~1.91 %。以上数据说明， 该方法具有较好的精密度、稳定性和重现性，可以用于连花清瘟胶囊中环烯醚萜苷类成分 的准确测定。
[0051 ] 实施例2
[0052] 如实施例1所述，选择另一连花清瘟胶囊样品2,实验结果见表2。
[0053] 表2样品中环稀醚砲苷的测定结果
[0054]
[0055] 实施例3
[0056] 如实施例1所述，选择另一连花清瘟胶囊样品3,实验结果见表3。
[0057] 表3样品中环烯醚萜苷的测定结果
[0058]
[0059] 上述虽然结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护 范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员 不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一种同时测定连花清痕胶囊中六种环稀醚砲苷类成分的方法，其特征在于，测定的 六种环烯醚萜苷类成分分别是马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番 木鳖苷二甲基乙缩醛，测定步骤如下： (1) 取出连花清瘟胶囊中药粉，称取一定量药粉待用； (2) 向步骤(1)中的药粉中加入提取溶剂，摇匀后进行超声提取得上清液； (3) 向步骤(2)中的上清液中加入净化剂，涡流振荡； (4) 经步骤(3)处理后的上清液用微孔滤膜过滤得提取液； (5) 分别精密称取马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷、开联番木鳖苷二 甲基乙缩醛对照品，加甲醇溶解，制成混合标准溶液;使用时，按一定比例逐级稀释，待用。 (6) 将步骤(4)得到的提取液进行高效液相色谱分析，色谱条件如下:色谱柱:Kromasil C18(4 · 6 X 250mm，5μπι);流速：0 · 5-1 · OmL/min;检测波长：200-250nm;柱温：25-30°C ;;流动 相:0.4 %甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱； (7) 以外标法进行连花清瘟胶囊中六种环烯醚萜苷类成分的定量分析，即以已知浓度 的环烯醚萜苷类的色谱峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对提取液进 行测定，测得检出提取液中六种环烯醚萜苷类成分的色谱峰面积，代入标准曲线，求得连花 清瘟胶囊中马钱酸、莫诺苷、马钱苷、当药苷、断氧化马钱子苷和开联番木鳖苷二甲基乙缩 醛的含量。2. 如权利要求1所述的一种同时测定连花清瘟胶囊中六种环烯醚萜苷类成分的方法， 其特征在于，所述步骤(2)中提取溶剂为50%乙醇;所述药粉与提取溶剂的质量体积比lg: 30-50ml，进一步优选的，所述药粉与提取溶剂的质量体积比为1 g: 40ml。3. 如权利要求1所述的一种同时测定连花清瘟胶囊中六种环烯醚萜苷类成分的方法， 其特征在于，所述步骤（2)中超声提取时间为0.5-2min，进一步优选的，超声提取时间为 lmin〇4. 如权利要求1所述的一种同时测定连花清瘟胶囊中六种环烯醚萜苷类成分的方法， 其特征在于，所述步骤(3)中加入的净化剂为娃藻土和活性炭混合物;优选的，所述娃藻土 和活性炭的质量比为90:10。5. 如权利要求1所述的一种同时测定连花清瘟胶囊中六种环烯醚萜苷类成分的方法， 其特征在于，所述步骤(3)中所述净化剂与上清液的质量体积比为45-55g: lml;优选的，所 述净化剂与上清液的质量体积比为50g: lml。6. 如权利要求1所述的一种同时测定连花清瘟胶囊中六种环烯醚萜苷类成分的方法， 其特征在于，所述步骤(3)中祸流振荡时间为0.5-2min;进一步优选的，所述祸流振荡时间 为lmin〇7. 如权利要求1所述的一种同时测定连花清瘟胶囊中六种环烯醚萜苷类成分的方法， 其特征在于，所述步骤(4)中微孔滤膜规格为0.22mm。8. 如权利要求1所述的一种同时测定连花清瘟胶囊中六种环烯醚萜苷类成分的方法， 其特征在于，所述步骤(6)中流速为0.8mL/min;检测波长为240nm;柱温:25 °C。9. 如权利要求1所述的一种同时测定连花清瘟胶囊中六种环烯醚萜苷类成分的方法， 其特征在于，所述步骤(6)中梯度洗脱程序如下：0~15111；[11，10%~14%乙腈 ；15~351]1；[11， 14%~25%乙臆；35~45111；[11，25%~50%乙臆；45~50111；[11，50%~100%乙臆；50~65111；[11， 100%乙腈。10.如权利要求1-9任意一项所述方法在对含金银花成分中成药进行质量评价的应用。
【文档编号】G01N30/14GK105974029SQ201610542884
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】赵恒强, 王岱杰, 王晓, 耿岩玲, 崔莉, 于金倩, 宋祥云
【申请人】山东省分析测试中心