用于检测大肠杆菌o157:h7的夹心型免疫层析试纸的制作方法
【专利摘要】本发明一种用于检测大肠杆菌O157:H7的夹心型免疫层析试纸，包括一个支撑层，支撑层的上侧面上设置有吸附层，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测线和质控线，检测线由抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成，质控线由羊抗或兔抗小鼠IgG抗体、或羊抗兔IgG抗体构成，荧光抗体纤维层上吸附有荧光抗体，荧光抗体由FITC标记的抗大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成。本发明还公开了上述夹心型免疫层析试纸的制备方法。本发明的试纸检测方法简单，特异性强，灵敏度高，直观，准确，最低可检测1CFU/mL的痕量污染。
【专利说明】
用于检测大肠杆菌0157: H7的夹心型免疫层析试纸
技术领域
[0001 ]本发明属于生物工程领域，涉及一种免疫层析试纸，特别是一种用于检测大肠杆 菌0157:H7的夹心型免疫层析试纸。
【背景技术】
[0002] 大肠杆菌0157:H7型(Escherichia coli 0157:H7)是一种肠道出血性大肠杆菌， 是主要食源致病菌之一。由大肠杆菌〇157:H7引起的肠道感染性疾病已经成为全球关注的 公共卫生问题。大肠杆菌0157:H7感染能引起出血性结肠炎(HC)，阑尾炎和结肠穿孔等严重 胃肠道并发症，严重的可引起血栓性血小板紫癜(TTP)和溶血性尿路综合症(HUS)等全身性 并发症，其中3-5 %病人死亡，约有12 %病人有严重的后遗症。而且人的感染剂量极低，摄入 10-100个活菌就可引起发病。近年来，大肠杆菌0157: H7在我国食品样本，尤其是动物肉制 品中检出率较高。在福建、北京、广东等省市的多种食品中都检测到了该菌。大肠杆菌0157: H7对外界环境具有较强适应性，对温度、pH和干燥有一定的抗性，可以在食物、沙土、水、肥 料和人工微环境中存活长达数月。
[0003] 目前大肠杆菌0157 :H7快速检测方法主要包括生化方法、分子生物学方法、生物传 感器、代谢学方法和免疫学方法等。生化方法耗时耗力，而且容易漏检自然变异株。分子生 物学方法由于其操作复杂对设备依赖度高，加之检测的准确性和重复性有待提高等原因， 故在致病菌的检测、诊断领域尚未得到广泛应用。生物传感器检测技术与传统的检测方法 相比具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在线检测等优点，但它往往需要光学 或化学原件，检测需要仪器辅助，检测成本较高。代谢组学方法方便、灵敏，具有极大的应用 潜力，但只能用于菌落总数鉴定，不能用于菌种鉴定。免疫学方法是基于抗原-抗体的特异 性结合反应发展而成的蛋白质水平上的系列检测方法，主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)、 乳胶凝集反应、免疫层析技术和蛋白芯片技术。免疫层析试纸技术在检测速度和方便性是 最为优越的免疫学检测方法。
[0004] 免疫层析试纸目前的主要发展方向是提高灵敏度、定量检测和多元检测。针对灵 敏度问题目前所采用的方法归为两类:采用纯度高、亲和力强的单克隆抗体和采用新型标 记物。上转换荧光纳米颗粒、量子点和荧光微球等为代表的新型发射光谱型标记物，光学特 性优良，纳米材料发光强度高，将它们功能化后与致病菌抗体的氨基偶联，形成稳定的发光 复合体，借助特定光源通过检测光信号强度便可将灵敏度得以一定程度的提高。但这些新 材料的制备工艺较复杂，成本较高，原材料难以获取，离实际应用距离甚远。
[0005] 荧光标记物FITC是目前应用最为广泛的荧光素，它的最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长为525-530nm，呈现明亮的黄绿色焚光，在pH为9.0-9.5的条件下可 与氨基进行反应形成硫脲，FITC荧光标记技术较为成熟，标记方法简单易行，但其作为标记 物应用于免疫层析试纸并未研究。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于检测大肠杆菌〇157:H7 的夹心型免疫层析试纸，所述的这种用于检测大肠杆菌〇157:H7的夹心型免疫层析试纸要 解决现有技术中检测食品中大肠杆菌〇157:H7的方法灵敏度不高、检测时间长、检测过程复 杂的技术问题。
[0007] 本发明提供了一种用于检测大肠杆菌〇157:H7的夹心型免疫层析试纸，包括一个 支撑层，所述的支撑层的上侧面上设置有吸附层，所述的吸附层从测试端依次为吸附纤维 层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，所述的吸附纤维层和应该抗体纤 维层紧密连接，所述的荧光抗体纤维层和所述的纤维素膜层紧密连接，所述的纤维素膜层 和所述的吸水材料层紧密连接，在纤维素膜层上设有检测线和质控线，所述的检测线由抗 大肠杆菌〇157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成，所述的质控线由羊抗或兔抗小鼠 IgG抗 体、或羊抗兔IgG抗体构成，所述荧光抗体纤维层上吸附有荧光抗体，所述的荧光抗体由 FITC标记的抗大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成。
[0008] 进一步的，所述的吸附层的上端设置有保护层，
[0009]进一步的，所述的FITC标记的抗大肠杆菌0157 :H7的单克隆抗体或多克隆抗体的 制备方法包括如下步骤：
[0010] (1)一个配置交联反应液的步骤，在每升反应液中加入7.56g NaH⑶3，1.06g Na2C03和7.36g NaCl，余量为超纯水，将纯化后的抗大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体于4°C对 交联反应液中透析2~4次，至pH=9.0;
[0011] (2)将透析后的反应液转移至反应容器中，放于磁力搅拌器上，按照抗大肠杆菌 015 7: H7的单克隆抗体:FITC的量为lmg: 150yg的比例滴加 FITC的DMS0溶液，避光，4 °C反应 过夜，加入5mol/L的NH4CI 4°C至终浓度为5mmol/L，终止反应2h;
[0012] ⑶将交联物在PBS中透析8次以上，至透析液清亮，4°C暗处保藏备用。
[0013] 进一步的，所述的吸附纤维层的材料为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚 酯膜中的任意一种;所述荧光抗体纤维层的材料为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜 或聚酯膜中的任意一种;所述的吸水材料层的材料为吸水滤纸，所述的支撑层的材料为不 吸水的韧性材料;所述的纤维素膜层的材料为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜 中的任意一种。
[0014] 进一步的，所述检测线中的隐形检测印迹和质控线中的隐形对照印迹为平行排列 的? Γ直线式印迹，或为"十十"字型排列印迹，或为"π"字型排列印迹，或为字型 排列印迹，或为"卜卜"字型排列印迹，或为Μ十'字型排列印迹，或为点状排列印 迹。
[0015] 进一步的，在所述吸附纤维层、荧光抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在 吸附纤维层与荧光抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向吸 附纤维层一侧0.3-0.7cm。
[0016] 本发明还提供了上述的一种用于检测大肠杆菌0157:H7的夹心型免疫层析试纸的 制备方法，包括以下步骤：
[0017] 1) 一个制备大肠杆菌0157: H7单克隆抗体或多克隆抗体的步骤；
[0018] 2)-个制备荧光抗体的步骤；
[0019] 3)-个制备吸附纤维层的步骤，所述的吸附纤维层采用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏 二氟乙烯膜或聚酯膜制成；
[0020] 4)-个制备荧光抗体纤维层的步骤，在所述的荧光抗体纤维层上吸附有荧光抗 体；
[0021] 5)-个制备纤维素膜层的步骤，所述的纤维素膜层采用硝酸纤维素膜、纯纤维素 膜或羧化纤维素膜，用点样仪在纤维素膜上喷点检测印迹，烘干后备用；
[0022] 6)-个组装试纸的步骤，将吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层、吸水材料 层从左至右依次贴在带有粘合剂的支撑层上，依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸。
[0023] 进一步的，所述的吸附纤维层的制备方法如下：将玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟 乙烯膜或聚酯膜浸入TBS缓冲溶液中，所述的缓冲溶液的浓度为0.01M，pH为7.8，所述的缓 冲溶液中，还含有PVP、蔗糖、Tw-20、BSA，在所述的缓冲溶液中，PVP的质量百分比浓度为 0.5%，蔗糖的质量百分比浓度为1%，Tw-20的质量百分比浓度为0.5%，BSA的质量百分比 浓度为1 %，以浸湿为准，冻干，备用。
[0024] 本发明还提供了采用上述的夹心型免疫层析试纸检测大肠杆菌0157:H7的方法， 包括如下步骤：
[0025] 1)样品前增菌:将FITC溶于DMS0,在增菌培养基中加入FITC溶液，再加入样品进行 增菌培养；
[0026] 2)试纸检测：将试纸插入样品溶液，10~20秒后拿出平放，5-10min后通过观察检 测试纸的检测线有无荧光，判断样品中是否含有大肠杆菌〇157:H7,或通过荧光读条仪进行 半定量分析。
[0027]本发明的试纸具有以下优点：
[0028] (1)制作简单、成本低、特异性强，灵敏度高。本发明试纸及检测方法将免疫荧光技 术与免疫层析技术相结合，待检样品中的目标大肠杆菌0157:H7经带有FITC的增菌培养基 培养后便可发荧光，无需任何标记流程、制作成本低、光稳定性强，将FITC标记抗体引入试 纸后，达到了抗原抗体双重信号放大的效果，能获得比普通胶体金试纸更高的灵敏度。且 FITC标记成本较胶体金低。该试纸条保持了传统胶体金试纸条简便快速、灵敏度高、特异性 好的的优点，最低可检测lCFU/mL的痕量污染。
[0029] (2)简便、快速。该试纸可对食品样品增菌处理后直接检测，在紫外光下直接观测 结果，也可借助荧光阅读器直接读值，实现半定量检测。检测时只需将试纸插入被检样品10 ~20秒，5-10min内即可判定检测结果，省时省力，操作简便，一步完成。
[0030] (3)结果显示形象、直观、准确。试纸条以显示黄绿色?"和? Γ (或"十"、"丁"、 "1"、"K'、"十' "·"）印迹作为检测的阴性和阳性标记，即在纤维素膜上显示一条黄绿色 ?"印迹，表示被检样品中不含大肠杆菌〇157:H7;显示两条黄绿色? Γ印迹，表示被检样品 中含有大肠杆菌〇157:H7。此结果可用肉眼直接观测，判定形象、直观、准确，简单明了，不易 出现假阳性和假阴性等人为误判。
[0031] (4)节省费用。该试纸条检测时无需另配仪器设备和其它试剂，可随时随地进行检 测，既能定性检测又能定量检测;检测费用低廉，能节省大量贵重仪器和设备的投入费用。
[0032] (5)适用范围广，便于推广应用。该试纸能满足不同层次人员的需要，包括专业化 验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、畜产品加工、养殖户以及消费者个人等，既适于单个样 品的检测，又适于大量样品的筛查，能应用于疾病诊断、细菌检测和环境检测等领域。本发 明在保障食品安全、保护消费者健康方面具有极其重要意义，具有明显的经济效益和社会 效益。
[0033]本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的试纸及其检测方法简单， 特异性强，灵敏度高，直观，准确，可进行定性和半定量检测，最低可检测lCFU/mL的痕量污 染，适用范围广，成本低，易于推广应用。
【附图说明】
[0034] 图1夹心型试纸原理图。
[0035]图2夹心型试纸的结构示意图。
[0036]图3夹心型试纸的俯视图结构示意图。
[0037]图4夹心型试纸的灵敏度检测结果。
[0038]图5夹心型试纸半定量分析结果。
[0039]图6夹心型试纸交叉反应实验结果。
[0040]图7夹心型试纸模拟带菌实验结果。
【具体实施方式】 [0041 ] 实施例1
[0042]本发明试纸的制备过程包括:大肠杆菌0157:H7单克隆或多克隆抗体的制备、吸附 纤维层的制备、纤维素膜层的制备和试纸条的组装等步骤。
[0043] (1)抗大肠杆菌0157 :H7单克隆抗体或多克隆抗体的制备
[0044] 单抗制备：以灭活的浓度为108cfu/mL的大肠杆菌0157:H7全菌免疫6~8周龄 Balb/C小鼠3~4次，每次免疫间隔时间3~5周，确定抗体效价符合要求后超强免疫，之后3 ~4天，将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清;脱颈致死，用75%的酒精浸泡小鼠5~lOmin 消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，lOOOrpm离心10min， 收集脾细胞。将1X10 8的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，lOOOrpm离心10min， 弃上清，细胞沉淀物于37°C水浴中缓缓加入0.7~1. OmL大肠杆菌0157 :H7的50%PEG4000， 作用lmin，然后缓缓加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37°C水浴5~lOmin， lOOOrpm离心10min，弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养 板孔（l〇〇yL~200yL/孔），置于37°C、5%C0 2培养箱中培养10~14天，用间接ELISA法进行阳 性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化，而后扩大培 养，建立杂交瘤细胞株所制备的杂交瘤细胞，分泌的单克隆抗体可特异地与大肠杆菌0157: H7反应，亲和力常数达到101()~1012,针对大肠杆菌0157:H7特异抗原决定簇的单克隆抗体， 用于T线的印制。（本实施例只是为了描述单克隆抗体的制备过程，任何市售的与大肠杆菌 0157:H7反应的单克隆抗体在本发明中都可以使用）
[0045]多抗制备：用灭活的大肠杆菌0157:H7免疫新西兰白兔，免疫原浓度为108cfu/mL， 背部皮下分4~6点注射。首免，免疫原中加入弗式完全佐剂，充分乳化;加强免疫，免疫原中 加入弗氏不完全佐剂，充分乳化，首免后2~3周进行连续免疫4~5次，每次间隔2~3周，最 后一次免疫后10~15天，以间接ELISA测其定效价达到10 5以上时，采血并分离收集高免血 清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，即取1份高免血清加2份PBS(pH7.2)混匀，加等体积 饱和硫酸铵溶液混匀，置4 °C冰箱12h，4 °C、2500rpm离心15min，弃上清；再以适量PBS (p Η 7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度3 3 %，置4 °C冰箱2 h，4 °C、2 5 0 0 r p m离心 15min，弃上清；以适量PBS (pH7.2)溶解沉淀，置4 °C冰箱内用PBS (pH7.2)透析48~72h，中间 换液数次，4°C、12000rpm离心15min，收集上清，得纯化的抗大肠杆菌0157: H7多克隆抗体，-20°C冻存，用于T线的印制。
[0046] (2)荧光抗体纤维层(结合垫)的制备
[0047] 荧光抗体纤维层的制备，首先需要制备FITC荧光抗体，具体步骤为：
[0048] 1)配置交联反应液：7.56g NaHC03，1.06g Na2C03,7.36g NaCl，加超纯水定容至 1L。将纯化后的单抗于4°C对交联反应液透析3次，至pH=9.0。
[0049] 2)将透析后的反应液转移至玻璃瓶放于磁力搅拌器上，按照抗体:FITC的量为 lmg:150yg的比例滴加 FITC的DMS0溶液，避光，4°C反应过夜。加入5mol/L的NH4CI 4°C至终 浓度为5mmol/L，终止反应2h。
[0050] 3)将交联物在PBS中透析8次以上，至透析液清亮。4°C暗处保藏备用。
[0051]其次，用点样仪在纤维层膜上喷点FTIC抗体，制作荧光迹带，于37°C避光烘干备 用。
[0052] (3)吸附纤维层(样品垫)的制备
[0053]测试端吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯PVDF膜或聚酯膜制备，将 纤维材料剪成宽1.5cm的条带，将其放入样品垫处理液中浸泡30min，于37 °C烘干，备用。 [0054] (4)纤维素膜层(分析垫)的制备
[0055] 纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜，剪切成宽1.5cm规格的 条带，用点样仪在纤维素膜上喷点大肠杆菌0157 :H7单克隆抗体或多克隆抗体和羊抗或兔 抗小鼠 IgG抗体或羊抗兔IgG抗体，制作隐形的检测印迹带和对照印迹带，于37°C烘干备用。
[0056] (5)夹心型试纸的组装:将吸附纤维层(样品垫）、荧光抗体纤维层(结合垫）、纤维 素膜层(分析膜）、吸水材料层从右至左依次贴在带有粘合剂的支撑层(底板)上，并切成3-4cm宽的试纸条即可。（如图1B所示）。
[0057] (6)本发明试纸条的检测反应原理：
[0058]当检测大肠杆菌0157:H7试纸测试端插入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作 用带动待测发光大肠杆菌〇157:H7向纤维素膜层扩散，并最终渗入手柄端的吸水材料层。在 扩散过程中，待测大肠杆菌0157 :H7可与结合垫上的FITC荧光抗体形成FITC-菌-抗体-FITC 的复合物，流至T线时又会被其上的大肠杆菌0157:H7抗体捕获从而显示检测印迹，在紫外 线激发下（或使用荧光阅读器直接读值)形成黄绿色检测印迹带?"，即为阳性表示；反之 样品溶液中无大肠杆菌〇157:H7时，则不能与结合垫上的荧光抗体结合，并与纤维素膜上的 大肠杆菌〇157:H7抗体检测印迹结合，不显示黄绿色检测印迹带即为阴性表示;无论样 品是否含有大肠杆菌0157 :H7，FITC荧光抗体都会与纤维素膜上的羊抗或兔抗小鼠 IgG(或 羊抗兔IgG)抗体捕获，形成一个黄绿色对照印迹带?"（如图1C所示）。
[0059] 本发明的夹心型免疫层析试纸的检测方法如下：
[0060] (1)样品前增菌:样品采集后应尽快检验。若不能即使检测，可在2_4°C保存18h。无 菌操作取样25g(mL)加入到含有FTIC溶液的225mLEC或NB肉汤中，将上述溶液放入均质器 中，在拍击式均质器上连续均质l-2min，或放入盛有225mLEC或NB肉汤（含FITC)的均质杯 中，8000-10000r/min均质l-2min，于37°C培养若干小时（如图1A所示）。同时做阳性及阴性 对照。
[0061] (2)试纸检测:将试纸插入样品溶液，10~20秒后拿出平放，5-10min后通过观察检 测试纸的检测线有无荧光，判断样品中是否含有大肠杆菌〇157:H7,或通过荧光读条仪进行 半定量分析。
[0062] 以下实施例具体说明试纸条的结构和检测方法。
[0063] 实施例2
[0064] 参见图2、图3。
[0065] 图中1为支撑层，用塑胶薄片条制成，2为吸附纤维层，用玻璃纤维棉制成，荧光抗 体纤维层3上吸附有FITC荧光单克隆抗体，纤维素膜层4采用硝酸纤维素膜，手柄端的吸水 材料层5用吸水滤纸制成，将吸附纤维层2、荧光抗体纤维层3、纤维素膜层4、吸水材料层5各 层从右至左依次粘贴固定在支撑层1上，彼此之间交界处纤维互相交叉渗透。在纤维素膜层 4上设有隐形检测印迹6,用大肠杆菌0157:H7单克隆抗体制成；隐形对照印迹7用羊抗小鼠 IgG抗体溶液在纤维素膜上印迹制成两条印迹带平行排列，形成组合印迹带
[0066] 8-1为覆盖在吸附纤维层2和荧光抗体纤维层3上面的样品端白色保护膜，8-2为覆 盖在吸水材料层5上面的其它颜色保护膜(如黄色），9为样品标记线，该标记线位于吸附纤 维层2与荧光抗体纤维层3交界处对应的白色保护膜偏向吸附纤维层2-侧约0.5cm处，在标 记线右侧保护膜上印有箭头及max字样。
[0067] (1)本发明试纸灵敏度检测：将大肠杆菌0157: H7单菌落接种于含有0.4mg/mL的 FITC培养基中培养，采用平板计数法计数，将菌液分别稀释为108-104CFU/mL，用夹心型试纸 检测，5-10min后在紫外灯下观察检测结果，目测最低检测限（L0D)为T线可见时的最低菌 浓度，结果如图4所示，试纸的L0D为10 6CFU/mL。用荧光读条仪对试纸进行半定量分析，结果 如图5所示，试纸在菌浓度为105_10 8CFU/mL时呈线性相关，且L0D为105CFU/mL。
[0068] (2)本发明试纸特异性检测：采用交叉反应试验鉴定其特异性。将浓度为108CFU/ mL的常见食源性致病菌，如表1所示，用夹心型试纸检测，若为阳性即有交叉，检测结果如图 6所示，大肠杆菌夹心型试纸只能检出三株大肠杆菌，其他常见食源性致病菌均不能检出， 即该试纸具有较好的特异性。
[0069] 表1交叉反应所用的常见食源性致病菌及来源
[0070]
[0071]
[0072] (3)本发明试纸稳定性的测定:对同一批次的夹心型试纸密封后加入干燥剂，避光 放置于4°C。在保存1天，1、5、10、15和20周后分别检测其灵敏度，结果表明保存20周后的试 纸的灵敏度与保存1天后的无变化，故该试纸至少可在4°C保存20周而保持性能稳定。
[0073] (4)模拟带菌实验：从本地超市购买面包、牛奶、果冻样品，用PCR法鉴定三种样品 均无大肠杆菌〇157:H7污染。以无菌操作取每种样品25g至于带FITC的225mL培养基中培养， 培养基中加入活菌溶液使菌浓度为lCFU/mL，培养瓶放于37 °C摇床培养，每隔2h取样检测， 结果如图7所示。结果表明面包、牛奶样品培养10h后可检出，果冻培养8h可检出；夹心型试 纸可检出初始菌浓度为lCFU/mL的样品。
[0074] 实施例3
[0075] 试纸条结构和实施例1相同。不同之处在于：荧光抗体纤维层3吸附有FITC标记的 抗大肠杆菌〇157:H7多克隆抗体，吸附纤维层2用尼龙膜制成，纤维素膜层4采用纯纤维素 膜，隐形印记为羊抗兔IgG抗体。隐形检测印迹带和隐形对照印迹带均为"十"，8-2为覆盖在 吸水材料层5上面的手柄端兰色保护膜。
[0076] 待测样品的制备及检测操作步骤：
[0077] 检测面包:无菌操作取样25g加入到含有FTIC溶液的225mLEC或NB肉汤中，将上述 溶液放入均质器中，在拍击式均质器上连续均质l-2min，于37°C培养若干小时。
[0078]操作方法:将试纸插入样品溶液，10~20秒后拿出平放，5-10min后通过观察检测 试纸的检测线有无荧光，判断样品中是否含有大肠杆菌〇157:H7,或通过荧光读条仪进行半 定量分析。
[0079]结果判定：（a)阳性如果在纤维素膜上显示有两条黄绿色印迹带"十"，表示检测结 果为阳性，说明在待测样品中含有大肠杆菌〇157:H7;(b)阴性如果在纤维素膜上显示有一 条黄绿色印迹带"十"，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含大肠杆菌〇157:H7;(c) 失效如果在纤维素膜上没有黄绿色条带显示，则表明试纸条已失效。
[0080] 实施例4
[0081]试纸结构和实施例2基本相同，不同之处在于：纤维素膜层3吸附有抗大肠杆菌 0157:H7的多克隆抗体，吸附纤维层2用尼龙膜制成，纤维素膜层3采用纯纤维素膜，隐形检 测印迹为6-2为覆盖在吸水材料层4上面的手柄端绿色保护膜。
[0082]用于检测牛奶样:无菌操作取样25mL加入到含有FTIC溶液的225mLEC或NB肉汤中， 将上述溶液放入均质器中，放入盛有225mLEC或NB肉汤(含FITC)的均质杯中，8000-10000r/ min均质l_2min，于37 °C培养若干小时。
[0083] 操作方法:将试纸插入样品溶液，10~20秒后拿出平放，5-10min后通过荧光阅读 器直接读值，数值为T线的荧光强度，根据峰值或峰面积绘制标准曲线，计算实际含量。 [0084] 实施例5
[0085]试纸结构和实施例2基本相同，不同之处在于：吸附纤维层2用聚偏二氟乙烯PVDF 膜制成，纤维素膜层3采用羧化纤维素膜，6-2为覆盖在吸水材料层4上面的手柄端绿色保护 膜，隐形检测印迹带为"1"。
[0086] 用于检测果冻:样品前增菌、结果判定和操作方法均同实施例二，不重述。
[0087] 实施例6
[0088] 试纸结构和实施例2基本相同，不同之处在于:吸附纤维层2用聚酯膜制成，纤维素 膜层3采用羧化纤维素膜，隐形检测印迹带为" 。
[0089] 用于检测肉样，样品前增菌、结果判定和操作方法均同实施例二，不重述。
[0090] 实施例7
[0091] 试纸结构和实施例2基本相同，不同之处在于:吸附纤维层2用尼龙膜制成。检测印 迹带为"十'。检测样品、结果判定和操作方法同例二。
[0092] 实施例8
[0093]和实施例2基本相同，不同之处在于:纤维素膜层3吸附有抗大肠杆菌0157:Η7的多 克隆抗体，检测印迹带为" ?"。检测样品为面包样。
[0094] 实施例9
[0095]和实施例2基本相同，不同之处在于:纤维素膜层3吸附有抗大肠杆菌0157:Η7的多 克隆抗体，检测样品为牛奶样。
[0096] 实施例8
[0097]和实施例2基本相同，不同之处在于:纤维素膜层3吸附有抗大肠杆菌0157:Η7的多 克隆抗体，检测样品为果冻样。
[0098] 实施例10
[0099]和实施例2基本相同，不同之处在于:纤维素膜层3吸附有抗大肠杆菌0157:Η7的多 克隆抗体，检测样品为肉样。
【主权项】
1. 一种用于检测大肠杆菌〇157:H7的夹屯、型免疫层析试纸，包括一个支撑层，所述的支 撑层的上侧面上设置有吸附层，所述的吸附层从测试端依次为吸附纤维层、巧光抗体纤维 层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，所述的吸附纤维层和应该抗体纤维层紧密连接，所 述的巧光抗体纤维层和所述的纤维素膜层紧密连接，所述的纤维素膜层和所述的吸水材料 层紧密连接，在纤维素膜层上设有检测线和质控线，其特征在于:所述的检测线由抗大肠杆 菌0157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成，所述的质控线由羊抗或兔抗小鼠 IgG抗体、或 羊抗兔IgG抗体构成，所述巧光抗体纤维层上吸附有巧光抗体，所述的巧光抗体由FITC标记 的抗大肠杆菌〇157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成。2. 根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌0157:H7的夹屯、型免疫层析试纸，其特征在 于:所述的吸附层的上端设置有保护层。3. 根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌0157:H7的夹屯、型免疫层析试纸，其特征在 于:所述的FITC标记的抗大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法包括如 下步骤， (1) 一个配置交联反应液的步骤，在每升反应液中加入7.56g化H(X)3，1.06g化2(X)3和 7.36g NaCl，余量为超纯水，将纯化后的抗大肠杆菌0157: H7的单克隆抗体于4°C对交联反 应液中透析2~4次，至pH=9.0; (2) 将透析后的反应液转移至反应容器中，放于磁力揽拌器上，按照抗大肠杆菌0157: H7的单克隆抗体:FITC的量为lmg:15化g的比例滴加 FITC的DMS0溶液，避光，4°C反应过夜， 加入5mol/L的NH4C1 4°C至终浓度为5mmol/L，终止反应化； (3) 将交联物在PBS中透析8次W上，至透析液清亮，4°C暗处保藏备用。4. 根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌0157:H7的夹屯、型免疫层析试纸，其特征在 于:所述的吸附纤维层的材料为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氣乙締膜或聚醋膜中的任意一 种;所述巧光抗体纤维层的材料为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氣乙締膜或聚醋膜中的任意 一种;所述的吸水材料层的材料为吸水滤纸，所述的支撑层的材料为不吸水的初性材料;所 述的纤维素膜层的材料为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或簇化纤维素膜中的任意一种。5. 根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌0157:H7的夹屯、型免疫层析试纸，其特征在 于:所述检测线中的隐形检测印迹和质控线中的隐形对照印迹为平行排列的? Γ'直线式印 迹，或为"十十"字型排列印迹，或为"-Γ T"字型排列印迹，或为《-L _L"字型排列印迹，或 为l· K字型排列印迹，或为? Η "字型排列印迹，或为"??"点状排列印迹。6. 根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌0157:Η7的夹屯、型免疫层析试纸，其特征在 于:在所述吸附纤维层、巧光抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在吸附纤维层与巧 光抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向吸附纤维层一侧 0.3-0.7cm。7. 权利要求1所述的用于检测大肠杆菌0157:H7的夹屯、型免疫层析试纸的制备方法，其 特征在于包括W下步骤： 1) 一个制备大肠杆菌〇157:H7单克隆抗体或多克隆抗体的步骤； 2) -个制备巧光抗体的步骤； 3) -个制备吸附纤维层的步骤，所述的吸附纤维层采用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氣 乙締膜或聚醋膜制成； 4) 一个制备巧光抗体纤维层的步骤，在所述的巧光抗体纤维层上吸附有巧光抗体； 5) -个制备纤维素膜层的步骤，所述的纤维素膜层采用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或 簇化纤维素膜，用点样仪在纤维素膜上喷点检测印迹，烘干后备用； 6) -个组装试纸的步骤，将吸附纤维层、巧光抗体纤维层、纤维素膜层、吸水材料层从 左至右依次贴在带有粘合剂的支撑层上，依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸。8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的吸附纤维层的制备方法如下:将 玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氣乙締膜或聚醋膜浸入TBS缓冲溶液中，所述的缓冲溶液的浓 度为0.01M，抑为7.8，所述的缓冲溶液中，还含有PVP、薦糖、Tw-20、BSA，在所述的缓冲溶液 中，PVP的质量百分比浓度为0.5%，薦糖的质量百分比浓度为l%，Tw-20的质量百分比浓度 为0.5%，BSA的质量百分比浓度为1%，W浸湿为准，冻干，备用。9. 采用权利要求1所述的夹屯、型免疫层析试纸检测大肠杆菌0157:H7的方法，其特征在 于包括如下步骤： 1) 样品前增菌:将FITC溶于DMSO,在增菌培养基中加入FITC溶液，再加入样品进行增菌 培养； 2) 试纸检测：将试纸插入样品溶液，10~20秒后拿出平放，5-lOmin后通过观察检测试 纸的检测线有无巧光，判断样品中是否含有大肠杆菌0157: H7，或通过巧光读条仪进行半定 量分析。
【文档编号】G01N33/569GK105974113SQ201610288500
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】宋春美, 刘箐, 刘金鑫, 李建武
【申请人】上海理工大学