一种母乳中拉莫三嗪的检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种母乳中拉莫三嗪的检测方法，包括以下步骤：(1)供试品制备：取供试母乳，加入5倍体积的乙酸乙酯混匀，离心，取乙酸乙酯层，吹干，复溶，作为供试品；(2)检测：取步骤(1)的供试品用高效液相色谱进行检测，检测条件为：固定相：C18色谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体积比为45:55，所述无机盐溶液的pH为4.5；检测波长：265nm。本发明方法可以准确检测母乳中拉莫三嗪，并且检测方法快速简便，专属性强，灵敏度高，稳定性好，可用于临床检测母乳中拉莫三嗪的浓度，为服用拉莫三嗪的哺乳期妇女喂母乳提供指导。
【专利说明】
-种母乳中拉莫H瞎的检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物药物分析领域，具体设及一种母乳中拉莫=嗦的检测方法。
【背景技术】
[0002] 拉莫立嗦（lamotrigine，LTG,商品名：利必通）是苯=嗦类新一代广谱抗癒痛药 物，拉莫S嗦化学名称为3, 5-二氨基-6- (2, 3-二氯苯基）-as- S叮嗦，分子式为
[0003] 由于大量临床观察研究发现该药物没有明显的胎儿致崎副作用，也不会影响女性 的生殖和月经，还同时是一种情感稳定剂，因此，该药物成了全世界妊娠期女性的推荐抗癒 痛药物。然而，因哺乳期妇女服用拉莫=嗦W后，母乳中是否含有拉莫=嗦W及含有的拉莫 =嗦浓度均不清楚，导致很多服用拉莫=嗦的癒痛女性不敢给孩子喂母乳，最后只能直接 选择奶粉喂养，增加了癒痛患者家庭的经济负担，最重要的是奶粉不含母乳所含的所有免 疫成分，而且奶粉喂养也不能替代母乳喂养在培养亲子感情方面的重要作用。因此，有效检 测母乳中的拉莫=嗦具有重要意义。
[0004] 目前尚没有关于检测母乳中拉莫=嗦方法的报道。
【发明内容】
[0005] 为了解决前述问题，本发明的目的在于提供了一种母乳中拉莫S嗦的检测方法。
[0006] 本发明提供了一种母乳中拉莫=嗦的检测方法，它是采用高效液相色谱法进行 检测，包括W下步骤：（1)供试品制备：取供试母乳，加入5倍体积的乙酸乙醋混匀，离屯、， 取乙酸乙醋层，吹干，复溶，作为供试品；（2)检测：取步骤（1)的供试品用高效液相色谱 进行检测，检测条件为：固定相：C18色谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体积比为 45:55,所述无机盐溶液的抑为4. 5 ;检测波长：265皿。
[0007] 进一步优选地，所述检测方法是定量检测方法，步骤如下：a、供试品制备：取供试 母乳，加入5倍体积的乙酸乙醋混匀，离屯、，取乙酸乙醋层，吹干，复溶，作为供试品；b、标准 品制备：取空白母乳，加入1/9倍体积的拉莫=嗦标准品溶液，混匀得标样母乳，再加入标 样母乳5倍体积的乙酸乙醋，混匀，离屯、，取乙酸乙醋层，吹干，复溶，作为标准品；C、检测： 取步骤a的供试品和步骤b的标准品，用高效液相色谱进行检测，检测条件为：固定相：C18 色谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体积比为45:55,所述无机盐溶液的抑为4. 5 ; 检测波长：265nm ;d、绘制标准曲线，计算供试母乳中拉莫S嗦的含量。
[000引母乳：是产后女性乳房产生的用作哺育婴儿的汁液。
[0009] 空白母乳：是指来自于未服用拉莫S嗦妇女的母乳。
[0010] 进一步优选地，所述步骤（1)、步骤a或步骤b中，离屯、的转速是4000;r/min，离屯、 的时间为lOmin。
[0011] 进一步优选地，所述步骤（1)、步骤a或步骤b中，吹干是在50°C条件下用氮气吹 干。
[0012] 进一步优选地，所述步骤（1)、步骤a或步骤b中，复溶是采用步骤（2)中的流动相 复溶。
[001引进一步优选地，所述步骤似或步骤C中，所述C18色谱柱的规格为 ISOmmX4. 6mm，填料粒径为 5 y m。
[0014] 进一步优选地，所述步骤（2)或步骤C中，所述流动相中，无机盐溶液是浓度为 0. 05mol/L的憐酸二氨钟溶液。 阳015] 进一步优选地，所述步骤（2)或步骤C中，流动相的流速1. 0血/min。
[0016] 进一步优选地，所述步骤（2)或步骤C中，检测的柱溫为37°C。
[0017] 高效液相色谱是检测领域常用的检测方法，但是由于母乳本身的成分复杂，干扰 杂质多，会干扰拉莫=嗦的测定，而且拉莫=嗦在母乳中的代谢产物也会干扰拉莫=嗦的 测定，另外，由于母乳中拉莫=嗦的浓度低，不易富集，检测难度大。比如，
【申请人】在前期实 验中发现用紫外分光光度计在190-900nm对拉莫S嗦进行紫外扫描，显示其最大吸收波 长为207. 94nm，然而，在该波长下检测，却存在很多干扰峰，无法准确检测。
[0018] 本发明通过特定的前处理方法与特定高效液相色谱检测条件的结合，达到了准确 检测母乳中拉莫=嗦的目的，并且，本发明方法快速简便，专属性强，灵敏度高，稳定性好， 可用于临床检测母乳中拉莫=嗦的浓度，为服用拉莫=嗦的哺乳期妇女喂母乳提供指导。
[0019] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可W做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0020] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0021] 图1为按本发明实施例1方法对空白母乳进行检测所得的高效液相色谱图。
[0022] 图2为按本发明实施例1方法对加入了拉莫=嗦标准品的标样母乳进行检测所得 的高效液相色谱图，LTG为拉莫S嗦。
[0023] 图3为按本发明实施例1方法对加供试母乳进行检测所得的高效液相色谱图，LTG 为拉莫=嗦。
[0024] 图4为按本发明试验例2方法所得的标准曲线图。
[00巧]图5为按本发明试验例6抗干扰实验所得的高效液相色谱，图中1为拉莫=嗦的 峰、2为氯霉素的峰、3为丙戊酸钢的峰。
【具体实施方式】
[00%] 本发明【具体实施方式】中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。 具体如下：实验材料：拉莫二嗦标准品100775-200401，中国药品生物制品检定所；甲醇：分 析纯（20120921)，成都市科龙化工试剂厂；憐酸二氨钟：分析纯（20091010)，成都市科龙化 工试剂厂；乙酸乙醋：分析纯（20120414)，成都市科龙化工试剂厂。主要实验仪器：高效液 相色谱仪：LC-20AB，日本岛津公司；紫外扫描仪：UV-VIS282PC，化ico仪器有限公司。供试 母乳来自服用了拉莫=嗦妇女的母乳。
[0027] 实施例1本发明定量检测方法 阳02引 （1)供试品的制备：取供试母乳200化，置于1.5血离屯、管中，加入1血乙酸乙 醋，旋满混合20s，4000r/min离屯、lOmin，吸取上层乙酸乙醋层于1. 5血离屯、管中，在50°C 水浴下用氮气吹干，加入100 y L流动相（流动相为甲醇-憐酸二氨钟化05mol/l，pH4. 5) (45:55)，）后旋满混合20s，作为供试品。
[0029] 似标准品的制备：取空白母乳180化，置于1. 5血离屯、管中分别加入浓度为5， 10,20,50,100和150 y g/mL拉莫=嗦标准品溶液20 y以旋满混合20s，使拉莫=嗦浓度分 别为0. 5, 1，2, 5, 10, 15 y g/mL，作为标样母乳。向该标样母乳中加入1血乙酸乙醋，旋满混 合20s，4000r/min离屯、lOmin，吸取上层乙酸乙醋层于1. 5血离屯、管中，在50°C水浴下用氮 气吹干，加入100 y L流动相后旋满混合20s，作为标准品。
[0030] 做分别取供试品和标准品进行检测，进样量为20化，色谱条件如下：色谱柱为 Diamonsil C18 巧 ym 150mmX4.6mm)，流动相为甲醇-憐酸二氨钟化 05mol/L，pH4.5) (45:55)，等度洗脱；柱溫为37°C ;流速为1. OmL/min ;检测波长为265nm。
[0031] (4)制作拉莫=嗦浓度与峰面积的标准曲线，根据标准曲线，计算供试母乳中拉莫 =嗦的含量。
[0032] 实施例2本发明定性检测方法 阳03引 （1)供试品的制备：取供试母乳200化，置于1. 5血离屯、管中，加入1血乙酸乙 醋，旋满混合20s，4000;r/min离屯、lOmin，吸取上层乙酸乙醋层于1. 5血离屯、管中，在50°C 水浴下用氮气吹干，加入100 y L流动相（流动相为甲醇-憐酸二氨钟化05mol/l，pH4. 5) (45:55))后旋满混合20s，作为供试品。
[0034] (2)取供试品进行检测，进样量为20 iiL色谱条件如下：色谱柱为Diamonsil C18巧yml50mmX4.6mm)，流动相为甲醇-憐酸二氨钟a).05mol/^，pH4.5)(45:55)，等度 洗脱；柱溫为37°C ;流速为1. O血/min ;检测波长为265皿。
[0035] 为进一步说明本发明方法的有益效果，本发明提供W下试验例。
[0036] 试验例1系统适用性和专属性实验
[0037] 取空白母乳、加入了拉莫S嗦（浓度为10 y g/mL)标准品的标样母乳和供试母乳 按实施例1中的方法测定，所得色谱图分别如图1、图2及图3所示。可W看出，拉莫=嗦的 出峰时间为5. lOmin，附近没有杂质峰的干扰，证明本发明的方法分离度好，无内源性杂质 干扰，且出峰时间短，检测效率高。 阳03引试验例2灵敏度和准确度检测
[0039] 对实施例1标样母乳的高效液相色谱测定结果如表1所示，W浓度Y对样品峰 面积X线性回归，得拉莫S嗦的标准曲线方程Y = (2. 7090496 °°5)X-9. 9377136 °°2巧= 0.9999, n = 3)，标准曲线图如图4所示。证明按照本发明的方法，母乳中拉莫S嗦检出限 可达0. 50 y g/mU灵敏度高，且在0. 50~15. OO y g/mL浓度范围内线性关系良好，准确度 好。
[0040] 表 1 [0041 ]
[0042] 试验例3精密度实验
[0043] 按照实施例1中步骤似的方法制备拉莫S嗦浓度分别为0. 5、5、15 y g/血的标 样母乳各5份，分别作为低、中、高=种浓度的标样母乳。按照实施例1中的方法，在同一天 内和同一周内分别对上述5份低、中、高=种浓度的标样母乳进行测定并计算其日内精密 度值和日间精密度值。上述低、中、高=种浓度的标样母乳日内RSD (n = 5)分别为5. 03%、 4. 80 %、4.47% ;日间RSD (n = 5)分别为7. 78 %、9. 84%、4. 90%，说明本发明的方法精密 度好。
[0044] 试验例4回收率实验 W45] 按照实施例1中步骤似的方法制备拉莫S嗦浓度分别为0. 5、5、15 y g/mL的标 样母乳各5份，分别作为低、中、高=种浓度的标样母乳。按照实施例1中的方法，测定浓度 与实际配置浓度之比计算回收率。上述低、中、高=种浓度的标样母乳平均回收率分别为 85. 20 %、105. 08 %、98. 72 %，其 RSD (n = 5)分别为 7. ：34 %、6. 65 %、5. 52 %，平均回收率均 大于85%，说明本发明的方法准确度好。
[0046] 试验例5稳定性实验
[0047] 按照实施例1中步骤似的方法制备拉莫S嗦浓度分别为0. 5、5、15 y g/mL的标 样母乳各5份，分别作为低、中、高立种浓度的标样母乳。置于4°C冰箱中保存10天后，按照 实施例1中的方法测定拉莫=嗦的浓度并计算RSD值，室溫放置化、地和-20°C冻存1周、 2周后分别进行测定，其低、中、高=浓度的平均回收率分别为93. 5%，102. 2%，100. 4%， RSD(n = 5)分别为3. 47%，5. 77%，4. 42%，未见拉莫=嗦降解，说明本发明的方法稳定性 好。
[0048] 试验例6抗干扰性实验
[0049] 拉莫=嗦临床常与抗癒痛药物左乙拉西坦、丙戊酸钢、奥卡西平联合使用，因此 有必要进行拉莫S嗦的抗干扰性实验。取空白母乳120 y L，置于1. 5mL离屯、管中，加入浓 度均为IOOy g/mL的左乙拉西坦、丙戊酸钢、奥卡西平和拉莫=嗦标准品溶液各20 ^以旋 满混合20s，使左乙拉西坦、丙戊酸钢、奥卡西平和拉莫=嗦的浓度均为10 y g/mU作为标 样母乳。向上述标样母乳中加入40 Ji g/mL氯霉素20 Ji L及乙酸乙醋1血，旋满混合20s， 400化/min离屯、lOmin，吸取上层乙酸乙醋层850 Ji L于1. 5血离屯、管中，在50°C水浴下用氮 气吹干，加入100 y L流动相后旋满混合20s，按照实施例1中步骤（3)的方法测定，实验结 果如图5所示。可W看出，左乙拉西坦和奥卡西平无吸收，丙戊酸钢保留时间为10. 14min 与拉莫=嗦分离良好；此时拉莫=嗦峰面积为396817,计算浓度为10. 65 y g/mU相对误差 6. 50%。W上说明本发明方法在临床上的抗干扰性强。
[0050] 综上所述，本发明检测方法快速简便，专属性强，灵敏度高，精密度好，准确性高， 稳定性好，抗干扰性强，适用于临床应用。
【主权项】
1. 一种母乳中拉莫三嗪的检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法进行检 测，包括以下步骤： (1) 供试品制备：取供试母乳，加入5倍体积的乙酸乙酯混匀，离心，取乙酸乙酯层，吹 干，复溶，作为供试品； (2) 检测：取步骤（1)的供试品用高效液相色谱进行检测，检测条件为：固定相：C18色 谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体积比为45:55,所述无机盐溶液的pH为4. 5 ;检 测波长：265nm〇2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测方法是定量检测方法，步骤如 下： a、 供试品制备：取供试母乳，加入5倍体积的乙酸乙酯混匀，离心，取乙酸乙酯层，吹 干，复溶，作为供试品； b、 标准品制备：取空白母乳，加入1/9倍体积的拉莫三嗪标准品溶液，混匀得标样母 乳，再加入标样母乳5倍体积的乙酸乙酯，混匀，离心，取乙酸乙酯层，吹干，复溶，作为标准 品； c、 检测：取步骤a的供试品和步骤b的标准品，用高效液相色谱进行检测，检测条件为： 固定相：C18色谱柱；流动相：甲醇-无机盐溶液，二者的体积比为45:55,所述无机盐溶液 的pH为4. 5 ;检测波长：265nm ; d、 绘制标准曲线，计算供试母乳中拉莫三嗪的含量。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1)、步骤a或步骤b中，离心的 转速是4000r/min，离心的时间为lOmin。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1)、步骤a或步骤b中，吹干是 在50°C条件下用氮气吹干。5. 根据1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1)、步骤a或步骤b中，复溶是采用步骤 (2)中的流动相复溶。6. 根据1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2)或步骤c中，所述C18色谱柱的规格 为150mmX4. 6mm，填料粒径为5 μ m〇7. 根据1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2)或步骤c中，所述流动相中，无机盐 溶液是浓度为〇. 〇5mol/L的磷酸二氢钾溶液。8. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2)或步骤c中，流动相的流速 1. OmL/min〇9. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2)或步骤c中，检测的柱温为 37。。。
【文档编号】G01N30/02GK105987962SQ201510059160
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月4日
【发明人】陈蕾, 周东, 谢贞建
【申请人】四川大学华西医院