一种测定甘胆酸浓度的试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定甘胆酸浓度的试剂盒及方法。该试剂盒包括试剂1：包括包被抗甘胆酸单克隆抗体的乳胶颗粒；试剂2：包括包被甘胆酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒。采用本发明的试剂盒进行检测甘胆酸，可以容易地增强免疫浊度，放大检测信号，具有无需特殊仪器、操作简便、灵敏度高且成本低廉的优点，可实现临床快速、大流量的样本测试，使甘胆酸成为临床上常规检测项目成为可能，具有极高的经济价值。
【专利说明】
-种测定甘胆酸浓度的试剂盒及方法
技术领域
[0001] 本发明属于物质检验测定技术领域，具体设及一种测定甘胆酸浓度的试剂盒及方 法。
【背景技术】
[0002] 甘胆酸（化olyglycine，CG)是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一。CG正常 代谢途径为肠-肝循环，由肝细胞合成，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指 肠，帮助食物消化。95%胆酸在回肠末端重吸收，经口静脉再回肝脏，由肝细胞摄取再利用。 在血清中主要W蛋白结合形式存在，溢入体循环的总量小于1%。在正常情况下，外周血中 胆酸含量甚微，血清CG浓度稳定在较低水平。
[0003] 当肝细胞受损时，肝细胞摄取CG能力下降，致使血中CG含量增高；胆汁郁滞时，肝 脏排泄胆酸发生障碍，而返流血液循环的CG含量增高，也使血CG含量增高。因此，目前用 RIA (radioimmunoassay放射免疫测定法）法测定血清甘胆酸（SCG)是评价肝细胞功能及其 肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。
[0004] 正常人血清甘胆酸含量为1. 3 + 0. 8mg/L，范围可在0. 4~2. 98mg/L内波动，肝炎 诊断低限值为<3. 18mg/L。各类肝炎、原发性肝癌、肝硬化患者血CG均明显高于正常人，且 呈递性增高；胆石症伴黄痘患者胆管、胆囊排泄功能障碍可引起血清CG显著升高；肝硬化、 梗阻性肝病、肠-肝循环障碍血清CG水平高于正常人。
[0005] 甘胆酸是妊娠晚期血清中最主要的胆汁酸组分。正常妊娠时孕妇血清CG水平随 孕周逐步增高，至足月妊娠 CG值较非孕时增加30 %~60%。部分妊娠妇女血清CG值可出 现生理性升高，临床上并没有明显的ICP症状（妊娠期肝内胆汁渺积症）。随着CG值的升 高程度不同，对母婴有着不同程度的损伤，且CG值越高危害越大。
[0006] 目前临床应用中，甘胆酸的测定方法主要包括RIA (放射免疫分析）方法和酶联免 疫法等。上述方法的共同特点是需要特别的测定仪器，操作复杂，试验耗时较长，不能应用 于临床大流量的自动化分析，且价格昂贵。由于上述缺陷的制约，目前甘胆酸尚未成为临床 检测的常规项目。
[0007] 在常见的采用乳胶微粒增强的免疫比浊方法中，测定血清甘胆酸均采用在Rl试 剂中加入免疫比浊促进剂，在R2试剂中加入包被抗CG抗体乳胶颗粒的常规方法。众所 周知，常规免疫比浊方法，对于检测小分子抗原，很难达到临床应用所要求的准确度和灵敏 度。目前公开的文献也均未出现明显的提高反应强度的专口技术方法。如此，目前临床应 用中，甘胆酸的检测准确度和抗干扰性能一直达不到广泛应用的要求。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有的高压液相色谱法和酶联免疫法 需要特别的测定仪器，操作复杂，试验耗时较长，不能应用于临床大流量的自动化分析，且 价格昂贵；而若套用免疫比浊测定方法则甘胆酸的检测准确度低、抗干扰性能差的缺陷，提 供了一种测定甘胆酸浓度的试剂盒及方法。采用本发明的试剂盒进行检测甘胆酸，可W容 易地增强免疫浊度，放大检测信号，具有无需特殊仪器、操作简便、灵敏度高且成本低廉的 优点，可实现临床快速、大流量的样本测试，使甘胆酸成为临床上常规检测项目成为可能， 具有极高的科学和经济价值。
[0009] 本发明是通过W下技术方案解决上述技术问题的：
[0010] 本发明提供了一种测定甘胆酸浓度的试剂盒，其包括：
[0011] 试剂1:包括包被抗甘胆酸单克隆抗体的乳胶颗粒；
[0012] 试剂2 :包括包被甘胆酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒。
[0013] 较佳地，所述的试剂1包括包被抗甘胆酸单克隆抗体的乳胶颗粒、缓冲液、免疫凝 集促进剂、稳定剂和防腐剂；更佳地，所述的试剂1由包被抗甘胆酸单克隆抗体的乳胶颗 粒、缓冲液、免疫凝集促进剂、稳定剂和防腐剂组成。
[0014] 较佳地，所述的试剂2包括包被甘胆酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、缓冲液、稳 定剂和防腐剂：更佳地，所述的试剂2由包被甘胆酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、缓冲液、 稳定剂和防腐剂组成。
[0015] 其中，所述的抗甘胆酸单克隆抗体一般可通过商业化公司获得，也可W通过将甘 胆酸-惰性载体偶联物免疫小鼠，制备单抗所得；所述的惰性载体较佳地包括血蓝蛋白 KLH、卵清蛋白OVA和牛血清白蛋白BSA中的一种或多种；所述的抗甘胆酸单克隆抗体更佳 地为兔抗甘胆酸抗体，购于日本Cosmo Bio Co. ,Ltd公司。
[0016] 其中，所述的甘胆酸-惰性载体偶联物优选是将甘胆酸与惰性载体通过化学交联 剂进行化学交联获得；所述的惰性载体包括血蓝蛋白KLH、卵清蛋白OVA和牛血清白蛋白 BSA中的一种或多种；所述的化学交联剂为邸AC (1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺 盐酸盐）和/或Sulfo-NHS (N-径基硫代班巧酷亚胺）。
[0017] 其中，试剂1中，所述的包被抗甘胆酸单克隆抗体的乳胶颗粒较佳地通过下述步 骤制得：通过乳胶颗粒表面的化学基团，如簇基、氨基、琉基等，采用化学交联剂将抗甘胆酸 单克隆抗体结合到乳胶颗粒表面。本发明中采用的化学交联方法，优选采用两步交联法，W 确保悬浮缓冲液中没有残留的未结合的游离抗体，从而保证了试剂盒测定的准确性。更佳 地，所述的包被抗甘胆酸单克隆抗体的乳胶颗粒通过下述步骤制得：乳胶颗粒表面先经过 EDAC (1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和Sulfo-N服(N-径基硫代班巧酷 亚胺）活化，然后加入抗甘胆酸单克隆抗体，此时抗体的氨基端与活化后的乳胶颗粒产生 交联反应，即可；最佳地，所述的包被抗甘胆酸单克隆抗体的乳胶颗粒通过下述步骤制得： 将乳胶颗粒加入到MES (2-(N-吗嘟）乙横酸）缓冲溶液中，揽拌条件下加入邸AC (1-(3-二 甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和Sulfo-NHS (N-径基硫代班巧酷亚胺），室溫反 应，离屯、除去上清液，加入含有抗甘胆酸单克隆抗体的pH 8. 3棚酸缓冲液，室溫包被，再加 入含甘氨酸的抑8. 3棚酸缓冲液，终止反应，离屯、清洗，超声分散，即得。
[001引其中，试剂2中，所述的包被甘胆酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒较佳地通过下 述步骤制得：通过乳胶颗粒表面的化学基团，如簇基、氨基、琉基等，采用化学交联剂将甘胆 酸-惰性载体偶联物结合到乳胶颗粒表面。本发明中采用的化学交联方法，优选采用两步 交联法，W确保悬浮缓冲液中没有残留的未结合的游离抗原，从而保证了试剂盒测定的准 确性。更佳地，所述的包被甘胆酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒通过下述步骤制得：乳胶颗 粒表面先经过邸AC (I- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和Sulfo-N服(N-径基 硫代班巧酷亚胺）活化，然后加入甘胆酸-惰性载体偶联物，此时偶联物的氨基端与活化后 的乳胶颗粒产生交联反应，即可。最佳地，所述的包被甘胆酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒 通过下述步骤制得：将乳胶颗粒加入到MES (2-(N-吗嘟）乙横酸）缓冲溶液中，揽拌条件下 加入邸AC (1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和Sulfo-N服(N-径基硫代班 巧酷亚胺），室溫反应，离屯、除去上清液，加入含有甘胆酸-惰性载体偶联物的抑8. 3棚酸 缓冲液，室溫包被，再加入含甘氨酸的pH 8. 3棚酸缓冲液，终止反应，离屯、清洗，超声分散， 即得。
[0019] 其中，所述的乳胶颗粒可为试剂盒检测领域常规使用的各种乳胶颗粒，较佳地选 自粒径为50~500nm (更佳地为100~300nm)、表面带有一种化学交联基团（如氨基、簇 基、径基、琉基、酷阱基、氯甲基）的聚苯乙締核壳结构的球状聚合物；所述的乳胶颗粒可为 如化IyMicrospheres 公司的型号为 CB0172E、CB0100E、CB0213E、CB0104D 或 CB0267D 簇基 微球。
[0020] 其中，所述的乳胶颗粒的质量体积浓度（w/v，g/ml)较佳地为0. 01%~0. 5%，更 佳地为0.05%~0.3%。
[0021] 其中，所述的缓冲液可为试剂盒检测领域常规使用的各种缓冲液，所述的缓冲液 较佳地为3-(N-吗嘟基）-丙横酸缓冲液、3-(N-吗嘟基）-2-径基丙横酸缓冲液、Tris缓 冲液、憐酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种；所述的缓冲液的浓度较佳地为10~ 300mmol/L，更佳地为30~lOOmmol/L ;所述的缓冲液的抑较佳地为6~9。
[0022] 其中，所述的免疫凝集促进剂可为试剂盒检测领域常规使用的各种免疫凝集促进 剂，所述的免疫凝集促进剂较佳地包括聚乙二醇（PEG,分子量2000~20000)、硫酸葡聚糖 和聚乙締化咯烧酬中的一种或多种；所述免疫凝集促进剂的质量体积浓度（w/v，g/ml)较 佳地为0. 1~7%。
[0023] 其中，所述的稳定剂可为试剂盒检测领域常规使用的各种稳定剂，所述的稳定剂 较佳地选自20~300mmol/L甘氨酸、20~300mmol/L双甘氨肤、0. 05~1 %牛血清白蛋白、 0. 05 ~1% 吐溫-20、0. 05 ~1% Triton X-100、10 ~300mmol/L 薦糖、10 ~300mmol/L 海 藻糖、10~300mmol/L甘露糖、0. 2~20mmol/L邸TA (乙二胺四乙酸）、0. 5 %~2 %氯化钢 和1%~10%甘油中的两种或两种W上；所述的百分比为质量百分比。
[0024] 其中，所述的防腐剂可为试剂盒检测领域常规使用的各种防腐剂，所述的防腐 剂较佳地选自叠氮钢、Proclin-300中的一种或两种，所述的防腐剂的质量百分比浓度为 0. 1%~1%。
[002引较佳地，所述的试剂1的组成为：150mmol/L 3- (N-吗嘟基）-2-径基丙横酸缓冲 液抑6. 90、0.0 l %包被抗甘胆酸单克隆抗体的乳胶颗粒、0. 9 %氯化钢、0. 5%吐溫-20、 1%阳G-6000、2mmol/L邸TA、100mmol/L薦糖、20mmol/L海藻糖和0. 2%叠氮钢；所述的百 分比为质量百分比。
[0026] 较佳地，所述的试剂2的组成为：1. 5%包被甘胆酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、 30臟〇1/1甘氨酸缓冲液抑7.6、0.3%吐溫-20、0.15%?'〇(：1111-300、200111111〇1/1薦糖和 20mmol/L海藻糖；所述的百分比为质量百分比。
[0027] 其中，所述的测定甘胆酸浓度的试剂盒优选还包括试剂盒校准品和试剂盒质 控品，所述的试剂盒校准品和试剂盒质控品可为本领域常规使用的试剂盒校准品和试 剂盒质控品。较佳地，所述的试剂盒校准品组成为：40mg/L或60mg/L甘胆酸、50mmo 1 /L Tris缓冲液抑8. 2、0. 2%牛血清白蛋白、lOOmmol/L甘露糖醇、2mmol/L邸TA和0. 15% Proclin-SOO ;所述的试剂盒质控品组成为：3mg/L或lOmg/L甘胆酸、50mmol/L Tris缓冲液 pH 8. 2、0. 5%牛血清白蛋白、lOOmmol/L 甘露糖醇、2mmol/L EDTA 和 0. 15% Proclin-300 ; 所述的百分比为质量百分比。
[0028] 本发明中，所述的试剂盒质控品可W用于随时检测试剂盒反应体系的可靠性。
[0029] 本发明还提供了一种测定甘胆酸浓度的方法，其包括下述步骤：将待测样品首先 与试剂1混合，反应巧加入试剂2后，试剂1中包被抗甘胆酸单克隆抗体的乳胶颗粒与试 剂2中包被甘胆酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒的反应浊度下降；通过测定该反应浊度下 降的程度，与试剂盒校准品的反应浊度对比，即可计算出待测样品中甘胆酸的浓度。
[0030] 较佳地，所述的测定甘胆酸浓度的方法是W非疾病诊断或治疗目的的测定方法。
[0031] 本发明的构思是在试剂1中采用单株单克隆抗体，将其化学交联在乳胶颗粒载体 上，使该载体具有多点位结合抗原的能力，当与试剂2中同样交联在乳胶颗粒上的多个抗 原结合时，能形成不断叠加的凝聚物，从而大大地提高了运种抗原抗体反应的浊度。当被测 样品加入试剂1时，首先与试剂1乳胶颗粒载体上的单抗反应，掩蔽掉一定量的抗体结合 能力，因此，加入试剂2后，形成的浊度相应降低，因此可W通过测定该反应浊度下降的程 度，与试剂盒中校准品的反应浊度对比，即可计算出样品中甘胆酸的浓度。该浊度的检测能 够应用于目前临床广泛使用的自动生化分析仪，从而达到广泛、快速、大批量规模应用的特 点。
[0032] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0033] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0034] 本发明的积极进步效果在于：
[0035] (1)本发明的特点之一在于，提供了一种采用一株单克隆抗体进行多聚反应的免 疫比浊试剂方案，为体内小分子抗原的全自动检测提供了一个实用方法，可W提高反应灵 敏度。
[0036] (2)本发明优选采用两步交联法，不仅有效排除了非特异性交叉反应，而且确保悬 浮液中没有残留的未结合的游离抗原或抗体，提高了检测的准确性。
[0037] (3)本发明的另一特点之一在于，提供了一种采用一株单克隆抗体包被在乳胶颗 粒表面的免疫比浊试剂方案，从而大大提高了检测试剂的稳定性。
【具体实施方式】
[0038] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0039] 本发明所用试剂和原料均能很容易地从相关商业公司购得。
[0040] 下述实施例中无特别说明，百分比均是指质量百分比。
[00川实施例1
[0042] (I)甘胆酸-卵清蛋白偶联物的制备
[004引在1. 0血25mmol/L抑为6. 1的MES (2-吗嘟乙横酸）缓冲液中加入IOmg卵清蛋 白，快速揽拌，加入甘胆酸，缓慢滴入60mmol/L EDAC (1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚 胺盐酸盐）溶液300 y L，快速揽拌反应2小时，加入2. 5血50mmol/L抑为8. 2的Tris缓 冲液终止反应30分钟。用抑为6. 1的巧樣酸缓冲液4°C透析备用。
[0044] 似试剂1的制备
[0045] 取浓度为10%、表面带有簇基、直径100皿的乳胶颗粒（Polymicrospheres公司 的CB0100E产品）2血，加入到5血20mM P册.1的MES缓冲溶液中，边揽拌，边加入300mg Sul化-N服和30mg EDAC，室溫反应20分钟，离屯、去上清，然后加入含有30mg抗CG单克隆抗 体的抑8. 350mM棚酸缓冲液35血，室溫包被6小时。加入5血含50mM甘氨酸的上述棚酸 缓冲液，作用30分钟终止反应。用Rl缓冲液离屯、清洗3次，去除未包被的游离抗体，超声分 散。最后用Rl缓冲液重悬制成含0. 2%抗CG单克隆抗体包被的乳胶颗粒Rl试剂。Rl缓 冲液含 150ml MOPSO P册.90、0. 9%氯化钢、0. 5%吐溫-20、1% 阳G-6000、2mM 邸TAUOOmM 薦糖、2〇1111海藻糖、0.2%叠氮钢。
[004引 做试剂2的制备
[0047] 取浓度为10%、表面带有簇基、直径250nm的乳胶颗粒（Polymicrospheres公司 的CB0267D产品）2血，加入到5血20mM P册.1的MES缓冲溶液中，边揽拌，边加入300mg Sul化-N服和30mg EDAC，室溫反应20分钟，离屯、去上清，然后加入含有50mg步骤（1)制得 的甘胆酸-卵清蛋白偶联物的抑8. 3 50mM棚酸缓冲液35mL，室溫包被6小时。加入5血含 50mM甘氨酸的上述棚酸缓冲液，作用30分钟终止反应。用R2缓冲液离屯、清洗3次，去除未 包被的游离甘胆酸-卵清蛋白偶联物，超声分散。最后用R2缓冲液重悬制成含0. 05%甘 胆酸-卵清蛋白偶联物包被的乳胶颗粒R2试剂。R2缓冲液含30mM甘氨酸缓冲液抑7. 3、 0. 3%吐溫-20、0. 15% Proclin-300、200mM 薦糖、20mM 海藻糖。
[004引 （4)甘胆酸校准品的制备
[0049] 在50mM Tris缓冲液中依次加入0. 2%牛血清白蛋白、IOOmM甘露糖醇、2mM邸TA、 0. 15% Proclin-300和40mg/L甘胆酸；用弱盐酸边揽拌、边调节抑至8. 2。
[0050] (5)甘胆酸质控品的制备
[005。 在50mM Tris缓冲液中依次加入0. 2%牛血清白蛋白、IOOmM甘露糖醇、2mM邸TA、 0. 15% Proclin-SOO和3mg/L或lOmg/L甘胆酸；用弱盐酸边揽拌、边调节抑至8. 2。
[00閲 （6)试剂性能检测
[005引 1、在日立7180型全自动临床生化分析仪上，采用下表中的测定参数，
[0054] 检测试剂的准确度和精密度性能：
[00 巧]
[0056] 2、试剂质控品检测及其准确度和精密度：
[0057]
[005引结果显示试剂盒反应体系的具有良好的准确性和精密度，可靠性较好；并且采用 该试剂盒多次检测结果误差很小，说明该试剂盒检测具有良好的稳定性。
[0059] 3、用于临床标本的检测结果如下，说明试剂盒具有应用价值：
[0060]
[0061]
[00的]实施例2
[0063] (1)甘胆酸-血蓝蛋白偶联物的制备
[0064] 在1. 0血20mmol/L抑为6. 1的MES (2-吗嘟乙横酸）缓冲液中加入IOmg血蓝蛋 白，快速揽拌，加入甘胆酸，缓慢滴入50mmol/L EDAC (1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚 胺盐酸盐）溶液300 y L，快速揽拌反应2小时，加入2. 5血50mmol/L抑为8. 2的Tris缓 冲液终止反应30分钟。用抑为6. 1的MES缓冲液4°C透析备用。
[0065] 似试剂1的制备
[0066] 取浓度为10%、表面带有簇基的化Iymicrospheres公司CB0213E乳胶颗粒2血， 加入到5mL 20mM P册.1的MES缓冲溶液中，边揽拌，边加入300mg Sulfo-N服和30mg EDAC， 室溫反应20分钟，离屯、去上清，然后加入含有30mg抗CG单克隆抗体的抑8. 350mM棚酸缓 冲液35mU室溫包被6小时。加入5mL含50mM甘氨酸的上述棚酸缓冲液，作用30分钟终 止反应。用Rl缓冲液离屯、清洗3次，去除未包被的游离抗体，超声分散。最后用Rl缓冲 液重悬制成含0. 2%抗CG单克隆抗体包被的乳胶颗粒Rl试剂。Rl缓冲液含150mM MOPSO P 册.90、0. 9% 氯化钢、0. 5% 吐溫-20、1% 阳 G-6000、2mM EDTA、100mM 薦糖、20mM 海藻糖、 0. 2 %叠氮钢。
[0067] 做试剂2的制备
[0068] 取浓度为10%、表面带有簇基的化Iymicrospheres公司CB0104D乳胶颗粒2血， 加入到5mL 20mM P册.I的MES缓冲溶液中，边揽拌，边加入350mg Sulfo-N服和35mg EDAC， 室溫反应20分钟，离屯、去上清，然后加入含有50mg实施例1制得的甘胆酸-血蓝蛋白偶联 物的抑8. 1 50mM棚酸缓冲液35血，室溫包被6小时。加入5血含50mM甘氨酸的上述棚酸 缓冲液，作用30分钟终止反应。用R2缓冲液离屯、清洗3次，去除未包被的游离甘胆酸-血 蓝蛋白偶联物，超声分散。最后用R2缓冲液重悬制成含0. 05%甘胆酸-血蓝蛋白偶联物 包被的乳胶颗粒R2试剂。R2缓冲液含30mM甘氨酸缓冲液抑7. 3、0. 3%吐溫-20、0. 15 % Proc 1 in-300、200mM 薦糖、20mM 海藻糖。
[0069] (4)甘胆酸校准品的制备
[0070] 在50mM Tris缓冲液中依次加入0. 5%牛血清白蛋白、IOOmM甘露糖醇、5mM邸TA、 0. 15% Proclin-300和60mg/L甘胆酸；用弱盐酸边揽拌、边调节抑至8. 2。
[0071] (5)甘胆酸质控品的制备
[007引在50mM Tris缓冲液中依次加入0. 3%牛血清白蛋白、IOOmM甘露糖醇、5mM邸TA、 0. 15% Proclin-SOO和3mg/L或lOmg/L甘胆酸；用弱盐酸边揽拌、边调节抑至8. 2。
[007引 （6)试剂性能检测
[0074] 1、在日立7180型全自动临床生化分析仪上，采用下表中的测定参数，检测试剂的 准确度和精密度性能：
[00 巧]
[007引 结果显示试刑盒反应体《的具巧艮
巧的准倘巧和精凿巧，口j靠性较好；并且采用 该试剂盒多次检测结果误差很小，说明该试剂盒检测具有良好的稳定性。
[0079] 3、用于临床标本的检测结果如下，说明试剂盒具有应用价值：
[0080]
【主权项】
1. 一种测定甘胆酸浓度的试剂盒，其包括： 试剂1 :包括包被抗甘胆酸单克隆抗体的乳胶颗粒； 试剂2 :包括包被甘胆酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂1包括包被抗甘胆酸单克隆抗 体的乳胶颗粒、缓冲液、免疫凝集促进剂、稳定剂和防腐剂；较佳地，所述的试剂1由包被抗 甘胆酸单克隆抗体的乳胶颗粒、缓冲液、免疫凝集促进剂、稳定剂和防腐剂组成； 和/或，所述的试剂2包括包被甘胆酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、缓冲液、稳定剂 和防腐剂：较佳地，所述的试剂2由包被甘胆酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、缓冲液、稳定 剂和防腐剂组成。3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗甘胆酸单克隆抗体为兔抗甘胆 酸抗体； 所述的甘胆酸-惰性载体偶联物是将甘胆酸与惰性载体通过化学交联剂进行化学交 联获得；所述的惰性载体包括血蓝蛋白KLH、卵清蛋白OVA和牛血清白蛋白BSA中的一种或 多种；所述的化学交联剂为EDAC和/或Sulfo-NHS。4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂1中，所述的包被抗甘胆酸单克隆抗 体的乳胶颗粒通过下述步骤制得：乳胶颗粒表面先经过EDAC和Sulfo-NHS活化，然后加入 抗甘胆酸单克隆抗体，抗体的氨基端与活化后的乳胶颗粒产生交联反应，即得；所述的包被 抗甘胆酸单克隆抗体的乳胶颗粒较佳地通过下述步骤制得：将乳胶颗粒加入到MES缓冲溶 液中，搅拌条件下加入EDAC和Sulfo-NHS，室温反应，离心除去上清液，加入含有抗甘胆酸 单克隆抗体的pH 8. 3硼酸缓冲液，室温包被，再加入含甘氨酸的pH 8. 3硼酸缓冲液，终止 反应，离心清洗，超声分散，即得； 和/或，试剂2中，所述的包被甘胆酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒通过下述步骤制 得：乳胶颗粒表面先经过EDAC和Sulfo-NHS活化，然后加入甘胆酸-惰性载体偶联物，偶 联物的氨基端与活化后的乳胶颗粒产生交联反应，即得；所述的包被甘胆酸-惰性载体偶 联物的乳胶颗粒较佳地通过下述步骤制得：将乳胶颗粒加入到MES缓冲溶液中，搅拌条件 下加入EDAC和Sulfo-NHS，室温反应，离心除去上清液，加入含有甘胆酸-惰性载体偶联物 的pH 8. 3硼酸缓冲液，室温包被，再加入含甘氨酸的pH 8. 3硼酸缓冲液，终止反应，离心清 洗，超声分散，即得； 试剂1和试剂2中，所述的乳胶颗粒选自粒径为50~500nm、表面带有化学交联基团的 聚苯乙稀核壳结构的球状聚合物；所述的乳胶颗粒较佳地为PolyMicrospheres公司的型 号为CB0172E、CB0100E、CB0213E、CB0104D或CB0267D羧基微球；所述的乳胶颗粒的质量体 积浓度较佳地为〇· 01 %~5 %，更佳地为0· 05 %~0· 3 %。5. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂1和试剂2中，所述的缓冲液为 3-(N-吗啉基）-丙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基）-2-羟基丙磺酸缓冲液、Tris缓冲液、磷酸 盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种；所述的缓冲液的浓度为10~300mmol/L，较佳 地为30~100mmol/L ;所述的缓冲液的pH为6~9 ; 所述的免疫凝集促进剂包括聚乙二醇、硫酸葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多 种；所述免疫凝集促进剂的质量体积浓度为〇. 1~7%。6. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂1和试剂2中，所述的稳定剂选自 20~300mmol/L甘氛酸、20~300mmol/L双甘氛妝、0. 05~1 %牛血清白蛋白、0. 05~1 % 吐温 _20、0· 05 ~1 % Triton X-100、10 ~300mmol/L 鹿糖、10 ~300mmol/L 海藻糖、10 ~ 300mmol/L甘露糖、0· 2~20mmol/L EDTA、0. 5%~2%氯化钠和1%~10%甘油中的两种 或两种以上；所述的百分比为质量百分比； 试剂1和试剂2中，所述的防腐剂选自叠氮钠、Proclin-300中的一种或两种，所述的 防腐剂的质量百分比浓度为〇. 1%~1%。7. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂1的组成为：150mmol/L 3-(N-吗啉基）-2-羟基丙磺酸缓冲液pH 6. 90、0. 01 %包被抗甘胆酸单克隆抗体的乳胶颗 粒、0· 9%氯化钠、0· 5%吐温-20、1 % PEG-6000、2mmol/LEDTA、100mmol/L蔗糖、20mmol/L 海 藻糖和0. 2%叠氮钠；所述的百分比为质量百分比。8. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂2的组成为：1. 5 %包被甘胆 酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、30111111〇1/1甘氨酸缓冲液？!17.6、0.3%吐温-20、0.15% Proclin-300、200mmol/L鹿糖和20mmol/L海藻糖；所述的百分比为质量百分比。9. 如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的测定甘胆酸浓度的试剂盒还 包括试剂盒校准品和试剂盒质控品，所述的试剂盒校准品组成为：40mg/L或60mg/L甘胆 酸、50mmol/L Tris缓冲液pH 8. 2、0. 2%牛血清白蛋白、100mmol/L甘露糖醇、2mmol/L EDTA 和0· 15% Proclin-300 ;所述的试剂盒质控品组成为：3mg/L或10mg/L甘胆酸、50mmol/L Tris缓冲液pH 8. 2、0. 5%牛血清白蛋白、100mmol/L甘露糖醇、2mmol/L EDTA和0. 15% Procl in-300 ;所述的百分比为质量百分比。10. -种测定甘胆酸浓度的方法，其包括下述步骤：将待测样品首先与权利要求1~9 中任一项的试剂1混合，反应；再加入权利要求1~9中任一项的试剂2后，试剂1中包被 抗甘胆酸单克隆抗体的乳胶颗粒与试剂2中包被甘胆酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒的反 应浊度下降；通过测定该反应浊度下降的程度，与试剂盒校准品的反应浊度对比，即可计算 出待测样品中甘胆酸的浓度；较佳地，所述的测定甘胆酸浓度的方法是以非疾病诊断或治 疗目的的测定方法。
【文档编号】G01N33/577GK105988000SQ201510093395
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年3月2日
【发明人】不公告发明人
【申请人】上海高尼企业管理服务有限公司