一种全程c反应蛋白测定试剂盒及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种全程C反应蛋白测定试剂盒及其应用，该试剂盒包括如下组分：M试剂、R1试剂、R2试剂、碱性预处理液、预激发液和激发液，M试剂含有0.5～1mg/mL的包被了第一抗体的磁性微粒、0.5～1％酪蛋白和0.5～1％牛血清白蛋白，溶剂为pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲液，其中第一抗体的包被量为5～15μg/mg磁性微粒；R1试剂为浓度为10～20mM的HCl溶液；R2试剂含有包被了第二抗体的吖啶酯、0.5～1％酪蛋白和0.5～1％牛血清白蛋白，溶剂为pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲液，其中第二抗体的包被量为5～15μg/mL吖啶酯；碱性预处理液为浓度为20～50mM的NaOH溶液；本发明的试剂盒在反应过程中加入强碱，对蛋白进行破坏，然后再加入强酸进行中和，可以试剂的检测范围达到0.02mg/L～100mg/L，使试剂能达到检测C反应蛋白全程的要求。
【专利说明】
-种全程C反应蛋白测定试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于化学发光免疫分析技术领域，具体设及一种全程C反应蛋白测定试剂 盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 免疫分析技术现在在生物医学领域内的应用非常广泛，并已经在临床诊断、环境 及卫生检测、法医鉴定、食品安全等诸多领域中已经成为必备的常规技术手段，发挥着不可 替代的作用，具有巨大的市场。而免疫分析试剂所采用的信号系统对于免疫分析试剂的性 能起着决定性的作用，从放射免疫分析巧IA)到酶联免疫吸附分析巧LISA)再到化学发光 免疫分析（CLIA)，免疫分析技术的发展和进步，主要就是信号系统的进步和革命，免疫分析 技术使用抗原和抗体W及它们的各种结合物运一免疫反应的基础并没有变化，因此如何获 得更强、更灵敏W及更稳定的信号就显得致关重要。
[0003] C-反应蛋白（C-Reactive protein, CRP)是一种能与肺炎链球菌C多糖体反应形 成复合物的急性时相反应蛋白，分子量为105500D，半衰期19小时；由含有五个相同的未糖 基化的多肤亚单位组成，每个亚单位含有187个氨基酸，运些亚单位间通过非共价键连结 成环状的五聚体，并有一个链间二硫键。血清CRP由肝脏合成，白细胞介素化、6 W及肿瘤 坏死因子是其合成的最重要的调节因子；1930年，Tillett和化ancis首次在急性大叶性肺 炎患者的血清中发现一种能在Ca"+存在时与肺炎球菌细胞壁中的C多糖发生特异性沉淀反 应的物质。1941年，Ave巧等测知它是一种蛋白质，故称为C反应蛋白（CRP)。
[0004] 传统观点认为CRP是一种非特异的炎症标志物，但近十年的研究掲示了 CRP直接 参与了炎症与动脉粥样硬化等屯、血管疾病，并且是屯、血管疾病最强有力的预示因子与危险 因子。因此CRP含量就可W作为两种疾病的诊断标准，并且参考值范围不同，具体如下： 阳0化]CRP在健康人血清中浓度很低（< 3mg/L)，而在细菌感染或组织损伤时，其浓度显 著升高。
[0006] CRP值为10~50mg/L表示轻度炎症，例如局部细菌性感染（如膀脫炎、支气管炎、 脈肿）、手术和意外创伤、屯、肌梗死、深静脉血栓、非活动性结缔组织病、许多恶性肿瘤和多 数病毒感染。
[0007] CRP值升为lOOmg/L左右表示较严重的疾病，它的炎症程度必要时需静脉注射。
[0008] CRP值大于lOOmg/l，表示严重的疾病过程并常表示细菌感染的存在。
[0009] 而现有技术中的试剂盒均不能同时囊括上述参考范围，造成了应用的限制，增加 了诊断分析成本。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷提供一种全程C反应蛋白测定试剂盒。
[0011] 本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的检测方法。 阳012] 本发明的具体技术方案如下：
[0013] 一种全程C反应蛋白测定试剂盒，包括如下组分：
[0014] M试剂，含有0. 5~Img/mL的包被了第一抗体的磁性微粒、0. 5~1%酪蛋白和 0. 5~1%牛血清白蛋白，溶剂为抑=7. 0~8. 0的憐酸盐缓冲液，其中第一抗体的包被量 为5~15 Ji g/mg磁性微粒； 阳01引 Rl试剂，浓度为10~20mM的肥1溶液；
[0016] R2试剂，含有包被了第二抗体的日丫晚醋、0. 5~1%酪蛋白和0. 5~1%牛血清白 蛋白，溶剂为抑=7. 0~8. 0的憐酸盐缓冲液，其中第二抗体的包被量为5~15 y g/mL叮 晚醋；
[0017] 碱性预处理液，浓度为20~50mM的化OH溶液；
[0018] 预激发液和激发液
[0019] 上述第一抗体和第二抗体均为能与C反应蛋白特异性反应的单克隆抗体。
[0020] 在本发明的一个优选实施方案中，所述Rl试剂为浓度IOmM的肥1溶液。
[0021] 在本发明的一个优选实施方案中，所述碱性预处理液为浓度20mM的化OH溶液。
[0022] 在本发明的一个优选实施方案中，所述M试剂的制备方法为：将所述第一抗体与 磁性微粒混合于抑=5. 0~6. 0的2-吗嘟乙横酸缓冲液中，于25°C~37°C包被1~化， 在加入pH = 8. 0~9. 0的0. 1 %~0. 5%牛血清白蛋白的憐酸盐缓冲液终止1~化，将其 中包被后的磁性微粒分离后分散于抑=7. 0~8. 0的憐酸盐缓冲液中，再加入酪蛋白和牛 血清白蛋白，即得M试剂。
[0023] 在本发明的一个优选实施方案中，所述包被了抗体的叮晚醋的制备方法为：将所 述第二抗体与叮晚醋混合于抑=8. 0~9. 0的憐酸盐缓冲液中，于25°C~37°C包被1~ 池，在加入抑=8. 0~9. 0的含0. 1 %~0. 5%牛血清白蛋白的Tris缓冲液终止1~化， 得母液，将该母液用抑=7. 0~8. 0的憐酸盐缓冲液稀释至1:100~500,即得R2试剂。
[0024] 在本发明的一个优选实施方案中，所述预激发液为1% (w/v)过氧化氨溶液。
[0025] 在本发明的一个优选实施方案中，所述激发液为Imol/L氨氧化钢溶液。
[00%] -种应用上述全程C反应蛋白测定试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：
[0027] (1)用100~120 y L碱性预处理液处理20~30 y L样本； 阳02引 似按1:2~3:5~7的体积比在反应孔中依次加入预处理后的样本、M试剂和Rl 试剂，解育15~20min ;
[0029] (3)步骤（2)的解育结束后，用含0. 05~0. 08%的吐溫20憐酸盐缓冲液洗涂，再 加入20~25 y LR2试剂，解育10~15min ;
[0030] (4)步骤（3)的解育结束后，用含0. 05~0. 08%的吐溫20憐酸盐缓冲液洗涂，加 入预激发液100~200 y以进行预激发；
[00川 妨去除预激发液，加入激发液100~200 y L，进行激发和检测。
[0032] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（2)中M试剂和Rl试剂的加样间隔为 0 ~ 4min〇
[0033] 本发明的有益效果是：本发明的试剂盒在反应过程中加入强碱，对蛋白进行破坏， 然后再加入强酸进行中和，可W试剂的检测范围达到0. 02mg/L~lOOmg/L，使试剂能达到 检测C反应蛋白全程的要求。
【具体实施方式】
[0034] W下通过【具体实施方式】对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0035] 下述实施例中的全程C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于：包括如下组分：
[0036] M试剂，含有0. 5~Img/mL的包被了第一抗体的磁性微粒、0. 5~1%酪蛋白和 0. 5~1%牛血清白蛋白，溶剂为抑=7. 0~8. 0的憐酸盐缓冲液，其中第一抗体的包被量 为5~15 Ji g/mg磁性微粒，上述磁性微粒购自Thermo,为纳米级的超顺磁颗粒，其核屯、为 Pe3〇4,该试齐Ij制备方法为：将巧f述第一抗体与磁性微粒混合于pH = 5. 0~6. 0的2-吗嘟乙 横酸缓冲液中，于25°C~37°C包被1~化，在加入pH = 8. 0~9. 0的0. 1 %~0. 5%牛血 清白蛋白的憐酸盐缓冲液终止1~化，将其中包被后的磁性微粒分离后分散于抑=7. 0~ 8. 0的憐酸盐缓冲液中，再加入酪蛋白和牛血清白蛋白，即得；
[0037] Rl试剂，浓度为10~20mM的肥1溶液； 阳03引 R2试剂，含有包被了第二抗体的日丫晚醋、0. 5~1%酪蛋白和0. 5~1%牛血清白 蛋白，溶剂为抑=7. 0~8. 0的憐酸盐缓冲液，其中第二抗体的包被量为5~15 y g/mL叮 晚醋，该试剂的制备方法为：将所述第二抗体与叮晚醋混合于抑=8. 0~9. 0的憐酸盐缓 冲液中，于25°C~37°C包被1~化，在加入pH = 8.0~9.0的含0. 1 %~0.5%牛血清白 蛋白的Tris缓冲液终止1~化，得母液，将该母液用抑=7. 0~8. 0的憐酸盐缓冲液稀释 至1:100~500,即得； W39] 碱性预处理液，浓度为20~50mM的化OH溶液；
[0040] 预激发液，为1 % (w/v)过氧化氨溶液 [0041 ] 和激发液，为Imol/L氨氧化钢溶液
[0042] 上述第一抗体和第二抗体均为能与C反应蛋白特异性反应的单克隆抗体，其中第 一抗体为10C11，第二抗体为7D9,均购自厦口万泰沧海生物技术有限公司。
[0043] 上述全程C反应蛋白测定试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：
[0044] (1)用100~120 y L碱性预处理液处理20~30 y L样本； W45] 似按1:2~3:5~7的体积比在反应孔中依次加入预处理后的样本、M试剂和Rl 试剂，解育15~20min ;
[0046] (3)步骤（2)的解育结束后，用含0. 05~0. 08%的吐溫20憐酸盐缓冲液洗涂，再 加入20~25 y LR2试剂，解育10~15min ;
[0047] (4)步骤（3)的解育结束后，用含0. 05~0. 08%的吐溫20憐酸盐缓冲液洗涂，加 入预激发液100~200 y以进行预激发； W48] 妨去除预激发液，加入激发液100~200 y L，进行激发和检测。 阳049] 实施例1 阳化日]分别选用50mM化0H、2 % SDS、IOOmM邸TA及2M盐酸脈作为样本预处理液加入优 化后的检测系统，评价梯度稀释的C反应蛋白抗原，相对发光强度如下表1所示：
[0051] 表1不同预处理液对C反应蛋白检测的影响
[0052]
[0054] 由表1可知，选用50mM化OH作为样本预处理液时线性拟合r为0. 9925,优于其他 预处理液；且将M试剂加入2 % SDS、IOOmM邸TA及2M盐酸脈作为预处理液处理的样本后， 磁微粒出现非常明显的沉淀现象，而且不能再混匀，而50mM化OH也有沉淀，但是较轻微且 能再混匀，所W选用50mM化OH作为样本预处理液。 阳〇5引 实施例2
[0056] 为了解决磁微粒的沉淀现象，所W需对碱预处理后的样本加入酸性的Rl试剂进 行中和。加入M试剂后分别加入20 y L IOOmM肥l、20mM肥1及IOmM肥1，评价梯度稀释的 C反应蛋白抗原，相对发光强度如下表2所示：
[0057] 表2不同浓度肥1对C反应蛋白检测的影响
[0058]
[0059] 在上述3个浓度中，选用20mM肥1及IOmM肥1作为Rl试剂时，线性拟合r较优， 均大于0. 9900 ;且由于使用IOmM肥I作为Rl试剂时可W使反应不出现磁微粒沉淀现象。 W60] 实施例3
[OOW] 加入M试剂后，分别间隔lmin、2min、3min及4min加入Rl试济I，W马上加入为对 照组，分别评价梯度稀释的C反应蛋白抗原，相对发光强度如下表3所示：
[0062] 表3不同加样间隔对C反应蛋白检测的影响
[0063]
W65] 表3结果显示，4min内完成Rl试剂的加入对试剂的检测性能影响都不大，能满足 实际操作的要求。
[0066] 实施例4
[0067] 使用优化后的检测体系检测稀释的C反应蛋白抗原，相对发光强度如下表4所 示： W側表4 C反应蛋白抗原的检测结果
[0069]
[0070] 分别W表4中样本浓度（W 10为底的对数）为X轴，W测定结果均值（W 10为 底的对数）为Y轴进行多项回归分析，得到一级、二级与=级多项式，多项式方程如表5所 示：
[0071] 表5多项式回归方程
阳勺1 阳
[0074] 对回归方程进行线性检验就是对每个非线性系数作t检验，判断回归系数与零是 否有显著性差异。BO与Bl不反映非线性，故不需对其进行检验。 W巧]4. 1系数B3t检验
[0076] 对3批试剂的B3做t检验，检验方法如下：
[0077] 计算统计量t，计算公式为：
[0078] t = Bi/沈 i
[0079] 其中，SEi为每个非线性系数的斜率标准误，使用GraphPad Prism进行分析计算， 结果如表6所示：
[0080] 表6 B3检验结果
[0081]
[0082] 由公式壯=L*R-R壯计算自由度，L为样本数，R为每个样本的测定次数，R壯为 回归自由度，即回归方程中系数（包括BO)的个数。 阳083] 根据W上公式对表6中的结果进行统计分析，111 = 5. 362,当壯=28时查表得， a ^.。日尸2. 048,所W 111 H <a ^.。日>，表示试剂非线性系数B3与零有显著性差异，数据组 被认为具有非线性。因此应对该试剂进行临床标准的线性与非线性检验。
[0084] 4. 2临床标准的线性与非线性检验
[00化]临床标准的线性检验中使用了两个统计量，ADL(偏离直线平均差异average deviation from linearity)与 F*c1:Bnd(百分区界 percent bound)，F*c1:Bnd 取 5%。如 ADL 小于所要求的临界判断值，则可认为数据组具有临床可接受的线性，所拟合出的最适非线 性多项式无临床意义。 W86] 计算ADL值，计算公式为：
[0087：
[00蝴其中，P(X)为最优拟合二阶或S阶方程的拟合值，a+bx为拟合一阶方程的拟合 值，L为样本数，；为总平均浓度（全部测量数据的平均值）。
[0089] 测量数据的精密度可直接影响多项式回归分析的结果，为提高统计功效，需对数 据组进行精密度检验。用最优拟合方程的回归标准误（O)与总平均浓度（C )的百分比 代表不精密度。
[0090] 计算最优拟合方程的回归标准误（O )，计算公式为：
[0091]
[0092]
[0093] 阳094] 其中，yi为各个测量值，P(Xi)为最优拟合方程的拟合值，n为样本数乘W重复次 数化X时，d为最优拟合方程的阶数，0.为总平均浓度，L为样本数，R为重复测量的次数， C为常数。
[0095] 根据W上公式分别对表4~5中的结果进行统计分析，结果如表7所示：
[0096] 表7线性检验及不精密度分析结果表
[0097] 阳
[0099] 试剂二阶与S阶回归方程的不精密度分别为0.3%、1. 1%，二阶与S阶回归方程 的
分别为1%，均满^
判断式，说明数据的精密度好 可作线性评价。一般设定ADL小于5%为临床允许误差，试剂二阶与S阶回归方程的ADL分 别为1. 6%、1. 1 %，可认为该数据组具有临床可接受的线性。 阳100] 综上所述，本试剂盒样本浓度在0. 02mg/L~200mg/L的范围内具有临床可接受的 线性。 阳101] 实施例5 阳102] 使用优化后的检测体系检测梯度稀释的C反应蛋白抗原作为标准曲线，然后检测 收集的21例临床样本，通过标准曲线换算浓度值后与临床背景值进行相关性评价，结果如 表8所不： 阳103] 表8临床样本检测结果 阳 104]
阳106] 通过相关性评价，两者相关性方程为y = I. 0217X+0. 0452,相关系数r为0. 9860， 说明二者有较好的相关性。 阳107] W上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即 依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
【主权项】
1. 一种全程C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于：包括如下组分： Μ试剂，含有0. 5~lmg/mL的包被了第一抗体的磁性微粒、0. 5~1%酪蛋白和0. 5~ 1 %牛血清白蛋白，溶剂为pH = 7. 0~8. 0的磷酸盐缓冲液，其中第一抗体的包被量为5~ 15 μ g/mg磁性微粒； R1试剂，浓度为10~20mM的HC1溶液； R2试剂，含有包被了第二抗体的吖啶酯、0. 5~1 %酪蛋白和0. 5~1 %牛血清白蛋白， 溶剂为pH = 7. 0~8. 0的磷酸盐缓冲液，其中第二抗体的包被量为5~15 μ g/mL吖啶酯； 碱性预处理液，浓度为20~50mM的NaOH溶液； 预激发液和激发液； 上述第一抗体和第二抗体均为能与C反应蛋白特异性反应的单克隆抗体。2. 如权利要求1所述的一种全程C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述R1试剂为 浓度10mM的HC1溶液。3. 如权利要求1所述的一种全程C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述碱性预处 理液为浓度20mM的NaOH溶液。4. 如权利要求1所述的一种全程C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述Μ试剂的 制备方法为：将所述第一抗体与磁性微粒混合于pH = 5. 0~6. 0的2-吗啉乙磺酸缓冲液 中，于25°C~37°C包被1~3h，在加入pH = 8. 0~9. 0的0. 1%~0. 5%牛血清白蛋白的 磷酸盐缓冲液终止1~3h，将其中包被后的磁性微粒分离后分散于pH = 7. 0~8. 0的磷酸 盐缓冲液中，再加入酪蛋白和牛血清白蛋白，即得Μ试剂。5. 如权利要求1所述的一种全程C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述包被了抗 体的吖啶酯的制备方法为：将所述第二抗体与吖啶酯混合于pH = 8. 0~9. 0的磷酸盐缓冲 液中，于25°C~37°C包被1~3h，在加入pH = 8. 0~9. 0的含0. 1%~0. 5%牛血清白蛋 白的Tris缓冲液终止1~3h，得母液，将该母液用pH = 7. 0~8. 0的磷酸盐缓冲液稀释至 1:100~500,即得R2试剂。6. 如权利要求1至5中任一权利要求所述的一种全程C反应蛋白测定试剂盒，其特征 在于：所述预激发液为1% (w/V)过氧化氢溶液。7. 如权利要求6所述的一种全程C反应蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述激发液为 lmol/L氢氧化钠溶液。8. -种应用权利要求1至7中任一权利要求所述的全程C反应蛋白测定试剂盒进行检 测的方法，其特征在于：包括如下步骤： (1) 用100~120 μ L碱性预处理液处理20~30 μ L样本； (2) 按1:2~3:5~7的体积比在反应孔中依次加入预处理后的样本、Μ试剂和R1试 剂，孵育15~20min ; (3) 步骤（2)的孵育结束后，用含0. 05~0. 08%的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，再加入 20~25 μ LR2试剂，孵育10~15min ; (4) 步骤（3)的孵育结束后，用含0. 05~0. 08%的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，加入预 激发液100~200 μ L，进行预激发； (5) 去除预激发液，加入激发液100~200 μ L，进行激发和检测。9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中Μ试剂和R1试剂的加样间
【文档编号】G01N33/68GK105988003SQ201510042477
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月28日
【发明人】魏淑英, 黄缘缘, 翁祖星, 徐飞海, 孙旭东, 葛胜祥
【申请人】厦门万泰凯瑞生物技术有限公司, 厦门大学