蓝莓中总黄酚含量的测定的制作方法
【专利摘要】本发明具体涉及一种蓝莓果实中总酚含量测定的一种方法。其技术要点主要包括以下几个步骤：1)蓝莓中总酚的提取方法；2)测定总酚显色剂的制备；3)对照品溶液的配制；4)标准曲线的建立；5)样品总酚含量测定。本发明方法操作简便，成本较低，检测时间较短，精密度较高，重现性良好，稳定性较强。
【专利说明】
蓝莓中总黄酚含量的测定
技术领域
[0001] 本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种蓝莓果实中总黄酚含量测定的方 法。
【背景技术】
[0002] 蓝莓是当今最流行的五大健康食品之一，其果实的品质优劣是由风味和营养价值 来综合体现。风味主要与含有的有机酸及糖的量及其比例有关，决定着口感。而营养价值主 要体现在蓝莓中总酚及黄酮的含量方面。蓝莓的茎、枝叶及果实中含有大量的多酚类物质， 主要包括黄酮醇类、花色素类和酚酸类成分。
[0003] 酚酸类化合物是广泛存在于水果、蔬菜和谷类食物中的植物次生代谢产物，有多 种生物活性，具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、护肝益肾、抗动脉硬化、防治冠心病与中风等心 脑血管疾病以及抑菌消炎抗病毒等多种生理功能。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种蓝莓中总酚含量的测定方法，采用Folin-Ciocalteu法测定了 蓝莓果提取物总酚的含量，具有分析速度快，准确度高，重现性好，精密度高，显色稳定性好 等优点。通过对蓝莓果实中总酚含量的测定，为蓝莓科学食用、品种选育及优良品种推广奠 定理论基础。具体实施方案包括以下几个步骤：
[0005] -种蓝莓中总酚含量的测定，其特征在于，包括以下几个步骤：
[0006] (1)蓝莓中总酚的提取方法
[0007] 精密称取蓝莓鲜果，组织破碎后按料液比1:10-15比例加入含有体积分数0.1 %盐 酸的80wt %甲醇溶液，40 °C超声提取30-40min，过滤，滤渣按上述方法再提取一次，合并滤 液;取滤液用旋转蒸发仪浓缩后加入3-5倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取3-5次，合并乙酸乙 酯层萃取液，回收乙酸乙酯，浓缩物用80%甲醇定容，保存备用；
[0008] (2)测定总酚显色剂的制备
[0009] 测定当天将Lowry法蛋白含量测定试剂盒(货号:PRL000100,上海荔达生物科技有 限公司）中的A1、A2、A3按体积比100:1:1混合配成试剂A，放置30min后使用;将试剂B避光保 存，测定时直接使用；
[0010] (3)对照品溶液的配制
[0011] 精密称取没食子酸，用纯水定容，配制成浓度为3. Omg/mL溶液，再稀释配置成浓度 为0·2mg/mL、0·4mg/mL、0·6mg/mL、0·8mg/mL、1·Omg/mL、1·2mg/mL、1·4mg/mL、1·6mg/mL、 1.8mg/mL、2. Omg/mL、2.2mg/mL的没食子酸溶液;没食子酸的测定波长为750nm。
[0012] (4)没食子酸标准曲线的建立
[0013] 分别取步骤（3)中配置的没食子酸浓度为0、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、 0 · 8mg/mL、1 · Omg/mL、1 · 2mg/mL、1 · 4mg/mL、1 · 6mg/mL、1 · 8mg/mL、2 · Omg/mL、2 · 2mg/mL 的对照 品溶液于试管中，加试剂A，混匀室温放置10min，再加试剂B 0.5mL(每加一管，立即混匀，室 温放置30min，在750nm波长下，测定吸光度值，以未加对照品的一组做空白对照；以没食子 酸浓度为横坐标X，吸光度为纵坐标y，建立标准曲线；。
[0014] (5)蓝莓样品中总酚的测定
[0015] 精密量取步骤（1)中得到的蓝莓样品提取溶液0 . lmL于刻度试管中，加入A试剂 5mL，混匀后室温放置lOmin，加入B试剂0.5mL，立即混匀，室温放置30min，以未加没食子酸 试管为空白对照，于750nm波长处测定吸光度。重复测定三次，所得数据计算平均值，对照标 准曲线（图1)可得各品种蓝莓样品中总酚的浓度，计算当量mg每食子酸/g果实。
[0016] 进一步地，在上述技术方案中，步骤(1)中，蓝莓鲜果质量与定容体积的比例为3~ 5g:10mL〇
[0017] 进一步地，在上述技术方案中，步骤(4)中，对照品溶液、试剂A、试剂B体积比为1: 5:0.5;步骤(5)中，对照品溶液、试剂A、试剂B体积比为0.1:5:0.5。
[0018]进一步地，在上述技术方案中，步骤（4)中，标准曲线的线性回归方程为：y = 0 · 3431x-0 · 0057，R2 = 0 · 9988，线性浓度范围为 0 · 00357-0 · 03928mg/mL
[0019] 发明有益效果
[0020] 优化的方法具有分析速度快，准确度高，重现性好，精密度高，显色稳定性好等优 点，是一种测定蓝莓果实中总酚含量的理想方法，并可为其他原料中总酚含量的测定提供 参考依据。
【附图说明】
[0021] 图1是对照品没食子酸的标准曲线。
【具体实施方式】
[0022] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。下述实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为商业途径获得;下述实 施例中所用试验方法，如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的常规实验方法。
[0023] 实施例1
[0024] -种测定蓝莓果实中总酚的含量的方法，具体实施方案如下：
[0025] 1.主要仪器
[0026]紫外可见分光光度计（756MC)，上海菁华科技仪器有限公司；超声波清洗机（SB-5200DTD)，宁波新芝生物科技股份有限公司；旋转蒸发仪(EYELA N-1100)，上海爱朗仪器有 限公司；低温冷却液循环栗(DLSB-5/20)，郑州长城科工贸有限公司；电子天平(ME204/02)， 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
[0027] 2.方法
[0028] (1)蓝莓中总酚的提取方法
[0029] 精密称取蓝丰类蓝莓鲜果5.0g，组织破碎后按料液比1:15比例加入含有0.1 %盐 酸的80%甲醇溶液，40°C超声提取30min，过滤，滤渣按上述方法再提取一次，合并滤液。取 滤液用旋转蒸发仪浓缩后加入5倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯层萃取 液，回收乙酸乙酯，浓缩物用80 %甲醇定容至1 OmL容量瓶，保存备用。
[0030] (2)测定总酚显色剂的制备
[0031]测定当天将Lowry法蛋白含量测定试剂盒(货号:PRL000100,上海荔达生物科技有 限公司）中的A1、A2、A3按体积比100:1:1混合配成试剂A，放置30min后使用。将试剂B避光保 存，测定时直接使用。
[0032] (3)对照品溶液的配制
[0033] 精密称取150.0mg没食子酸，用纯水定容至50mL容量瓶中，配制成浓度为3.0mg/mL 溶液，没食子酸的测定波长为750nm 〇
[0034] (4)没食子酸标准曲线的建立
[0035] 分别取没食子酸浓度为0、0 · 2mg/mL、0.4mg/mL、0 · 6mg/mL、0 · 8mg/mL、1 · Omg/mL、 1 · 2mg/mL、1 · 4mg/mL、1 · 6mg/mL、1 · 8mg/mL、2 · Omg/mL、2 · 2mg/mL的对照品溶液lmL于试管中， 加试剂A 5 m L，混匀室温放置10 m i η，再加试剂B 0.5 m L (每加一管立即混匀），室温放置 30min，在750nm波长下，测定吸光度值，以未加对照品的一组做空白对照。以没食子酸浓度 为横坐标，吸光度为纵坐标，建立标准曲线，其线性回归方程为:y = 0.3431X-0.0057，R2 = 0.9988，线性浓度范围为0.00357-0.03928mg/mL(见图 1)。
[0036] (5)蓝莓样品中总酚的测定
[0037] 精密量取蓝丰样品提取溶液0. lmL于刻度试管中，加入A试剂5mL，混匀后室温放置 lOmin，加入B试剂0.5mL，立即混匀，室温放置30min，以未加没食子酸试管为空白对照，于 750nm波长处测定吸光度。重复测定三次，所得数据依次为0.116,0.115,0.121，计算平均值 为0.117，对照标准曲线（图1)可得蓝丰样品中总酚的浓度为0.650 1^/1^，计算得当量为 2.598mg没食子酸/g果实。
[0038] (6)根据上述实验步骤，所测得部分蓝莓品种其总酚含量如下表1:
[0039]表1新鲜成熟蓝莓果实中总酚的含量
[0041] 3、测定方法学考察
[0042] (1)重现性实验
[0043] 取蓝丰样品按照上述提取方法重复提取6次，按以上方法显色，分别测定其吸光度 值，求得吸光度RSD值为2.53 % (见表2)。
[0044] 表2总酚重现性实验结果
[0046] (2)稳定性实验
[0047] 取蓝莓样品提取溶液，按以上方法显色，测定0，20，40，60，80min的吸光度，求得吸 光度RSD值为2.18 % (见表3)。
[0048]表3总酚稳定性实验结果
[0050] (3)加样回收率实验
[0051] 取提取后的蓝莓样品溶液5份，分别加入相同体积已知浓度的没食子酸对照品 (0.6mg/mL)，混合后按以上方法显色，测定平均回收率为98.0 %，RSD为2.01 % (见表4)。 [0052]表4没食子酸的加样回收率实验结果
【主权项】
1. 一种蓝莓中总酚含量的测定，其特征在于，包括以下几个步骤： (1) 蓝莓中总酚的提取方法 精密称取蓝莓鲜果，组织破碎后按料液比1:10-15比例加入含有体积分数0.1 %盐酸的 80%甲醇溶液，40°C超声提取30-40min，过滤，滤渣按上述方法再提取一次，合并滤液;取滤 液用旋转蒸发仪浓缩后加入3-5倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取3-5次，合并乙酸乙酯层萃 取液，回收乙酸乙酯，浓缩物用80 %甲醇定容，保存备用； (2) 测定总酚显色剂的制备 将Lowry法蛋白含量测定试剂盒中的A1、A2、A3按体积比100:1:1混合配成试剂A，放置 30min后使用;将试剂B避光保存，测定时直接使用； (3) 对照品溶液的配制 精密称取没食子酸，用纯水定容，配制成浓度为3. Omg/mL溶液，再稀释配置成0.2、0.4、 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2mg/mL 的没食子酸溶液； (4) 没食子酸标准曲线的建立 分别取步骤(3)中配置的没食子酸浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、 2.0、2.2mg/mL的对照品溶液于试管中，加试剂A，混勾室温放置10mi η，再加试剂B，立即混 匀，室温放置30min，在750nm波长下，测定吸光度值，以未加对照品的一组做空白对照；以没 食子酸浓度为横坐标X，吸光度为纵坐标y，建立标准曲线； (5) 蓝莓样品中总酚的测定 精密量取步骤（1)中得到的蓝莓样品提取溶液〇 . lmL于刻度试管中，加入A试剂5mL，混 匀后室温放置lOmin，加入B试剂0.5mL，立即混匀，室温放置30min，以未加没食子酸试管为 空白对照，于750nm波长处测定吸光度;重复测定三次，所得数据计算平均值，对照标准曲线 可得各品种蓝莓样品中总酚的浓度，计算当量mg每食子酸/g果实。2. 根据权利要求1所述蓝莓中总酚含量的测定，其特征在于:步骤（1)中，蓝莓鲜果质量 与定容体积的比例为3~5g: 10mL。3. 根据权利要求1所述蓝莓中总酚含量的测定，其特征在于:步骤(4)中，对照品溶液、 试剂A、试剂B体积比为1:5:0.5;步骤(5)中，对照品溶液、试剂A、试剂B体积比为0.1:5:0.5。4. 根据权利要求1所述蓝莓中总酚含量的测定，其特征在于:步骤(4)中，标准曲线的线 性回归方程为:y = 〇 · 3431 x-0 · 0057，R2 = 0 · 9988，线性浓度范围为0 · 00357-0 · 03928mg/mL。
【文档编号】G01N21/78GK106018297SQ201610341108
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】弓晓杰, 李珂珂, 杨莉, 徐玉涛
【申请人】大连大学