一种基于近红外光谱分析技术监测人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程的方法

文档序号:10651919阅读:1140来源:国知局
一种基于近红外光谱分析技术监测人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于近红外光谱分析技术监测人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程的方法,包括基于近红外光谱分析技术建立用于人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程中HA含量测定模型的步骤,建立用于pH值测定模型的步骤,以及利用上述建立的模型对人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程的HA含量和pH进行过程测定的步骤。本发明的方法能够有效实现人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程中HA含量和pH值的过程测定,以便根据HA的含量变化即时调整加醋酸缓冲液的速率并可准确及时的判断反应终点。
【专利说明】
一种基于近红外光谱分析技术监测人血白蛋白醋酸缓冲液沉 淀过程的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种基于近红外光谱分析技术监测人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程 的方法。
【背景技术】
[0002] 人血白蛋白(HA)是人体血浆中含量最高的蛋白质,占血浆蛋白的40%-60%。说在 临床用于治疗各种疾病,包括低血容量症、低白蛋白血症、休克、烧伤、手术失血、创伤、慢性 肝病、营养支持、危重患者复苏等。由于HA大多从人血浆中分离得到,原料来源匮乏,在市场 常出现供不应求的状况。
[0003] 目前HA的生产基本采用低温乙醇法从人血浆中分离,由于HA的工业化生产中投入 的血浆数量巨大(一般以吨计量),反应罐的容积也很大,巨大的体积给乙醇浓度、pH调节和 HA含量的测定带来了很多技术上的难点,而且终点pH值确定需要在乙醇含量低于10%的条 件下用pH计在室温条件测定。因而在实际工业生产过程多采用离线的方式进行监测和判断 反应终点,大大降低了生产效率。并且离线方式滞后于生产过程,严重制约了 HA收率的提高 和产品质量的提升。
[0004] 近红外光谱分析技术(NIRS)经过近些年的发展,目前已广泛应用于石油化工、制 药和烟草等领域,并取得了良好的经济效益。但国内外还未见近红外光谱分析技术在监测 人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程或建立相关模型方面的报道。

【发明内容】

[0005] 针对上述现有技术,本发明的目的是提供一种基于近红外光谱分析技术监测人血 白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程的方法,本发明的方法能够有效实现人血白蛋白醋酸缓冲液沉 淀过程中HA含量和pH值的过程测定,以便根据HA的含量变化即时调整加醋酸缓冲液的速率 并可准确及时的判断反应终点(pH值达到4.6-4.7间,即白蛋白等电点时为反应终点),提高 了生产效率。
[0006] 为实现上述目的,本发明采用下述技术方案:
[0007] 本发明所提供的基于近红外光谱分析技术监测人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程 的方法,包括如下步骤:
[0008] (1)建立模型用于HA含量的测定:
[0009] A模拟不同批次人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程并取样,采集样品的原始近红外 光谱,并采用常规方法对样品中HA含量进行检测,得离线指标成分化学测定值;
[0010] B将步骤A的样品划分为校正集和验证集,对样品光谱进行预处理,然后比较不同 变量选择方法对建模结果的影响,选择参与建模的变量,建立PLSR模型用于HA含量的测定; [0011] c采用验证集的样品验证模型的预测能力;
[0012] (2)建立模型用pH值的测定:
[0013] A模拟不同批次人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程并取样,采集样品的原始近红外 光谱,并采用常规方法对样品中乙醇含量进行检测,并根据测定结果配制乙醇含量为10% 的样品,测定样品的pH值;
[0014] B将步骤A的样品划分为校正集和验证集,对样品光谱进行预处理,并对建模区间 进行考察,建立PLSR模型用于pH值的测定;
[0015] C采用验证集的样品验证模型的预测能力;
[0016] (3)利用步骤(1)和步骤(2)建立的模型对人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程的HA含 量和pH进行过程测定。
[0017] 上述方法,步骤(1)中,所述模拟不同批次人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程并取 样,具体方法为:每一批次的醋酸缓冲液的加入方法为:每4min加一次醋酸缓冲液,前9次每 次加0.2mL,后6次每次加0.8mL,每次加醋酸缓冲液前取样lmL并离心处理;模拟至少8个批 次。
[0018] 上述方法,步骤(1)中,以Antaris Π傅里叶变换近红外光谱仪采集光谱,近红外 光谱的采集条件为:光谱分辨率为8CHT1,扫描次数为32,光谱范围为10000-4000cnf1。
[0019]上述方法,步骤(1)中,所述建立PLSR模型用于HA含量的测定的过程中,引入缩小 浓度区间的思想,去除HA含量变化不明显且对模型应用作用较小的样品点,保留含量变化 趋势大的样品建立模型,从而提高了模型的准确性和有效性。
[0020] 优选的,参与建模的样品为每个批次的前11个取样点,HA的含量范围为1.22-13.00g/L〇
[0021] 上述方法,步骤(1)中,所述样品光谱预处理的方法优选为一阶导数SG21点平滑和 均值中心化。
[0022] 上述方法,步骤(1)中,所述选择参与建模的变量的具体方法为:以RMSECV+RMSEP 值作为模型的评价指标,考察相关系数法(CC)、连续投影法(SPA)、无信息变量消除法 (UVE)、竞争自适应加权法(CARS)、稳定性竞争自适应加权法(SCARS)、前向偏最小二乘法 (FiPLS)、移动窗口偏最小二乘法(丽PLS)、反向偏最小二乘法(BiPLS)以及不同方法与SPA 联用法对建模结果的影响,最终优选的变量选择方法为:基于与SPA联用的方法,选择参与 建模的变量为35个。
[0023]上述方法,步骤(2)中,所述模拟不同批次人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程并取 样,具体为:模拟了 6批次醋酸缓冲液沉淀过程,得到74个pH值在4.50-5.55间的样品。
[0024]上述方法,步骤(2)中,将样品划分为校正集和验证集的划分方法包括随机(RS) 法、含量梯度法、KS法、SPXY法和Dup 1 er法;优选的,划分方法为Dup 1 ex法,选择的校正集样 品49个,验证集样品25个。
[0025] 上述方法,步骤(2)中,所述样品光谱预处理的方法包括:正交信号校正(0SC)、一 阶导数SG15点平滑、二阶导数SG15点平滑、0SC+-阶导数SG15点平滑、0SC+二阶导数SG15点 平滑、一阶导数SG15点平滑+0SC、二阶导数SG15点平滑+0SC。
[0026] 优选的,所述样品光谱预处理的方法为一阶导数SG15点平滑+0SC。
[0027] 上述方法,步骤(2)中,考察出参与建模的光谱区间为4613-4000(^-1、6538-5404cm-1、10000-73550^ 1。
[0028]需要说明的是,NIRS是一种间接测定技术,一级样品的线性关系对于模型结果具 有很大的影响,本发明所使用的样品,其一级数据稳定测定的难度大,为相应模型的建立带 来了一定的难度;而且,蛋白质结构复杂,在整个近红外光谱区都有吸收,因而造成特征区 间的选择较为困难;此外,生理盐水在近红外光谱区域具有强烈的吸收,会掩盖其他物质的 光谱信息,因此,有效信息的提取也是模型建立的关键问题。
[0029] 所采集的近红外光谱的原始谱图中包含的并不都是有用的信息,为了保证对样品 光谱的分辨,光谱的数据一般有数百到数千个数据点,但谱区中各个数据点包含的信息是 不相同的,需要对光谱进行预处理,以及运用算法压缩光谱数据,在全光谱中选择部分谱区 用于建立数学模型。而且基于物质的化学、物理结构的信息以及对光谱仪器的要求,光谱的 区间进行考察是很有必要的,并不是随意选择的。建立数学模型需要通过具体的试验进行 考察,不断的进行参数筛选,参数优化,才能获得稳定性和可靠性都比较好的模型。
[0030] 基于此,本发明所建立的用于HA含量的测定模型和用于pH值测定的模型,由于样 品本身的性质为相应近红外光谱模型的建立所带来的难度,以及模型建立过程中,对于光 谱预处理方法、光谱波段的选择方法、不同变量选择方法,等等,都需要技术人员根据实际 样品体系进行多方面多角度考察,这一过程所存在的难度远超出本领域技术人员常规选择 的范畴。
[0031] 本发明的有益效果:
[0032] 本发明首次利用近红外光谱分析技术建立了一种监测人血白蛋白醋酸缓冲液沉 淀过程的方法。能够有效实现人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程中HA含量和pH值的过程测 定,并可在过程中根据HA含量变化即时调整加醋酸缓冲液速率并准确及时的判断反应终 点,提尚了生广效率。
【附图说明】
[0033] 图1为HA含量测定模型建立中测得的醋酸缓冲液沉淀过程原始近红外光谱图; [0034]图2为参与HA含量测定模型建立的变量;
[0035]图3为HA含量预测值和参考值对比图;
[0036] 图4为pH值定量测定模型建立中测得的醋酸缓冲液沉淀过程原始近红外光谱图;
[0037] 图5为参与pH值定量测定模型建立的变量;
[0038]图6为pH值预测值和参考值对比图。
【具体实施方式】
[0039]结合实施例对本发明作进一步的说明,应该说明的是,下述说明仅是为了解释本 发明,并不对其内容进行限定。
[0040] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业渠道得到。
[0041] 实施例1:用于HA含量的测定模型的建立
[0042] (1)醋酸缓冲液沉淀过程:取100mL FIV压滤后上清液(山东泰邦生物制品有限公 司提供)置于圆底烧瓶中,然后将圆底烧瓶置于温度恒定的低温反应仪中;过程开始前取样 lmL然后开始滴加醋酸缓冲液,醋酸缓冲液的加入方式为前9次每次加0.2mL,后6次每次加 0.8mL;过程中每4min加一次醋酸缓冲液并取样lmL并做离心处理,一共重复8个批次。近红 外光谱的采集:Antaris II傅里叶变换近红外光谱仪的透射模块进行原始近红外光谱的采 集。光程4mm,光谱范围lOOOO-^OOcnf1,分辨率为8CHT1,扫描次数32;每小时进行一次背景 的采集,以空气作为参考。HA含量的测定:HA含量的测定方法为BCG法,采用市售的试剂盒进 行测定。
[0043] (2)引入缩小浓度区间的思想,即将HA含量变化不明显且对模型应用作用较小的 样品点去掉,保留含量变化趋势大的样品建立模型,从而提高模型的准确性和有效性。优选 的建模样品为每个批次的前11个取样点,HA的含量范围为1.22-13.00g/L。表1为全样品建 模和局部样品建模结果对比,由表1可以看出,局部样品建模的准确性和有效性得到明显的 提尚。
[0044] 光谱经过一阶导数SG 21点平滑和均值中心化的处理后采用多种变量选择方法选 择参与建模的变量,表2为不同变量选择方法,其中基于与SPA联用是指CC-SPA、UVE-SPA、 起来。以RMSECV+RMSEP值作为模型的评价指标,其值越小说明模型越好。结果显示BiPLS-SPA得到最小结果,但模型存在过拟合现象,因此基于与SPA联用法选择的35个变量建模得 到了最佳的模型结果,模型的 Rc;2、RP2、RMSEC、RMSECV、RMSEP分别为0.977、0.978、0.5971g/ L、0.7038g/L、0.5893g/L。
[0045] 表1全样品和局部样品建模结果比较
[0047] 表2不同变量选择方法建模对比
[0048]
[0049] (3)以3个批次的验集样品考察模型的预测能力,利用配对t检验进行统计学分析。 由表3配对t检验统计结果可知,NIRS法与传统的BCG法得到的结果的均值和标准差非常接 近,在95%的置信限下得到的P = 0.374>0.05,说明两种方法测定结果之间不存在显著性差 异,NIRS法可替代传统方法进行醋酸缓冲液沉淀过程HA含量的快速测定。
[0050] 表3验证集样品配对t检验统计结果
[0052]实施例2:用于pH值测定模型的建立
[0053] (1)醋酸缓冲液沉淀过程:模拟6批醋酸缓冲液沉淀过程,除第6批外其它5批酸沉 的步骤和实施例1(1)中的过程保持一致。第6批中在加酸13次后每次补加乙醇lml,共补加2 次,其余条件和前5批均一致。每次取样1.2ml并做离心处理。原始近红外光谱采集条件和实 施例1(1)中相同,气相色谱法测定样品乙醇含量,根据含量配制乙醇为10% (体积分数)的 样品,pH计测定样品的pH值。共得到74个样品的pH值,用于定量模型的建立,表4为样品pH值 信息表。
[0054] 表4样品pH值信息表
[0056] (2)为得到最优的样品集划分结果,考察了随机(RS)法、含量梯度法、KS法、SPXY 法、Duplex法等样品集划分方法对模型的影响,表5为样品集划分信息,表6为不同样品集划 分方法建模结果,以RMSEP值作为模型评价指标,最终选择的最佳样品集划分方法为 Duplex,得到校正集49个样品和验证集25个样品。
[0057]表5样品集划分信息表
[0059]表6不同样品集划分方法建模结果

[0061]在全波段范围内对光谱预处理方法进行考察,对比了 0SC、一阶导数SG15点平滑、 二阶导数SG15点平滑对建模结果的影响,表7为不同预处理后得到的建模结果,以RMSEP值 作为模型评价指标,优选出的最佳预处理方法为一阶导数SG15点平滑+0SC。
[0062] 表7不同预处理方法处理后建模结果
[0064]为得到最佳的建模区间,对样品光谱和背景光谱以及光谱的吸光度进行了考察, 去除生理盐水的背景光谱范围为:5400-5200〇1^和7350-6950011'考察的最佳光谱吸光度 范围为0.63-2.88。最终,选择用于建模的三个光谱区间为4613-4000011-^6538-5404(^-^ 10000-7355cm-S 模型参数为 Rc2 = 0.968,RP2 = 0.956,RMSEC = 0.0512,RMSECV = 0.0875, RMSEP = 0.0594。
[0065] (3)以验证集中25个样品对模型的预测能力进行验证,表8为配对t检验的统计学 结果,可见pH计测定结果的平均值和NIRS得到的结果均值相同。在95%的置信限下,P = 0.847>0.05,说明pH计的测定结果和近红外模型测定的结果没有显著性差异,证实了 NIRS 用于酸沉过程pH值测定的有效性。
[0066] 表8配对t检验统计结果
[0068] 实施例1和实施例2表明,本发明建立的用于HA含量测定的模型和用于pH值测定的 模型准确、可靠,能够有效实现人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程中HA含量和pH值的过程测 定。
[0069] 上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述,但并非对本发明保护范 围的限制,所属领域技术人员应该明白,在本发明的技术方案的基础上,本领域技术人员不 需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一种基于近红外光谱分析技术监测人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程的方法,其特征 在于,包括如下步骤: (1) 建立模型用于HA含量的测定: A、 模拟不同批次人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程并取样,采集样品的原始近红外光 谱,并采用常规方法对样品中HA含量进行检测,得离线指标成分化学测定值; B、 将步骤A的样品划分为校正集和验证集,对样品光谱进行预处理,然后比较不同变量 选择方法对建模结果的影响,选择参与建模的变量,建立PLSR模型用于HA含量的测定; C、 采用验证集的样品验证模型的预测能力; (2) 建立模型用pH值的测定: A、 模拟不同批次人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程并取样,采集样品的原始近红外光 谱,采用常规方法对样品中乙醇含量进行检测,并根据测定结果配制乙醇含量为10%的样 品,测定样品的pH值; B、 将步骤A的样品划分为校正集和验证集,对样品光谱进行预处理,并对建模区间进行 考察,建立PLSR模型用于pH值的测定; C、 采用验证集的样品验证模型的预测能力; (3) 利用步骤(1)和步骤(2)建立的模型对人血白蛋白醋酸缓冲液沉淀过程的HA含量和 pH进行过程测定。2. 如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述建立PLSR模型用于HA含量的 测定的过程中,引入缩小建模区的思想,去除HA含量变化不明显且对模型应用作用较小的 样品点,保留含量变化趋势大的样品建立模型。3. 如权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述建立PLSR模型用于HA含量的 测定的过程中,参与建模的样品为每个批次的前11个取样点,HA的含量范围为1.22-13.00g/L〇4. 如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述样品光谱预处理的方法为一 阶导数SG21点平滑和均值中心化。5. 如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,变量选择方法为:基于与SPA联用 的方法,选择参与建模的变量为35个。6. 如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述模拟不同批次人血白蛋白醋 酸缓冲液沉淀过程并取样,具体为:模拟6批次醋酸缓冲液沉淀过程,得到74个pH值在4.50-5.55间的样品。7. 如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,样品集的划分方法为随机法、含 量梯度法、KS法、SPXY法和Dup 1 ex法中的至少一种,优选为Dup 1 ex法。8. 如权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述样品光谱预处理的方法为 0SC、一阶导数SG15点平滑、二阶导数SG15点平滑、0SC+-阶导数SG15点平滑、0SC+二阶导数 SG15点平滑、一阶导数SG15点平滑+0SC和二阶导数SG15点平滑+0SC中的至少一种。9. 如权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述样品光谱预处理的方法为一 阶导数SG15点平滑+0SC。10. 如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,考察出参与建模的光谱区间为 4613-40000^1、6538-54040^ 1、10000-7355^^1。
【文档编号】G01N21/359GK106018336SQ201610640261
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月5日
【发明人】臧恒昌, 庞广礼, 王斐, 仲立军, 李 灿, 张惠, 王佳月, 范加金, 王鸣宇
【申请人】山东大学
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