双功能复合探针构建荧光/比色双模MiRNA传感器的制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于双功能纳米材料的金属增强荧光/比色双模生物传感器灵敏、快速检测MiRNA的方法。通过双模生物传感器的使用提高了检测结果的准确度，而双功能纳米材料因具有优良的磁性和增强荧光的性能即解决了可重复利用的问题又大大提高了检测的灵敏度。最后通过MiRNA与模板DNA特异性结合及磁性分离，沉淀用于再循环，上清液用于比色检测，实现了可视化、高灵敏、简便快速、节能的MiRNA检测。
【专利说明】
双功能复合探针构建荧光/比色双模M i RNA传感器
技术领域
[0001]本发明涉及易分离、可重复性利用、检测结果准确度高、高灵敏的MiRNA分析检测技术领域，更具体的说是一种双功能纳米复合探针用于构建三维金属增强荧光/比色双模MiRNA生物传感器。
【背景技术】
[0002]MiRNA被认定为是一种内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20?25个碱基序列。并且MiRNA在细胞生长、分化、凋亡、生物发育及疾病发生过程中发挥着巨大作用，近来，MiRNA生物学角色的调查和蛋白质临床应用引起了越来越多研究人员的关注。据报道，许多异常细胞过程的变化都伴随着MiRNA表达的变化。因此，MiRNA不仅会提供一个丰富的不同疾病生物标记物的平台，而且会大大提高疾病的诊断，减少假阳性的几率或替代传统的不舒服的诊断步骤。早期传统的检测MiRNA的方法有微阵列、电化学、比色、光致电及荧光等方法，但是单个检测方法得到的检测结果的可信度较低，并且不能实现重复利用、节能的理念。
[0003]在临床诊断中，通常会一起使用两种或更多的检测方法来得到一个更加可靠地诊断结果，因为单个的方法有其特定的优点和限制。荧光比色双模生物传感器是指将荧光检测方法与比色检测完美结合在一起，即结合了比色的简便、可视化的优点和荧光检测的高灵敏度、操作简单、专一等优点。使其检测结果的可靠性得到了大大的提高。
[0004]磁性纳米材料因其独特的磁学性能、生物相容性很好，被广泛应用在细胞和生物分子分离、磁共振成像等生物医学领域，因此近年来备受人们青睐。人们对磁性材料进行各种表面修饰从而实现其多功能化，进一步拓宽了磁性材料在各个领域的应用。对磁性材料进行贵金属纳米材料的修饰制备的双功能纳米材料具有优良的磁性和增强荧光的性能。因此，此双功能纳米材料即解决了可重复利用的问题又大大提高了检测的灵敏度。从而在磁学、荧光、生物和医药等领域得到了广泛的关注，尤其是在生物分子识别、药物传输等方面具有诱人的应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种易分离、可重复性利用、检测结果准确度高、高灵敏的三维金属增强荧光/比色双模生物传感器，用于MiRNA的快速、即时检测。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明是通过一种双功能复合纳米材料及三维金属增强荧光信号放大技术来实现的，其特征是包括以下步骤:
(1)制备双功能复合纳米材料；
(2)将氮硫掺杂碳点功能化的DNA链，定义为DNA1，与双功能复合纳米材料连接，形成信号探针，磁性洗涤；
(3)将二氧化铈功能化的DNA链，定义为DNA2，加入到步骤(2)的溶液中，产生信号完全猝灭，磁性洗涤； (4)将步骤(3)所得的溶液中加入不同浓度的MiRNA，所得的溶液放入荧光设备中，在激发波长360 nm和发射波长424 nm下进行焚光测定；
(5)将步骤(4)所得溶液磁性分离，在含有与MiRNA杂交的二氧化铈功能化的DNA2的上清液中加入过氧化氢，进行可视化的比色测定；
(6)将步骤(5)所得的沉淀中补充二氧化铈功能化的DNA2,磁性洗涤，重复步骤(Ο-Ν) ，使信号探针得以再循环。
[0007]本发明所述制备双功能复合纳米材料的步骤为:
(1)合成铁酸锌:将0.68g氯化锌，2.7 g六水氯化铁加入到80 mL乙二醇中，在室温下超声30 11^11，然后将7.2 g醋酸钠和2.0 g聚乙二醇-4000加入到上述溶液中，剧烈搅拌30min，紧接着将混合物转移到高压釜中，200 °C下加热8 h，最后，将得到的黑色产物洗涤、干燥；
(2)合成银立方:将10mL乙二醇加入到100 mL的圆底烧瓶中，在搅拌下150 °C油裕加热，随后，加入0.12 mL 3 mM硫氢化钠，2 min后，1.0 mL 3 mM盐酸加入到上述溶液中，紧接着加入2.5 mL 20 mg/mL聚乙烯吡咯烷酮，2 min后，0.8 mL 282 mM三氟乙酸银加入到混合物中，最后，用丙酮和水各洗三次；
(3)合成双功能复合纳米材料:将10.0mg铁酸锌溶解在I mL的水中，加入I mL 1%聚二烯丙基二甲基氯化铵，超声30 min，水洗三次，随后，加入0.5 mL的银立方，搅拌I h，最后，水洗。
[0008]本发明所述的双功能复合纳米材料是指既能利用其磁性进行磁性分离，使信号探针可重复利用，又可以利用银立方来增强荧光信号。
[0009]本发明所述的步骤(2)中所述DNAd.定的碱基序列以及其5’端修饰上巯基，其3 ’端修饰上氮硫掺杂碳点。
[0010]本发明所述步骤(3)中所述DNA2特定的碱基序列以及其5’端修饰上二氧化铈。
[0011]本发明所述信号探针的再循环的步骤为:将步骤(5)所得的沉淀中补充二氧化铈功能化的DNA2,产生信号的完全猝灭，磁性洗涤，重复步骤(3)-(5)，使信号探针得以再循环。
[0012]本发明的有益效果
(I)磁性材料的使用不仅使物质分离更加简单，而且使信号探针得到了很好的重复利用。
[0013](2)银立方的使用，有效增大了几倍的荧光信号，灵敏度大幅度的提高。
[0014](3)掺杂的量子点比普通的量子点具有更好的荧光特性，并具有高稳定、高荧光产率、超灵敏及长发光寿命等优点。
[0015](4)通过比色/荧光双模式生物传感器的联用，使得检测结果准确度大大提高。
【附图说明】
[0016]图1:为本文所述方法的原理图。
【具体实施方式】
[0017]为了更好地理解本发明，下面通过实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。
[0018]实施例1
双功能复合探针构建荧光比色双模MiR210传感器:
(1)制备双功能复合纳米材料:将0.68g氯化锌，2.7 g六水氯化铁加入到80 mL乙二醇中，在室温下超声30 11^11，然后将7.2 g醋酸钠和2.0 g聚乙二醇-4000加入到上述溶液中，剧烈搅拌30 min，紧接着将混合物转移到高压釜中，200 °C下加热8 h，最后，将得到的黑色产物洗涤、干燥；
将10 mL乙二醇加入到100 mL的圆底烧瓶中，在搅拌下150 °(:油裕加热，随后，加入
0.12 mL 3 mM硫氢化钠，2 min后，1.0 mL 3 mM盐酸加入到上述溶液中，紧接着加入2.5mL 20 mg/mL聚乙烯吡咯烷酮，2 min后，0.8 mL 282 mM三氟乙酸银加入到混合物中，最后，用丙酮和水各洗三次；
将10.0 mg铁酸锌溶解在I mL的水中，加入I mL 1%聚二烯丙基二甲基氯化铵，超声30 min，水洗三次，随后，加入0.5 mL的银立方，搅拌I h，最后，水洗；
(2)将氮硫掺杂碳点功能化的DNA链，定义为DNA1，与双功能复合纳米材料连接，形成信号探针，磁性洗涤；
(3)将二氧化铈功能化的DNA链，定义为DNA2，加入到步骤(2)的溶液中，产生信号猝灭，磁性洗涤；
(4)将步骤(3)所得的溶液中加入不同浓度的MiR210，所得的溶液放入荧光设备中，在激发波长360 nm和发射波长424 nm下进行焚光测定；
(5)将步骤(4)所得溶液磁性分离，在含有与MiRNA杂交的二氧化铈功能化的DNA2的上清液中加入过氧化氢，进行可视化的比色测定；
(6)将步骤(5)所得的沉淀中补充二氧化铈功能化的DNA2,磁性洗涤，重复步骤(Ο-Ν) ，使信号探针得以再循环。
【主权项】
1.双功能复合探针构建荧光比色双模MiRNA传感器，其特征是包括以下步骤: 1.1制备双功能复合纳米材料； I.2将氮硫掺杂碳点功能化的DNA链，定义为DNA1，与双功能复合纳米材料连接，形成信号探针，磁性洗涤； 1.3将二氧化铈功能化的DNA链，定义为DNA2，加入到步骤1.2的溶液中，产生信号完全猝灭，磁性洗涤； 1.4将步骤1.3所得的溶液中加入不同浓度的MiRNA，所得的溶液放入荧光设备中，在激发波长360 nm和发射波长424 nm下进行焚光测定； 1.5将步骤1.4所得溶液磁性分离，在含有与MiRNA杂交的二氧化铈功能化的DNA2的上清液中加入过氧化氢，进行可视化的比色测定； 1.6将步骤1.5所得的沉淀中补充二氧化铺功能化的DNA2，磁性洗涤，重复步骤1.4-1.6，使信号探针得以再循环。2.根据权利要求书I所述双功能复合探针构建荧光/比色双模MiRNA传感器，其特征在于，制备双功能复合纳米材料，具体步骤如下: 首先合成铁酸锌:将0.68 g氯化锌，2.7 g六水氯化铁加入到80 mL乙二醇中，在室温下超声30 11^11，然后将7.2 g醋酸钠和2.0 g聚乙二醇-4000加入到上述溶液中，剧烈搅拌30min，紧接着将混合物转移到高压釜中，200 °C下加热8 h，最后，将得到的黑色产物洗涤、干燥； 合成银立方:将10 mL乙二醇加入到100 mL的圆底烧瓶中，在搅拌下150 °C油裕加热，随后，加入0.12 mL 3 mM硫氢化钠，2 min后，1.0 mL 3 mM盐酸加入到上述溶液中，紧接着加入2.5 mL 20 mg/mL聚乙烯吡咯烷酮，2 min后，0.8 mL 282 mM三氟乙酸银加入到混合物中，最后，用丙酮和水各洗三次； 合成双功能复合纳米材料:将10.0 mg铁酸锌溶解在I mL的水中，加入I mL 1%聚二烯丙基二甲基氯化铵，超声30 min，水洗三次，随后，加入0.5 mL的银立方，搅拌I h，最后，水洗。3.根据权利要求书I所述双功能复合探针构建荧光/比色双模MiRNA传感器，其特征在于，双功能复合纳米材料是指既能利用其磁性进行磁性分离，使信号探针可重复利用，又可以利用银立方来增强荧光信号。4.根据权利要求书I所述双功能复合探针构建荧光/比色双模MiRNA传感器，其特征在于，步骤1.2中所述DNAi特定的碱基序列以及其5 ’端修饰上巯基，其3 ’端修饰上氮硫掺杂碳点。5.根据权利要求书I所述双功能复合探针构建荧光/比色双模MiRNA传感器，其特征在于，步骤1.3中所述DNA2特定的碱基序列以及其5，端修饰上二氧化铺。6.根据权利要求书I所述双功能复合探针构建荧光/比色双模MiRNA传感器，其特征在于，信号探针的再循环，具体步骤如下:将步骤1.5所得的沉淀中补充二氧化铈功能化的DNA2，产生信号的完全猝灭，磁性洗涤，重复步骤1.4-1.6，使信号探针得以再循环。
【文档编号】G01N21/64GK106018372SQ201610566984
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月19日
【发明人】梁琳琳, 葛慎光, 于京华, 兰飞飞, 李丽, 任娜
【申请人】济南大学