一种基于上转换荧光纳米粒子快速检测农药残留的免疫层析试纸及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于上转换荧光纳米粒子快速检测农药残留的免疫层析试纸及其制备方法，属于化学鉴定技术领域领域。本发明的农药试纸包含试纸板、样品滴加单元、检测单元以及样品回收单元；样品滴加单元、检测单元以及样品回收单元均连接于所述试纸板上；所述检测单元位于所述试纸板的中间；所述检测单元包含抗原包被液以及封闭液。本发明的有益效果为：试纸具有“快速、简便、特异、敏感、低成本”的特点，特别是其“快速、简便”的特点，特别适合于广大基层单位、野外作业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查等，显示巨大的发展潜力和应用前景，被认为是食品安全检测最有前途的新技术之一，已成为食品安全检测的主要发展趋势。
【专利说明】
一种基于上转换荧光纳米粒子快速检测农药残留的免疫层析 试纸及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及化学鉴定技术领域，特别是一种基于上转换荧光纳米粒子快速检测农 药残留的免疫层析试纸及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 在20世纪80年代初，在西方发达国家兴起了一种快速检测的技术，其原理是通过 胶体金结合垫、纳米材料结合垫、量子点结合垫、荧光素结合垫等的毛细管作用，用与结合 垫相对应的材料进行标记，经过硝酸纤维素膜作用，抗体和抗原在此特异性结合，将此技术 称为免疫层析试纸检测技术。用于标记的这些物质都具有肉眼可见或在紫外光激发下看出 抗体与抗原特异性结合的颜色或荧光显现。免疫层析试纸条因其快速、简便及操作简单等 特点，其使用领域也越来越广，且得到了很好的发展。用于试纸条标记的材料也越来越多。
[0003] 免疫层析试纸主要组成部分为样品垫、标记物结合垫、硝酸纤维素 (Nitrocellulose，NC)膜、T线（检测线）、C线（质控线）、吸水垫、聚氯乙稀 (Polyvinlchloride，PVC)底板。如胶体金试纸，由于胶体金的特点，试纸制备原理分为竞争 法和夹心法。竞争法：当联有待测抗原的样品滴加到样品垫上时，通过毛细管作用，样品向 前移动，到胶体金结合垫上时，样品中的抗原会与抗体特异性结合。到达T线时，T线上的抗 体会与样品中剩余的抗体特异性结合，变红。样品再继续移动，到达C线时，再次与C线上的 抗体反应，变红。当试纸条上出现两条红线时，说明样品中的抗原含量低于检测线，呈阴性。 反之，当样品中的抗原含量高于检测限时，在胶体金结合垫上抗原大部分与抗体特异性结 合，T线未出现红色，而C线出线红色，则为阳性。无论样品中的待测抗原高于还是低于检测 线，C线都应出现，否则试纸条无效。与之实验结果相反，出现两条红线为阳性，一条红线为 阴性的方法为夹心法。
[0004] 农药残留问题是随着农药大量生产和广泛使用而产生的。到目前为止，世界上化 学农药年产量近200万吨，约有1000多种人工合成化合物被用作杀虫剂、杀菌剂、杀藻剂、除 虫剂、落叶剂等类农药。农药尤其是有机农药大量施用，造成严重的农药污染问题，成为对 人体健康的严重威胁。
[0005] 免疫试纸技术在医学、兽医诊断，农业，生物福利，食品安全，环境安全，工业检测， 甚至新出现的分子诊断及纳米治疗领域都有广泛的应用，具有非常广泛的应用前景。在食 品安全检测领域里，主要涉及到兽药、农药残留，违禁添加物、生物毒素、重金属、环境毒素 等，基本上大多数的食品安全检测涉及的都可以应用到。技术上来说，免疫试纸检测技术具 有"快速、简便、特异、敏感、低成本"的特点，特别是其"快速、简便"的特点，适用于现场巨量 样品检测，有着巨大的应用前景，被认为是食品安全检测最有前途的新技术之一，已成为食 品安全检测的主要发展趋势。
[0006] 目前农药残留分析主要采用仪器分析和免疫分析方法。我们国家用的最多的，按 照试验数来算的话，就是试纸。其他的技术当然都在用，但是试验的绝对数都没有试纸多， 气-质色谱、液-质色谱难以应付巨量的样品。其中仪器分析法具有灵敏度、准确度高和精密 度好等优点，但存在样品前处理繁琐、试剂用量大、费时、分析成本高，需昂贵的仪器设备等 缺点，不适合现场快速检测。纳米生物技术是纳米技术与生物技术交叉渗透形成的新技术， 利用纳米生物技术对细胞内外物质分析和检测、疾病早期诊断、生物分子的示踪标记等研 究一直是国内外相关领域的研究重点。为了能实现食品及环境中农药残留的快速检测，科 学工作者开始关注上转换(将长波长光转换为短波长光发射的过程)纳米荧光材料。上转换 纳米荧光材料是一类用980nm红外光做激发光源的材料，用此激发光做激发源的材料光穿 透度较深，在生物组织内不会发光，故不产生背景荧光，对生物组织的损伤几乎为零。合成 该类材料的物质毒性较小，且具有良好的化学稳定性，发光强度较好，它的吸收和发射带 窄，从而降低检测背景，提高信噪比，这些特征导致上转换纳米荧光材料拥有非常好的生物 应用前景。建立起基于上转换纳米材料快检农药多（单)残留的方法无疑是非常重要的，到 目前为止，上转换纳米荧光材料已在细胞标记、生物大分子检测、小动物成像、光动力学疗 法及药物输送等方面得到了应用。但将上转换纳米荧光材料用作标记物，与免疫层析技术 相结合进行小分子农药残留的分析还未见报道。利用上转换纳米材料快速检测农药多(单） 残留的分析方法，对发展快检农药多残留检测技术具有重要的理论研究和实际应用意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，制作出纳米级上转换发光材料。本发明 提供快速检测农药残留的免疫层析试纸，所述试纸包含:试纸板、样品滴加单元、检测单元 以及样品回收单元;样品滴加单元、检测单元以及样品回收单元依次相连且均连接于所述 试纸板上;所述样品滴加单元与样品回收单元位于所述试纸板的两端，所述检测单元位于 所述试纸板的中间;所述检测单元包含纳米粒子标记结合垫、检测线和质控线;所述检测线 位于所述纳米粒子标记结合垫和所述质控线之间；所述纳米粒子标记结合垫包含抗原包被 液以及上转换焚光纳米粒子标记抗体试样;所述上转换焚光纳米粒子标记抗体试样为β-NaYF4: Yb3+/Er3+标记 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液。
[0008] 优选地，所述检测线以及质控线均位于层析膜上，纳米粒子标记结合垫与所述层 析膜相连;所述层析膜为NC硝酸纤维素膜。
[0009] 优选地，所述纳米粒子标记抗体试样中i3-NaYF4: Yb3+/Er3+标记2，4-D-IgG的含量为 0.00666-0.132yg/mL〇
[0010] 优选地，所述检测线上的标记物为2，4-D-0VA，所述质控线的标记物为羊抗兔二 抗。
[0011] 本发明还保护检测农药残留试纸的制备方法，包含下列步骤:S1.制备水溶性稀土 上转换纳米材料;S2.制备农药多克隆抗体以及检测所述农药多克隆抗体的效价;S3.利用 所述步骤S1制备的产物标记所述农药多克隆抗体;S4.利用所述步骤S3产物制备检测农药 残留试纸。
[0012]优选地，所述步骤S1包含：
[0013] S1.1将稀土氯化物、油酸以及十八烯置于烧瓶中搅拌抽真空30min，后停止搅拌加 执. ，
[0014] S1.2将NaOH、NH4HF2以及甲醇置于烧杯中放入搅拌子，封上封口膜，于磁力搅拌器 上常温搅拌；
[0015] S1.3将所述步骤SI. 1产物加热到150°C，保温15~20min即可，随即关闭搅拌，关闭 加热，使之降低至室温；
[0016] S1.4尽量少进空气的情况下滴加S1.2溶液，反应完全后通入N2,将滴加过程中进 入的空气排尽；
[0017] S1.5 将体系加热至75-85。(：，保温1.511;
[0018] S1.6在0.5h内将所述步骤S1.5的产物升温至310°C，N2保护下保温2h，随即在N 2保 护及搅拌下冷却至室温；
[0019] S1.7洗涤产物；
[0020] S1.8利用所述步骤S1.7产物制备水溶性0-NaYF4:Yb3+，Er 3+纳米粒子。
[0021 ]优选地，所述步骤S1.8包含:SI. 8.1将所述步骤S1.7的产物、环己烷、叔丁醇、去离 子水以及K<03溶液室温下混合搅拌；S1.8.2将KMn〇4和NaI〇4水溶液缓慢滴入所述步骤 SI. 8.1的产物，40°C下反应48h，用95 %乙醇洗涤离心得初产物；S1.8.3初产物溶于HC1中， 常温下搅拌反应，反应结束后离心洗涤离心得到产物。
[0022] 优选地，所述步骤S3包含：S3.1分别配置pH=5以及pH = 7.4的磷酸缓冲盐溶液； S3.2制备水溶性 0-NaYF4: Yb，Er 标记 2，4-D-I gG。
[0023] 优选地，所述步骤S3.2为:S3.2.1取经KMn〇4_NaI〇4氧化溶于水的P_NaYF4: Yb，Er制 成溶液A，向所述溶液A中加入所述步骤S3.1制备的pH=5的roS缓冲液后，加入EDC与Sulfo-NHS，常温搅拌;S3.2.2向所述步骤S3.2.1的产物中加入2，4-D-IgG，常温反应2h，离心出产 物;将所述产物用PBS洗2遍后定容于所述步骤S3.1制备的pH=7.4的PBS缓冲液中。
[0024] 本发明的优点和积极效果是:上转换纳米荧光材料具有有机染料和量子点材料无 法比拟的优势，如毒性小、化学稳定性高、发光强度高、光稳定性好、吸收和发射带窄和荧光 寿命长等;此外980nm红外激光作激发源也有许多优势，例如较深的光穿透深度、对生物组 织几乎无损伤、生物组织不会发光(无背景荧光），从而降低检测背景，提高信噪比，这些特 征导致上转换纳米荧光材料拥有非常好的生物应用前景。建立起基于上转换纳米材料快检 农药多残留的方法无疑是非常重要的，利用上转换纳米材料快速检测农药多(单)残留的分 析方法，对发展快检农药多残留检测技术具有重要的理论研究和实际应用意义。免疫试纸 技术在医学、兽医诊断，农业，生物福利，食品安全，环境安全，工业检测，甚至新出现的分子 诊断及纳米治疗领域都有广泛的应用，具有非常广泛的应用前景。在食品安全检测领域里， 主要涉及到兽药、农药残留，违禁添加物、生物毒素、重金属、环境毒素等，基本上大多数的 食品安全检测涉及的都可以应用到。技术上来说，免疫试纸检测技术具有"快速、简便、特 异、敏感、低成本"的特点，特别是其"快速、简便"的特点，特别适合于广大基层单位、野外作 业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查等，显示巨大的发展潜力和应用前景，被认 为是食品安全检测最有前途的新技术之一，已成为食品安全检测的主要发展趋势。
【附图说明】
[0025]图1为合成f3_NaYF4:Yb3+，Er3+纳米粒子的扫描电镜图；
[0026] 图2为0-NaYF4:Yb3+，Er3+纳米粒子的透射电镜图；
[0027] 图3为水溶性β-NaYF4:Yb3+，Er3+上转换纳米粒子的TEM图；
[0028] 图4为水溶性0-NaYF4:Yb3+，Er3+上转换纳米粒子标记2,4-D-IgG后的TEM图；
[0029]图5为在595nm吸收波长下，BSA的浓度与吸光度的关系曲线；
[0030]图6为检测农药单残留的免疫层析试纸结构图；
[0031]图7为不同浓度试样筛选结果判据图，A-E为不同浓度的标记上转换纳米粒子的抗 体试样；
[0032]图8为试纸的灵敏度示意图，A:阴性B:阳性T:检测线C:质控线；
[0033] 图9确定试纸条检测2,4-D农残灵敏度结果图；
[0034] 图10确定试纸条检测2,4-D农残灵敏度结果图；
[0035]图11为2,4-D标准样的液相色谱图；
[0036]图12为样品梨中的2,4-D含量；
[0037]图13为样品苹果中的2,4-D含量；
[0038]图14为样品黄瓜中的2,4-D含量；
[0039]图15为样品西红柿中的2,4_D含量；
[0040] 图16为样品大米中的2,4-D含量；
[0041] 图17为样品小米中的2,4-D含量；
[0042] 图18为试纸条验证结果图，a:梨，b:苹果，c:黄瓜，d:西红柿，e:大米，f:小米。
[0043]附图标记：
[0044] 1-试纸板、2-样品滴加单元、3-纳米粒子标记结合垫、4-检测线、
[0045] 5-质控线、6-样品回收单元、7-层析膜、A-样品流动方向。
【具体实施方式】
[0046] 近年来因为稀土上转换纳米材料的光学性质，使其在生物领域的应用有着大量可 待开发的潜能。0-NaYF4: Yb3+，Er3+(Tm3+)是目前为止发现的上转换效率最高的材料，故其在 生物检测与标记方面获得广泛关注。但是，因制备得到的稀土上转换纳米材料是油溶性材 料，需利用KMn〇4/NaI〇4将油溶性纳米粒子转变成水溶性纳米粒子。本文利用高温热分解法 制备了油酸包覆的f3-NaYF4: Yb3+，Er3+纳米粒子。
[0047] 1、稀土上转换纳米材料的制备
[0048] (1)实验仪器与实验试剂
[0049] 表1实验仪器一览表
[0051 ] 表2化学试剂一览表
[0054] (2)制备稀土氯化物
[0055] 将稀土氧化物10g倒入新烧杯中，加入5ml蒸馏水，加入浓度37%的HC1 50-60ml， 搅拌，若太浓稠则继续加入HC1。
[0056]微溶后，置于铺有石棉网的电炉上加热至沸腾，若一直未澄清，则再加入20-30ml HC1，沸腾至剩余溶液为原来一半后仍未澄清，则继续加入浓度为37 %的HC1，直至澄清。 [0057]澄清后的溶液沸腾蒸干至溶液开始出现大气泡时，加入蒸馏水80ml，冲洗杯壁及 玻璃棒。反复重结晶四次左右最后一次蒸干后快速搅拌成结晶状，装管。
[0058] (3)高温热分解法制备油溶性i3_NaYF4: Yb3+，Er3+上转换荧光纳米粒子
[0059]①将稀土氯化物（2mmol)[YCl3 · 6H20(78%)、YbCl3.6H20(20%)、ErCl3.6H20 (2 % ) ]、90 %油酸（12ml)、90 %十八烯（30ml)置于三口烧瓶中，放入搅拌子，抽真空，30min 后加热。抽真空时放在热电偶上，只搅拌不加热。
[0060] ②将Na0H(5mmol)、NH4HF2(5mmol)、无水甲醇（10ml)置于小烧杯中，放入搅拌子，封 上封口膜，置于磁力搅拌器上常温搅拌。
[0061 ]③步骤①中抽真空完毕，在15min内将三口烧瓶中溶液加热到150 °C，保温15~ 20min即可，随即关闭搅拌，关闭加热，使之降低至室温。
[0062]④尽量少进空气的情况下加入步骤2中的溶液，缓慢逐滴滴加，使之充分反应。滴 加结束后开始通入N2，通入30min左右，将滴加过程中进入的空气排尽。
[0063]⑤排尽空气后将体系加热至80°C(15-20min左右升至80°C)，温度变化范围在5°C 以内，不能低于80°C，保温1.5h。
[0064] ⑥保温1.5h后，在0.5h内将溶液升温至310°C，充分反应，N2保护下保温2h。随即在 N2保护及搅拌下冷却至室温。
[0065] ⑦洗涤产物:将离心机调至9000r/min，时间设定为lOmin，用无水乙醇将产物洗涤 一遍;环己烷:无水乙醇以1:3比例混合将产物洗涤两遍;无水乙醇将产物洗涤两遍;95 %乙 醇将产物洗涤两遍。将离心管放入干燥箱干燥产物。
[0066] (4)水溶性0_NaYF4: Yb3+，Er3+纳米粒子的制备
[0067] 将上述制备好的0-似丫?4:￥133+31'3+(5〇11^)、环己烧（5〇1111)、叔丁醇（351111)、去离子 水（51111)以及5￥七％1( 20)3溶液（2.51111)室温下混合搅拌2〇1^11。将1〇1111含2.85111111〇1疆11〇4和 0.0525mmol NaI〇4水溶液缓慢滴入。40°C下反应48h，用95%乙醇洗涤离心（9000r/min)产 物得初产物。初产物溶于12.5ml pH为4-5的HC1，常温下搅拌反应30min。反应结束9000r/ min离心，最后用95%乙醇洗涤离心得到产物。将产物分散于15ml去离子水中待用。
[0068] (5 )0-NaYF4: Yb3+，Er3+纳米粒子的表征
[0069] a)SEM 分析
[0070]从图1的SEM照片可看到高温热解法合成的i3_NaYF4: Yb3+，Er3+上转换纳米粒子，其 形貌为实心的纳米球，颗粒大小均勾，粒径为30nm左右，从SEM图片也可观察到产物物相纯 净。
[0071] b)TEM 分析
[0072]从图2的TEM照片可看到高温热解法合成的i3-NaYF4:Yb3+，Er3+纳米粒子，其形貌为 实心的纳米球，颗粒大小均勾，粒径为30nm左右，从TEM图片也可观察到产物物相纯净。 [0073] 从图3可看出，氧化后的i3_NaYF4:Yb，Er纳米粒子的形貌和粒径尺寸均未发生改 变，仍为粒径在30nm左右的球状粒子。
[0074] 2、农药多克隆抗体的制备及效价
[0075] (1) 2，4-D农药多克隆抗体(IgG)的制备及效价
[0076]将一定量免疫抗原（2，4-D-BSA)的生理盐水溶液与等量的弗氏完全佐剂混合，充 分乳化，免疫2只新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400yg/次，2-3周免疫一次，免疫4次。在每 次加强免疫后第10天于耳静脉采血，离心获得血清，以ELISA方法测定血清效价，直至效价 大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，使用Protein A亲和纯化的方法获得高效价多克 隆抗体(IgG)。
[0077] 表3抗体间接Elisa结果
[0079] (2)水溶性0-NaYF4:Yb3+，Er3+纳米粒子标记农药多克隆抗体(2,4-D-IgG)
[0080] a)水溶性 0-NaYF4: Yb，Er 标记 2，4-D-IgG
[0081 ] i ·磷酸缓冲盐溶液(PBS)的配制(0 · 01M)
[0082] 将似<：1(0.88)、1((：1(0.0028)、似2耶04(0.1448)、1〇12?04(0.0248)用水定容至 100ml，即可得到pH=7 · 4的PBS溶液。
[0083] 配制pH=5的PBS溶液，用30 % HC1将上述溶液pH调至5 · 0即可。
[0084] i i ·水溶性0-NaYF4: Yb3+，Er3+标记2，4-D-IgG的方法
[0085] 取经KMn〇4_NaI〇4氧化溶于15ml水的0-他￥?4:￥133+34 +，向上述溶液中加入1511^ 卩85(卩!1=5)缓冲液后，加入0.011528(0.000384\301111#0(：与0.032578 5111化-顯5 (0 · 00108565 X 30ml)，常温搅拌30min，活化羧基。加入50yL(C= 260mg/ml) IgG，常温反应 2Κ9000γρπι离心出产物，产物用PBS(pH=7.4)洗2遍后定容于15ml PBS(pH=7.4)中。
[0086] 从图4可看出，0-似￥?4^3+也3+偶联2,4-〇-186后，与偶联前的氧化产物相比（见 图4)，因此其形貌发生了变化，纳米粒子的表面覆盖了一层物质，粒径约为50nm左右。
[0087] b)考马斯亮蓝法定量分析蛋白的含量
[0088] ①配制布拉德福德试剂:取考马斯亮蓝G-250 50mg置于200ml烧杯中，加入25ml的 95%乙醇使其溶解，随后加入60ml 85% (w/v)的磷酸，转移至500ml容量瓶，用去离子水稀 释至500ml。溶液需现配现用。
[0089] ②配置 BSA 浓度分别为0，0 · 02，0 · 04,0 · 06，0 · 08 和0 · 10mg/mL的标准液各 1 · OOmL。
[0090] ③取②中的配置好的BSA溶液中分别放入指定试管中，根据顺序分别加入5.OOmL 的布拉德福德试剂，摇晃均匀，反应2min后，用作待测液。设定紫外分光光度计的吸收波长 在595nm，用待测液进行吸光度测定。
[0091] 根据顺序的得到的测定结果如下:0，0.164，0.349，0.508，0.648，0.813。由浓度及 吸光度作图可知二者有如下的线性关系。见图5,回归方程为：Y = 8.108X+0.0089(R2 = 0.998)
[0092] X为BSA浓度，Y为吸光度。经测定，样品0-似￥?4:￥133+此3+标记2,4-〇-186的吸光度 为〇. 195，根据蛋白质标准曲线计算出i3-NaYF4: Yb，Er标记2，4-D-IgG表面的2，4-D-IgG偶联 率为2 · 67% (含2，4-D-IgG 23 · lyg/mL)。这个结果进一步表明，2，4-D-IgG已被f3-NaYF4: Yb， Er纳米粒子成功标记。
[0093] 3、农药单残留检测免疫层析试纸的制备
[0094] 表4化学材料一览表
[0096] 表5实验仪器一览表
[0098] (1)免疫层析试纸条的组装
[0099] 农药单残留检测免疫层析试纸条的结构如图6所示。试纸条包含试纸板1、样品滴 加单元2、检测单元以及样品回收单元6。
[0100] 样品滴加单元2、检测单元以及样品回收单元6依次相连且均连接于所述试纸板1 上;所述试纸板1为PVC胶板。所述样品滴加单元2与样品回收单元6位于所述试纸板1的两 端，所述检测单元位于所述试纸板1的中间。
[0101 ]所述检测单元包含纳米粒子标记结合垫3、检测线4和质控线5;所述纳米粒子标记 结合垫3包含抗原包被液以及上转换焚光纳米粒子标记抗体试样;所述上转换焚光纳米粒 子标记抗体试样为0-NaYF4: Yb3+/Er3+标记2，4-D-IgG的roS溶液。所述抗原包被液以及所述 上转换焚光纳米粒子标记抗体试样可由前述制备方法制得。
[0102] 检测线4以及质控线5均位于层析膜7上。纳米粒子标记结合垫3与层析膜7相连，层 析膜7为NC硝酸纤维素膜。
[0103] (i)利用水溶性绿色0-NaYF4: Yb3+，Er3+纳米粒子标记2，4-D-IgG检测2，4-D免疫层 析试纸的制备方法
[0104] a)抗原包被液的选择
[0105] 用于农药试纸检测线(T线）的确定。准确称取2,4-D 250mg，加入10mL DMF(N，N-二 甲基甲酰胺）溶解，再向此溶液中依次加入50.OyL 99%三正丁胺和30yL 98%氯丁酸异丁 酯，室温磁力搅拌过夜；再将此溶液在搅拌状态下缓慢滴加到溶有450mg 0VA的 20mL0 · 05mol/L pH9 · 6的碳酸缓冲液中，搅拌反应24h;此反应液在4°C下对0 · 01mol/L pH7.4的磷酸缓冲液透析(透析6次，每次6小时、500ml透析液，透析袋用之前需用沸水煮10 分钟，透析时需放入4°C冰箱中），透析液3500rpmn离心10min，上清液冷冻干燥，得合成抗 原。取10mg合成抗原定容于50mL容量瓶，配成0.2mg/mL包被液。
[0106] b)纳米粒子标记抗体浓度的选择：
[0107] 备用试纸条的确定。配制不同浓度的标记上转换纳米粒子的抗体试样，在980nm光 的激发下，观察所划线的发光强度选择最适浓度。
[0108] A: 200yL含 0 · O33Oμg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+标记 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液；
[0109] B: 200yL含0 · 1665μg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+标记 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液；
[0110] C: 200yL含 0 · 333Oμg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+标记 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液；
[0111] D: 200yL含 0 · 4995μg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+标记 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液；
[0112] E: 200yL含 0 · 66OOμg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+标记 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液。
[0113] 实验结果如图7以及表6所示：
[0114]表6 代表荧光强度）
[0116]如图7所示，在980nm波长光照射NC膜进行结果判定。由包被液筛选结果(表6和图 7)可知，不同浓度的标记上转换纳米粒子的抗体试样C: 200yL含0.3330μg/mlf3-NaYF4: Yb3+/ Er3+标记IgG的PBS溶液，NC膜上的线荧光强度最强，其他浓度纳米粒子标记抗体试样的试纸 条荧光强度就弱。由上述结构可知，当不同浓度的标记上转换纳米粒子的抗体试样中含有 C: 200yL含 Ο · 333Oμg/ml0-NaYF4: Yb3+/Er3+标记 2，4-D-IgG 的 PBS 溶液时效果最佳，检测线（T 线)为2,4-D包被抗原，质控线(C线）为羊抗兔二抗，将该试样滴加在样品垫上，干燥后可作 为检测2，4-D含量的备用试纸条。
[0117] (2)水溶性绿色0-NaYF4: Yb3+，Er3+纳米粒子标记2，4-D-IgG检测2，4-D免疫层析试 纸的灵敏度确定
[0118] 由（1)中制得的备用试纸条进行下一步操作。用免疫层析试纸技术检测时有竞争 法和夹心法两种方法，因2,4_D属于小分子化合物，即用竞争法来检测。由试纸条原理可知， T线上的标记物为2,4-D-0VA，C线的标记物为羊抗兔二抗，制备得到的含有2,4-D抗原的样 品滴加到试纸条的样品垫上，样品会随着试纸条的纳米粒子结合垫、NC膜向前移动，如果样 品中含有的2,4-D低于试纸条的检测限，在到达T线时，会与线上的2,4-D-0VA反应，反应后 的T线在980nm光的激发下可看到一条绿色荧光线。然后样品继续向前移动，到达C线时，与C 线的标记物羊抗兔二抗反应，反应后的C线在980nm光的激发下也可看到一条绿色荧光线。 若同时出现两条绿色荧光线，则说明样品呈阴性(如图8-A)。相反，如果样品中的2,4-D高于 检测限浓度时，样品到达纳米粒子结合垫时大部分会与抗原先反应，剩余的少量部分继续 向前移动，此时的抗原较少，不够与T线上的2,4-D-0VA发生反应，所以在980nm光的激发下， 不能看见绿色荧光。然后样品继续向前移动，到达C线时，与C线的标记物羊抗兔二抗反应， 反应后的C线在980nm光的激发下也可看到一条绿色荧光线。当只有一条绿色荧光线时（如 图8-B )，样品呈阳性。若两条线都不出现，说明试纸条失败。
[0119] (3)2,4_D农药残留检测限的确认
[0120] 表7灵敏度的测定(500~lng)
[0122] (备注："+"、分别表示阳性和阴性）
[0123] 表8灵敏度的测定（10~lng)
[0125] (备注："+"、分别表示阳性和阴性）
[0126] 由表7、8和图9、10可知，试纸条检测含量在10ng/mL以上的2,4-D标准液时，结果都 为阳性。对此浓度进一步实验，发现在检测浓度为5ng/mL的2,4-D时，可观测到样本试纸条T 线。因此，试纸条的检测灵敏度确定为5ng/mL。
[0127] 由上述实验可得，因为确定了 2,4-D包被OVA的浓度，将检测线定在5ng/mL。当在适 当范围内调节2,4-D包被0VA的浓度可调节试纸条的灵敏度。检测线可变。
[0128] (4)免疫层析试纸条使用方法
[0129] 将适量样品提取液滴加到NC膜上，lOmin后，用980nm波长光照射NC膜部位进行结 果判定：
[0130]①如T线和C线出现相同的荧光，则为阴性，即农药含量低于设计检测限量，见图7-B〇
[0131] ②如T线不产生荧光，C先有荧光，则为阳性，即农药含量高于设计检测限量，见图 7_A〇
[0132] ③如T线和C先均不产生荧光，说明检测失败。
[0133] (5)基于上转换纳米粒子免疫层析试纸检测农残含量与仪器分析法对比
[0134] 1)液相色谱分析水果、蔬菜及原粮中的2,4_D含量与上转换纳米粒子免疫层析试 纸检测农药含量对比
[0135] 表9化学试剂一览表
[0137] 实验仪器
[0138] 配备德国Nacalai Tesque公司C0SM0SIL-C18色谱柱的岛津高效液相色谱仪、0.45 μπι过滤膜、20yL进样器、旋转蒸发仪以及粉碎机。
[0139] 2)样品前处理
[0140]①称取梨、苹果、黄瓜、西红柿及粉碎后过20目筛的大米及小米试样各20g，分别添 加2mg的2,4-D标准物质。
[0141] ②分别向以上六种样品中加入5mL 30%甲醇-PBS溶液，研磨。
[0142] ③将研磨后的产物离心，用30%甲醇-PBS溶液洗涤2-3次，每次用量5mL。
[0143] ④减压蒸馏浓缩提取液至2.0mL(lmg/mL)。将制备好的六种样品分别配成250ng/ mL的溶液。
[0144] ⑤过孔径为0·45μπι的过滤膜待测。
[0145] 4)实验条件
[0146] ①流动相：甲醇-磷酸水溶液=70 % : 30 % (ΡΗ=3.0);
[0147] ②保留时间：20min;
[0148] ③流速：lmL/min;
[0149] ④检测波长：278nm;
[0150] ⑤进样量:20yL。
[0151] 5)实验结果与分析
[0152] ①样品中实际添加2,4-D质量的计算：
[0154] 其中，Μ-一标准溶液中2，4-D峰面积的平均值;A2-一试样溶液中2，4_D峰面积的 平均值;mi--标样中2，4-D的质量(g);m2--试样的质量(g)。
[0155] 2,4_D标准样的2,4_D含量见图11;各个样品a:梨，b:苹果，c:黄瓜，d:西红柿，e:大 米，f:小米的2,4-D含量见图12-17以及表10。
[0156] 表10水果、蔬菜及原粮中的2,4_D测量结果
[0158] (6)实验结果与试纸条结果对比
[0159] 采用本发明制备的试纸条验证结果如图18所示(a:梨，b:苹果，c:黄瓜，d:西红柿， 6:大米，1；':小米)。
[0160] 由表10及图18可知，液相色谱检测时2,4-D加入量为5ng，试纸条可检测出样品呈 阴性，符合检测结果。
【主权项】
1. 检测农药残留试纸，其特征在于所述试纸包含:试纸板、样品滴加单元、检测单元以 及样品回收单元； 样品滴加单元、检测单元以及样品回收单元依次相连且均连接于所述试纸板上； 所述样品滴加单元与样品回收单元位于所述试纸板的两端，所述检测单元位于所述试 纸板的中间； 所述检测单元包含纳米粒子标记结合垫、检测线和质控线;所述检测线位于所述纳米 粒子标记结合垫和所述质控线之间;所述纳米粒子标记结合垫包含抗原包被液以及上转换 焚光纳米粒子标记抗体试样;所述上转换焚光纳米粒子标记抗体试样为0-NaYF4: Yb3+/Er3+ 标记2，4-D-IgG的PBS溶液。2. 根据权利要求1所述的检测农药残留试纸，其特征在于，所述检测线以及质控线均位 于层析膜上，纳米粒子标记结合垫与所述层析膜相连;所述层析膜为NC硝酸纤维素膜。3. 根据权利要求1所述的检测农药残留试纸，其特征在于，所述纳米粒子标记抗体试样 中 0-NaYF4: Yb3+/Er3+标记 2，4-D-IgG 的含量为0.00666-0.132yg。4. 根据权利要求1所述的检测农药残留试纸，其特征在于，所述检测线上的标记物为2， 4-D-0VA，所述质控线的标记物为羊抗兔二抗。5. 检测农药残留试纸的制备方法，其特征在于，包含下列步骤：51. 制备稀土上转换纳米材料；52. 制备农药多克隆抗体以及检测所述农药多克隆抗体的效价；53. 利用所述步骤S1制备的产物标记所述农药多克隆抗体；54. 利用所述步骤S3产物制备检测农药残留试纸。6. 根据权利要求5所述的检测农药残留试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包 含： S1.1将稀土氯化物、油酸以及十八烯置于烧瓶中搅拌抽真空30min，后停止搅拌加热； S1.2将NaOH、NH4HF2以及甲醇置于烧杯中放入搅拌子，封上封口膜，于磁力搅拌器上常 温搅拌； S1.3将所述步骤S1.1产物加热到150 °C，保温15~20miη即可，随即关闭搅拌，关闭加 热，使之降低至室温； S1.4尽量少进空气的情况下滴加 S1.2所述溶液，反应完全后通入Ν2，将滴加过程中将进 入的空气排尽； 31.5将体系加热至75-85°(：，保温1.511; S1.6在0.5h内将所述步骤S1.5的产物升温至310°C，Ν2保护下保温2h，随即在Ν2保护及 搅拌下冷却至室温； S1.7洗涤产物； S1.8利用所述步骤S1.7产物制备水溶性0-NaYF4:Yb，Er纳米粒子。7. 根据权利要求6所述的检测农药残留试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤S1.8包 含： SI. 8.1将所述步骤S1.7的产物、环己烷、叔丁醇、去离子水以及K2C〇3溶液室温下混合搅 拌； S1.8.2将KMn〇4和NaI〇4水溶液缓慢滴入所述步骤SI. 8.1的产物，40°C下反应48h，用 95%乙醇洗涤离心得初产物； S1.8.3初产物溶于HC1中，常温下搅拌反应，反应结束后离心洗涤离心得到产物。8. 根据权利要求5所述的检测农药残留试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤S3包 含： S3.1分别配置pH=5以及pH=7.4的磷酸缓冲盐溶液； S3 · 2 制备水溶性 0-NaYF4: Yb，Er 标记 2，4-D-IgG。9. 根据权利要求8所述的检测农药残留试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤S3.2 为： S3.2.1取经KMn〇4_NaI〇4氧化溶于水的FNaYF4: Yb，Er制成溶液A，向所述溶液A中加入 所述步骤S3.1制备的pH=5的PBS缓冲液后，加入EDC与Sulfo-NHS，常温搅拌； S3.2.2向所述步骤S3.2.1的产物中加入2，4-D-IgG，常温反应2h，离心出产物;将所述 产物用PBS洗2遍后定容于所述步骤S3.1制备的pH=7.4的PBS缓冲液中。
【文档编号】G01N21/64GK106018374SQ201610590578
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月26日
【发明人】华瑞年, 国婷婷, 张伟, 于基成, 那立艳
【申请人】大连民族大学