一种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸纯度的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸原料药纯度的方法，包括以下步骤：(1)测定牛磺熊去氧胆酸和内标物各定量目标峰的纵向弛豫时间T1；(2)根据所测定的T1值设置核磁共振波普仪的倾倒角和弛豫延迟时间(d1)，所述倾倒角为30～90°，弛豫延迟时间(d1)≥(7/3×T1max～5×T1max)；(3)设定核磁共振波谱仪的其他相关检测参数，根据如下公式(1)计算牛磺熊去氧胆酸纯度：W％＝(mIS×HIS×AS×MS×100％)/(MIS×AIS×HS×mS)。本发明具有操作简便，内标物廉价易得，结果准确且重复性好等优点。
【专利说明】
一种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸纯度的方法
技术领域
[0001] 本发明属于医药分析技术领域，具体涉及一种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去 氧胆酸纯度的检测方法。
【背景技术】
[0002] 牛磺熊去氧胆酸为熊胆汁中的主要有效成分，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石作 用，临床上主要用于治疗原发硬化性胆管炎、胆囊胆固醇结石、原发胆汁性肝硬化等肝胆疾 病。牛磺熊去氧胆酸最早由意大利Bruschettini S. R. L.大药厂研发，并于2007年获准在中 国销售。近年来，国内关于牛磺熊去氧胆酸的研究一直非常活跃。目前，主要以动物胆酸类 物质为起始原料进行化学合成，其中，市场上的主流产品为以鹅去氧胆酸为原料合成高纯 度熊去氧胆酸，进而制备高纯度牛磺熊去氧胆酸。除少量参与化学反应的原料及胆酸类副 产物影响牛磺熊去氧胆酸产品的纯度外，产品中往往含有一定量的溶剂残留，现有色谱方 法很难一次性准确测定牛磺熊去氧胆酸的真正纯度。因此开展牛磺熊去氧胆酸纯度测定方 法研究对确保医药企业研发生产过程中的产品质量具有重要意义。
[0003] 目前，对牛磺熊去氧胆酸(结构式如下式所示)纯度的检测通常使用高效液相色谱 仪、C18反相色谱柱，以紫外检测器波长为210nm，以甲醇-磷酸二氢钠溶液(0.3mol/L)(68: 32)(以磷酸调节PH值为4.4)为流动相进行测定。以上色谱法的主要不足是：（1)由于在 210nm的区域检测，仪器噪音高，选择性较差；（2)对于样品中的溶剂残留，如水、乙醇、乙腈 等，仍需结合气相色谱等方法扣除溶剂残留量；（3)峰形及出峰时间受水相中缓冲盐的比例 影响较大，进而影响纯度测定结果；（4)定量时需要高纯度的牛磺熊去氧胆酸标准品，但标 准品价格昂贵，长期使用成本高，而且在存放过程中标准品发生吸潮、污染或降解等均会严 重影响测定结果。而药品原料药纯度检测方法的研究是医药研发中一项重要内容，药品制 剂原料的纯度最终影响成药的用药安全和疗效。因此，有必要开发一种能对牛磺熊去氧胆 酸纯度进行廉价、简便、快速、准确测定的分析方法。
[0004] 氢核磁共振法因其具有的高灵敏度、高精确度、分析快速等优点已被广泛应用于 有机化合物的结构解析和定性分析中，然而使用氢核磁共振法对某种特定化合物进行纯度 测定定量分析时，由于影响其测量准确性的参数众多，而各化合物之间结构、性质上差异巨 大，且参数设置无明确规律可以依循，因此构建一套基于氢核磁共振法准确测定化合物纯 度的体系十分困难。目前，尚未有基于氢核磁共振法测定牛磺熊去氧胆酸纯度的报道。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术的不足，本发明提供基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸 纯度的方法，该方法具有操作简便，内标物廉价易得，结果准确且重复性好等优点。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸纯度的方法，包括以下步骤：
[0009] (1)测定牛磺熊去氧胆酸和内标物各定量目标峰的纵向弛豫时间T1;
[0010] (2)根据所测定的Ti值设置核磁共振波普仪的倾倒角和弛豫延迟时间(cU)，所述倾 倒角为30~90°，弛豫延迟时间（di)彡（7/3 XTimax~5 XTimax);
[0011] (3)设定核磁共振波谱仪的其他相关检测参数，测定牛磺熊去氧胆酸及内标物中 各定量目标峰的积分面积，根据如下公式(1)计算牛磺熊去氧胆酸纯度：
[0012] ff% = (misXHisXAsXMsX100%)/(MisXAisXHsXms) (1)
[0013] 其中，W%为牛磺熊去氧胆酸的纯度;mIS为内标物的实际质量（内标物的质量X纯 度），单位为mg;H IS为内标物定量目标峰的质子数;As为牛磺熊去氧胆酸定量目标峰的积分 值;Ms为牛磺熊去氧胆酸的摩尔质量，单位为g/mol ;Mis为内标物的摩尔质量，单位为g/mol; AIS为内标物定量目标峰的积分值;Hs为牛磺熊去氧胆酸定量目标峰的质子数;ms为牛磺熊 去氧胆酸样品的质量，单位为mg。
[0014] 优选的，所述倾倒角为30°、70°或90°，所述弛豫延迟时间（cb)为6~100s;
[0015] 优选的，所述核磁共振波谱仪的检测参数为:共振频率为400MHz，谱宽20ppm，测试 温度28°C，采样时间(AQ)为2.0~4. Is;采样累加次数为32~64次；
[0016] 优选的，氘代试剂为重水、氘代甲醇或氘代二甲基亚砜(DMS〇-d6);
[0017]进一步优选的，所述氘代试剂为氘代二甲基亚砜；
[0018]优选的，所述牛磺熊去氧胆酸的检测浓度为23.5-26.5mg/mL;
[0019] 优选的，所述牛磺熊去氧胆酸的定量目标峰化学位移为δΗ 0.61 (18位角甲基信 号)；
[0020] 优选的，所述内标物为其质子化学位移在δΗ 16.00~6.28或δΗ 6.28~3.30或δΗ 3.28~2.58或δΗ 〇. 60~0.00范围，且室温条件下不与牛磺熊去氧胆酸发生化学反应的任 意物质；
[0021] 进一步优选的，所述内标物为顺丁烯二酸；
[0022]优选的，所述测定牛磺熊去氧胆酸及内标物中各定量目标峰的积分面积的计算方 法为对每一信号6次积分取平均值。
[0023]氢核磁共振定量的基础是在合适的仪器参数下，定量目标信号的积分值与引起该 信号的质子数成正比关系，通过选择适当的内标物，根据定量目标峰的积分值推算该信号 所属化合物的摩尔浓度，进而计算各定量化合物的质量及纯度。在实际研究过程中，
【申请人】 发现脉冲倾倒角和弛豫延迟时间（di)直接影响最终定量结果的准确性。当采用90°脉冲时， cU多5XT lmax是确保含量测定数据准确性的必须条件，分析时间较长，氢核磁定量快速性的 优点得不到发挥；当采用较小脉冲倾倒角时，如30°脉冲，此时就能够获得 准确的分析结果，且分析时间大大缩短。因此，本申请首先通过测定定量目标信号的纵向弛 豫时间(T:)，进而确定脉冲倾倒角和弛豫延迟时间(cb )，并最终建立了基于氢核磁共振快速 测定牛磺熊去氧胆酸原料药纯度的方法。由于在测定过程中不需要特定研发药品的对照 品，因此，特别适合新药研发原料药的纯度测定。与现有技术相比，本发明有如下有益效果：
[0024] (1)本发明利用氢核磁共振技术检测牛磺熊去氧胆酸纯度，首先测定了可用于氢 核磁定量目标信号的^值，并在此基础上深入讨论了仪器脉冲倾倒角和弛豫延迟时间等参 数对含量测定结果的影响，同时选择廉价稳定效果好的内标物对牛磺熊去氧胆酸原料药进 行纯度测定，操作简便，结果准确且重复性好；
[0025] (2)本发明样品前处理简单，分析时间短，特别适合无紫外吸收的医药品种原料药 的纯度分析及质量控制，能够有效解决牛磺熊去氧胆酸以及类牛磺熊去氧胆酸的新药纯度 测定的技术问题，为此类药物纯度测定提供了新方法。
[0026]需要说明的是，核磁共振定量的原理是含氢有机化合物NMR波谱信号直接与原子 数目成正比，因此在实验参数设定时，需要被测物和内标物上的共振峰与其对应的原子数 尽可能保持一致，若选择不合适位置的氢进行纯度的测定，则受溶剂中杂质以及溶剂本身 等干扰峰的影响较大，被测组分和杂质信号之间存在干扰，被测组分和内标也会出现信号 重叠，导致积分不准确，检测结果重现性差。本发明中的待检测物质牛磺熊去氧胆酸分子量 高达500,结构式如【背景技术】中所示，实际上除了羰基、羟基、氨基等位置上比较活泼的氢不 易被测出外，牛磺熊去氧胆酸还有约二十个不同位置的氢，每一位移峰都会对应不同的倾 倒角和弛豫延迟时间等参数，所以选择哪个位置的氢进行纯度测定是目前限制利用氢核磁 共振测定牛磺熊去氧胆酸纯度的技术难题之一。
[0027] 而内标物的选择最基本的原则是室温条件下不与牛磺熊去氧胆酸发生化学反应 的物质，但是在内标物的物的选择时还要考虑被测物质的氢共振峰与内标的氢共振峰之间 要避免重叠以及内标物是否廉价易得等，目前可用于作为内标物的物质有苯、苯甲酸苄酯、 马来酸、过氧化苯甲酰、非那西汀、2,4_二硝基甲苯、三氟乙酸钠，DMS〇-d 6,邻苯二甲酸氢钾 等多种，每种内标物都有至少一种氢共振峰，待测物质牛磺熊去氧胆酸的选择哪个位置的 氢作为检测对象并不确定，所以选择何种内标物，何种氢共振峰都是没有任何依据的，这也 是目前限制利用氢核磁共振测定牛磺熊去氧胆酸纯度的技术难题之一。
[0028] 此外，需要说明的是，研究者通常对核磁共振检测过程中的测定温度和待测物检 测浓度并不关注，对于测定温度研究者基本都选定室温作为测定温度，但
【申请人】在基于氢 核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸纯度的研究中发现，适度提高温度能够有效促使H0D峰 向高场移动，而且有效提高谱图分辨率，
【申请人】发现在28°C时效果最佳，过高温度反而使谱 图分辨率下降，不利于检测结果的准确测定。同时，对待测物浓度选取学术界也是莫衷一 是，目前对核磁共振检测样品的浓度一般为20mg/mL左右，
【申请人】在实际检测中发现，针对 牛磺熊去氧胆酸而言，适当提高待测样品浓度，可以增大样品信号在采集到信号中所占百 分比，从而达到提高信噪比目的，经过分析牛磺熊去氧胆酸检测浓度为23.5-26.5mg/mL时 检测精度最尚。
[0029]
【申请人】有必要指出，脉冲倾倒角和弛豫延迟时间（cU)是建立氢核磁共振定量方法 过程中两个重要仪器参数，直接影响最终定量结果的准确性，目前虽然也有研究这些参数 与检测结果关系的文献报道，然而在实际测定纯度时研究人员往往直接将内标物与待测物 质溶解于溶剂中，进行仪器参数设定的测量，在进行参数的设定时则将脉冲倾倒角和弛豫 延迟时间等同于共振频率等常规参数一起进行设定，这使得使用测量时对参数设置存在盲 目性，往往需要进行多次试验才能确定较佳参数，费时费力。本申请发明人在研究过程中则 突破传统思维，首先测定牛磺熊去氧胆酸及内标物定量目标峰在氘代试剂中的纵向弛豫时 间(Tl)，再根据所测定的!^值设置核磁共振波谱仪的倾倒角和弛豫延迟时间( dl)，提高分析 样品的准确性和效率。
【附图说明】
[0030] 图1为实例1中核磁共振氢谱图；
[0031] 图2为实例2中核磁共振氢谱图；
[0032]图3为实例3中核磁共振氢谱图；
[0033]图4为实例4中核磁共振氢谱图；
[0034]图5为实例5中核磁共振氢谱图；
[0035]图6为实例6中核磁共振氢谱图；
[0036]图7为实例7中核磁共振氢谱图；
[0037]图8为实例8中核磁共振氢谱图；
[0038]图9为实例9中核磁共振氢谱图。
【具体实施方式】
[0039]称取牛磺熊去氧胆酸13.2111^、顺丁烯二酸0.65411^，分别置于核磁管中，加入 0.5mL DMS〇-d6溶解，用于咕NMR测试。采用质子反转-恢复1^实验方法测定各定量目标峰的 纵向弛豫时间Τι，并用Bruker的Τι计算程序计算。设定脉冲弛豫延迟时间范围为1秒至30秒。 经测定以DMS〇-d 6为溶剂时，顺丁烯二酸δΗ 6.28信号峰1^为2.5s，牛磺熊去氧胆酸δΗ 〇. 61 处信号Τι为398ms。
[0040] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明，应该说明的是，下述说明仅是为 了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0041] 实施例1-9所用牛磺熊去氧胆酸样品实际纯度为96.0%。
[0042] 实施例1
[0043] 精密称取牛磺熊去氧胆酸样品14.112mg、顺丁烯二酸2.037mg，分别以600μL、250μ L DMS〇-d6溶解，后精密取440yL牛磺熊去氧胆酸溶液、60yL顺丁烯二酸溶液转移到核磁管 中，进行咕NMR测试。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，cU为100s，采样累加次数 为64次，谱宽20ppm，测试温度为28°C，AQ为4. Is。
[0044] 在1Η匪R谱中，内标物顺丁烯二酸δΗ 6.28信号峰积分值为1，牛磺熊去氧胆酸δΗ 0.61处信号积分值为7.08,根据公式-1可计算得到牛磺熊去氧胆酸的纯度为95.0%，重复5 次，相对标准偏差0.2%。
[0045] ff% = (misXHisXAsXMsX100%)/(MisXAisXHsXms)(公式 _1)
[0046] W%-牛磺熊去氧胆酸的纯度
[0047] mis-内标物的实际质量（内标物的质量X纯度），0.484mg
[0048] HIS -内标物定量目标峰的质子数，为2 [0049] As-牛磺熊去氧胆酸定量目标峰的积分值，为7.08 [0050] Ms-牛磺熊去氧胆酸的摩尔质量，499.70g/mol
[0051 ] Mis一内标物的摩尔质量，116.07g/mol
[0052] AIS -内标物定量目标峰的积分值，为1 [0053] Hs-牛磺熊去氧胆酸定量目标峰的质子数，为3 [0054] ms-牛磺熊去氧胆酸样品的质量，10.349mg
[0055] 实施例2
[0056]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，ch为 8〇8，采样累加次数为32次，谱宽20??111，测试温度为28°(：4〇为4.18。
[0057]在1Η匪R谱中，内标物顺丁烯二酸δΗ 6.28信号峰积分值为1，牛磺熊去氧胆酸δΗ 0.61处信号积分值为7.14,根据公式-1可计算得到牛磺熊去氧胆酸的纯度为95.8%，重复5 次，相对标准偏差0.1%。
[0058] 实施例3
[0059]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，70°脉冲，ch为 5〇8，采样累加次数为64次，谱宽20??111，测试温度为28°(：4〇为4.18。
[0060]在1Η匪R谱中，内标物顺丁烯二酸δΗ 6.28信号峰积分值为1，牛磺熊去氧胆酸δΗ 0.61处信号积分值为7.14,根据公式-1可计算得到牛磺熊去氧胆酸的纯度为95.8%，重复5 次，相对标准偏差0.3%。
[0061 ] 实施例4
[0062] 4 NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，cb为6s， 采样累加次数为64次，谱宽20ppm，测试温度为28°C，AQ为4. Is。
[0063]在1Η匪R谱中，内标物顺丁烯二酸δΗ 6.28信号峰积分值为1，牛磺熊去氧胆酸δΗ 0.61处信号积分值为7.13,根据公式-1可计算得到牛磺熊去氧胆酸的纯度为95.7%，重复5 次，相对标准偏差0.1%。
[0064] 实施例5
[0065]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，ch为 258，采样累加次数为32次，谱宽20??111，测试温度为28°(：40为4.18。
[0066]在1Η匪R谱中，内标物顺丁烯二酸δΗ 6.28信号峰积分值为1，牛磺熊去氧胆酸δΗ 0.61处信号积分值为7.12,根据公式-1可计算得到牛磺熊去氧胆酸的纯度为95.6%，重复5 次，相对标准偏差0.2%。
[0067] 实施例6
[0068]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，ch为 158，采样累加次数为32次，谱宽20??111，测试温度为28°(：4〇为3.〇8。
[0069]在1Η匪R谱中，内标物顺丁烯二酸δΗ 6.28信号峰积分值为1，牛磺熊去氧胆酸δΗ 0.61处信号积分值为7.26,根据公式-1可计算得到牛磺熊去氧胆酸的纯度为97.5%，重复5 次，相对标准偏差0.1%。
[0070] 实施例7
[0071]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，ch为 138，采样累加次数为32次，谱宽20??111，测试温度为28°(：40为4.18。。
[0072]在1Η匪R谱中，内标物顺丁烯二酸δΗ 6.28信号峰积分值为1，牛磺熊去氧胆酸δΗ 0.61处信号积分值为7.15,根据公式-1可计算得到牛磺熊去氧胆酸的纯度为96.0%，重复5 次，相对标准偏差o.l%。
[0073] 实施例8
[0074]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，ch为 158，采样累加次数为64次，谱宽20??111，测试温度为28°(：4〇为2.〇8。
[0075]在1Η匪R谱中，内标物顺丁烯二酸δΗ 6.28信号峰积分值为1，牛磺熊去氧胆酸δΗ 〇.61处信号积分值为7.24，根据公式-1可计算得到牛磺熊去氧胆酸的纯度为97.2%，重复5 次，相对标准偏差0.2%。
[0076] 实施例9
[0077]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，ch为 138，采样累加次数为32次，谱宽20??111，测试温度为28°(：40为4.18。
[0078]在1Η匪R谱中，内标物顺丁烯二酸δΗ 6.28信号峰积分值为1，牛磺熊去氧胆酸δΗ 2.06处信号积分值为6.95，根据公式-1可计算得到牛磺熊去氧胆酸的纯度为93.3%，重复5 次，相对标准偏差0.1%。
[0079]上述虽然结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护 范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员 不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸原料药纯度的方法，其特征在于，包 括以下步骤： (1) 测定牛磺熊去氧胆酸和内标物各定量目标峰的纵向弛豫时间Ti; (2) 根据所测定的Ti值设置核磁共振波普仪的倾倒角和弛豫延迟时间(cU)，所述倾倒角 为30~90°，所述弛豫延迟时间（di)多（7/3 X Timax~5 X Timax)。2. 如权利要求1所述的一种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸原料药纯度的方 法，其特征在于，所述倾倒角为30°、70°或90°，所述弛豫延迟时间（cU)为6~100s。3. 如权利要求1所述的一种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸原料药纯度的方 法，其特征在于，核磁共振波谱仪的检测参数为:共振频率为400MHz，谱宽20ppm，测试温度 28°C，采样时间(AQ)为2.0~4. Is;采样累加次数为32~64次。4. 如权利要求1所述的一种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸原料药纯度的方 法，其特征在于，氘代试剂为重水、氘代甲醇或氘代二甲基亚砜。5. 如权利要求4所述的一种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸原料药纯度的方 法，其特征在于，所述氘代试剂为氘代二甲基亚砜。6. 如权利要求1所述的一种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸原料药纯度的方 法，其特征在于，所述牛磺熊去氧胆酸的检测浓度为23.5-26.5mg/mL。7. 如权利要求1所述的一种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸原料药纯度的方 法，其特征在于，所述牛磺熊去氧胆酸的定量目标峰化学位移为知0.61。8. 如权利要求1所述的一种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸原料药纯度的方 法，其特征在于，所述内标物为其质子化学位移在5 1116.00~6.28七6.28~3.30^3.28 ~2.58或δΗ 〇. 60~0.00范围内，且室温条件下不与牛磺熊去氧胆酸发生化学反应的任意 物质。9. 如权利要求1或8所述的一种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸原料药纯度 的方法，其特征在于，所述内标物为顺丁烯二酸。10. 如权利要求1所述的一种基于氢核磁共振快速测定牛磺熊去氧胆酸原料药纯度的 方法，其特征在于，测定牛磺熊去氧胆酸及内标物中各定量目标峰的积分面积的计算方法 为对每一信号6次积分取平均值。
【文档编号】G01N24/08GK106018455SQ201610322785
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】王志伟, 魏祥玉, 李锋, 林云良, 赵汝松, 闫慧娇, 陈跃, 高红梅
【申请人】山东省分析测试中心