一种单细胞凝胶电泳检测细胞dna损伤的试剂盒及方法
【专利摘要】本发明提供一种单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的试剂盒及方法，该方法包括铺胶、裂解、解旋、电泳、中和洗涤、干燥、染色，再采用荧光显微镜观察染色结果并拍摄照片，分析评价细胞DNA的损伤程度。传统的单细胞凝胶电泳技术在样品制备时需在载玻片上铺制三层凝胶，具有操作复杂、容易脱胶、样品图像不清晰等缺点，而本发明只需在载玻片上铺制一层胶，具有样品制备工艺简单、脱胶率低、易于操作和实验成本低等优点。
【专利说明】
一种单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的试剂盒及方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的 试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 随着中国经济的加速发展，环境污染也日趋严重。目前，全球范围内的环境污染对 人体健康也受到越来越多的关注。其中，环境污染物造成DNA的损伤会影响细胞的遗传稳定 性，并可能对后代产生影响，引起孕妇流产、死胎、畸胎和某些遗传性疾病等。由于细胞的 DNA损伤会造成疾病，威胁人类健康，因此对细胞DNA损伤进行检测，并了解这一损伤能否引 起细胞事件的变化就显得十分重要。
[0003] 1976年，⑶0K等人发明了 一种研究细胞DNA损伤的方法，即单细胞凝胶电泳技术 (Cook P.R，Brazell I.A，Jost E.Journal of Cell Science，1976,22(2):303_324.)〇 1978年，Rydberg和Johanson在上述实验的基础上第一次报道直接在单个细胞的水平上对 损伤进行定量检测（Rydberg B，Johanson K J.DNA Repair Mechanisms, 1978(03):465-468 .)。在上述方法的基础上，0s t ling和Johanson于1984年建立了微凝胶电泳技术 (Ostling 0,Johanson K J.Biochemical and Biophysical Research Communications, 1984，123 (1): 291-298.)，该技术在解旋后增加了电泳步骤，使断片从细胞核向阳极移动， 以形成类似于彗星的尾巴，但是中性条件下的裂解和电泳只能检测细胞中的双链DNA断片， 不能测定单链断裂。因此1988年Singh建立了碱性彗星实验(pH>13.0)，该实验能够检测单、 双链的断裂和碱性不稳定点（某些损伤因子能够导致脱嘌呤或者脱嘧啶位点的产生，形成 碱性不稳定点，其在强碱条件下能够转换成DNA链的断裂），从而使检测的灵敏度得到极大 改善（Singh N P，McCoy M T，Tice R R，et al .Experimental Cell Research, 1988,175 (1): 184-191.)。自从碱性彗星实验问世以来，各相关实验室已将该技术广泛应用于检测细 胞DNA的损伤，与此同时，也在不断的对该方法进行改良，使之能够检测细胞内不同的DNA损 伤，例如单双链的断裂、碱基的氧化损伤、DNA-DNA/DNA-蛋白质-药物交联以及修复等，但 是，该方法也存在一系列弊端，例如操作复杂、容易脱胶、样品图像不清晰等，从而影响图像 的结果分析。
【发明内容】
[0004] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种单细胞凝胶电泳检测 细胞DNA损伤的试剂盒及方法，用于解决现有技术中操作复杂、细胞容易脱胶、样品图像不 清晰等问题。
[0005] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种单细胞凝胶电泳检测 细胞DNA损伤的试剂盒，包括如下试剂:低熔点琼脂糖凝胶、细胞裂解液、碱性电泳缓冲液、 染色液。低熔点琼脂糖是指胶凝温度为26 °C_30°C (1 · 5 % gel)、熔化温度<65 °C (1 · 5 % gel) 的琼脂糖。
[0006] 进一步地，低熔点琼脂糖凝胶是指低熔点琼脂糖与无钙、镁的PBS的混合液，低熔 点琼脂糖凝胶中低熔点琼脂糖的质量浓度为〇 . 75 % ;细胞裂解液包括2.5mmol/L NaCl、 100mmol/L Na2-EDTA、100mmol/L Tris，pH为10,临用前加Triton X-100至体积分数为1%， 同时加DMS0至体积分数为10% ;碱性电泳缓冲液包括200mmol/L NaOH、lmmol/L EDTA;染色 液为核酸凝胶电泳染料Gelgreen或Genelight。
[0007] 本发明第二方面提供一种单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的方法，包括如下步 骤：
[0008] 1)铺胶:在载玻片上铺设盖玻片，且形成以载玻片为底面、盖玻片为侧壁的小槽， 即微电泳槽;将DNA样品悬液与低熔点琼脂糖凝胶混匀得细胞混合液，采用所述细胞混合液 在电泳槽中铺胶，盖玻片与载玻片之间存在间隙，微电泳槽上的细胞混合液在凝固前渗入 两侧的缝隙中，盖玻片与载玻片之间存在间隙，微电泳槽上的细胞混合液在凝固前渗入两 侧的间隙中；盖玻片厚度较小，便于裁取，粘在载玻片上的玻片可以为完整的盖玻片，也可 以是裁切至一定尺寸的窄片。微电泳槽上凝胶的两侧被固定，有效解决了容易脱胶的问题。
[0009] 2)裂解:将铺胶后的载玻片浸入细胞裂解液中裂解。
[0010] 3)解旋、电泳、中和洗涤:将裂解后的载玻片浸入碱性电泳缓冲液中解旋，解旋完 毕后电泳，电泳结束后，中和洗涤载玻片；其中的载玻片优选为光滑载玻片，便于图像的采 集和分析，提高彗星实验检测的灵敏度。
[0011] 4)干燥:将中和洗涤之后的载玻片干燥。
[0012 ] 5)染色:琼脂圈染色、干燥后，分析评价细胞DNA的损伤程度。
[0013] 进一步地，步骤1)中，细胞DNA损伤样品悬液是指悬浮有细胞DNA损伤样品且无钙、 镁的PBS，低熔点琼脂糖凝胶是指低熔点琼脂糖与无钙、镁的PBS的混合液，低熔点琼脂糖凝 胶中低熔点琼脂糖的质量浓度为〇 . 75%，细胞DNA损伤样品悬液与低熔点琼脂糖凝胶的体 积比为1:10。
[0014] 更进一步地，细胞DNA损伤样品悬液中细胞密度为1 X 105cells/ml。
[0015] 进一步地，悬浮有细胞DNA损伤样品的PBS的温度为37°C，防止细胞热休克。
[0016] 优选地，步骤1)中，微电泳槽的制作方法如下:将盖玻片划成窄条，将窄条无缝粘 结在载玻片的中部，再将新盖玻片粘在载玻片的两端，盖玻片与窄条之间留有间距，形成微 电泳槽。当然，也可以不使用窄条，将载玻片裁短，在载玻片的两端粘接盖玻片，两个盖玻片 之间留有间距，形成微电泳槽，盖玻片与载玻片之间留有缝隙，便于低熔点琼脂糖凝胶渗入 其中，对微电泳槽中的样品起到固定作用。
[0017] 优选地，所述窄条为长方形窄条。
[0018] 优选地，微电泳槽的宽度为10mm。
[0019] 优选地，步骤1)中，粘接时采用的胶水为UF0强力胶水、AB胶或中性玻璃胶。
[0020] 进一步地，步骤5)中，琼脂圈染色时，选取的染色液为核酸凝胶电泳染料Gelgreen 或Genelight。
[0021] 进一步地，步骤1)中，将细胞混合液平铺于微电泳槽中，细胞混合液在凝固前渗入 两端的盖玻片中，4°C避光凝固25-30min。
[0022] 进一步地，步骤2)中，所述裂解为避光裂解，细胞裂解液包括2.5mmol/L NaCl、 100mmol/L Na2-EDTA、100mmol/L Tris，pH为10;临用前加Triton X-100至体积分数为1%， 同时加DMSO至体积分数为10% ;细胞裂解条件为:温度4°C，时间1-2h。
[0023] 进一步地，步骤3)中，将裂解后的细胞用蒸馏水清洗，再将其置于碱性电泳缓冲液 中避光解旋，解旋时采用的碱性电泳缓冲液中包括200mmol/L NaOH、lmmol/L EDTA，细胞解 旋条件为:温度4°C，时间20-40min。
[0024] 进一步地，步骤3)中，解旋后，将载玻片放在电泳槽中，加入新的预冷碱性电泳缓 冲液进行电泳，电泳条件为:温度4°C，电压21V，时间20-30min;新的碱性电泳缓冲液包括 200mmol/L NaOH、lmmol/L EDTA，即电泳时所采用的缓冲液与解旋时所采用的缓冲液相同。 中和洗涤时采用Tri s-HCl缓冲液;步骤4)中，载玻片的干燥温度为37-45 °C，干燥时间为10-15min〇
[0025] 如上所述，本发明的一种单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的试剂盒及方法，具有 以下有益效果:⑴实施过程简单易控;⑵该方法有效降低脱胶率，样品图像更加清晰；⑶本 发明有效降低实验风险，染色液用安全的核酸电泳染料Gelgreen或Genelight代替溴化乙 锭染料，染色效果更好，也减少了对实验者的身体危害。
[0026]传统的单细胞凝胶电泳技术在样品制备时需在载玻片上铺制三层凝胶，具有操作 复杂、容易脱胶、样品图像不清晰等缺点，而本发明采用自制的载玻片，只需在载玻片上铺 制一层胶，具有样品制备工艺简单、脱胶率低、易于操作、实验成本低、图像清晰等优点。
【附图说明】
[0027]图1显示为细胞包埋时所用的自制载玻片。
[0028]图2显示为对照组的彗星图像照片。
[0029]图3显不为5mg/L氧化石墨稀暴露293T细胞24h后的彗星图像照片。
[0030]图4显不为25mg/L氧化石墨稀暴露293T细胞24h后的彗星图像照片。
[0031]图5显示为50mg/L氧化石墨烯暴露293T细胞24h后的彗星图像照片。
[0032]图6显不为100mg/L氧化石墨稀暴露293T细胞24h后的彗星图像照片。
【具体实施方式】
[0033] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0034] 选用人胚肾细胞进行培养，在37°C、5%⑶2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养， 待细胞长至对数期时，将细胞接种于六孔板中，加入3mL培养液(培养液的配制:根据所需培 养液的体积分别加入Gibco-1640培养基、胎牛血清和青霉素一链霉素溶液（100X)，使各组 成成分的体积分数达到49%、10%和1 % )。
[0035]暴露液的配制：称取0.005g氧化石墨烯置于棕色瓶中，加入lml蒸馏水，摇匀后超 声30min，使氧化石墨稀均勾分散于水中。再分别移取60μ1、30μ1的母液至4mlEP管中，加入 相应的培养液，配制成3ml浓度为100mg/l、50mg/l的暴露液，再将50mg/l的暴露液稀释成 25mg/l和5mg/l的暴露液。
[0036]待细胞长至70 %左右的汇合度后，将细胞培养液弃去，加入相应浓度的暴露液，暴 露 24h。
[0037]细胞暴露后，将暴露液弃去，用1 X PBS清洗细胞两到三次，再用预冷的1 X PBS将细 胞吹打下来，将细胞重悬至1 X l〇5cells/ml，整个过程要避光。
[0038]载玻片的制作：用玻璃刀将盖玻片划成两个20mmX 10mm的长方形窄条，然后将窄 条用UF0胶水粘到干净的光滑载玻片的中部，再用UF0胶水将完整的盖玻片粘到载玻片两 端，使盖玻片与窄条之间留有一部分空间，即微电泳槽(本实施例中，电泳槽的宽度为1〇_， 电泳槽的长度与载玻片的宽度一致）。中部的长方形盖玻片窄条与载玻片之间完全紧贴，即 无缝粘接，起到隔离作用，形成两个微电泳槽，得到两组样品，两端的盖玻片与载玻片之间 均存在一定的缝隙，使得细胞混合液在凝固前可以渗入其中，制得的载玻片如图1所示。当 然，粘接盖玻片时也可以采用AB胶、中性玻璃胶等其他胶水，但是，AB胶使用时要进行调配， 操作不方便；中性玻璃胶粘接之后，盖玻片难以取下，不便于在拍照结束之后对载玻片和盖 玻片的内侧进行彻底清洗，因此，本实施例优选采用UF0强力胶水（型号:Art. N0.01003)， UFO强力胶水在空气中快速凝固，在粘接盖玻片时操作方便，在实验结束后，用酒精浸泡载 玻片3-5min左右，再用清水冲洗，即可将盖玻片从载玻片上取下，操作简单。盖玻片的厚度 较薄，通常在0.13-0.20mm，便于裁取。电泳槽两侧的玻片起到固定琼脂糖的作用，有效防止 脱胶，电泳槽的形状不限于图1所示的长方形，其他任何能够达到上述目的的电泳槽形状也 在本发明的保护范围之内。
[0039] 细胞裂解液的配制:细胞裂解液可先配好贮备液，使用前配好应用液。细胞裂解液 贮备液的配制：贮备液包括2.5mM NaCl、100mM Na2_EDTA、100mM Tris，用NaOH调节pH到10， 高温灭菌，室温保存。细胞裂解液应用液的配制：临用前向贮备液中加入Triton X -100至 体积分数为1%，同时加入DMS0(二甲基亚砜)至体积分数为10%，置于4°C冰箱保存。
[0040] 碱性电泳缓冲液的配制：1L的体系为8gNa0H+2mlEDTA(500mM、pH = 8)，在NaOH溶解 后加dH20至1L，溶液现配现用，冷却至4 °C。
[0041 ]低熔点琼脂糖凝胶的准备:配制质量浓度为0.75%的低熔点琼脂糖溶液，具体地， 称取所需的低熔点琼脂粉，放入EP管中，加入1 X PBS，边加边搅拌，使琼脂糖完全分散在PBS 溶液中，将其用沸水浴加热7min左右，边加热边震荡，待琼脂糖完全溶解，再将其放入水浴 锅中使其温度降为37°C，防止细胞热休克，制得质量浓度为0.75%的低熔点琼脂糖凝胶。 [0042]铺胶:将悬浮于1 XPBS(无Ca2+，Mg2+)的细胞与低熔点琼脂糖凝胶以1:10的体积比 混匀，制得细胞混合液，取1〇〇μ1细胞混合液平铺于微电泳槽中，使得细胞混合液在凝固前 渗入两端的盖玻片中，4°C避光凝固30min，待其凝固后用纱布将载玻片包住，防止脱胶。 [0043] 裂解:将包埋好的细胞的载玻片完全浸入细胞裂解液中，4°C避光裂解90min。
[0044]解旋:将裂解后细胞用预冷的蒸馏水清洗两到三次，再将其置于预冷的碱性电泳 缓冲液中4 °C解旋20-30min。
[0045]电泳:将载玻片平放在电泳槽中，加入新配制的浓度为200mmol/L NaOH、lmmol/L m)TA的碱性电泳缓冲液，4°C 21V电泳30min。
[0046] 中和：用Tris-HCl中和缓冲液清洗玻片三次，每次SmiruTris-HCl中和缓冲液为 0 · 4mol/L Tris-HCl，用HC1 调节pH至7 · 5，4°C保存。
[0047] 干燥:将玻片浸入dH20中两次，每次5min，然后浸入4°C预冷的70 % (体积分数）乙 醇溶液中5min。在37-45 °C下烘烤10-15min，将玻片烤干。该方法可使细胞单个分布，便于观 察。烤干后的样品在观察前可室温干燥保存。
[0048] 染色：取100此Genelight核酸电泳染色液涂在圆形的干燥琼脂圈上，避光放置4 °(：冰箱染色20min，再用吸头轻轻去除多余的染色液，室温避光放置至玻片完全干燥。
[0049] 拍照:用荧光显微镜观察染色结果并拍摄照片，如图2-图6所示。
[0050] 数据分析:用CASP软件进行图像分析，获得彗星的各个相关参数，主要参数有尾部 DNA(DNAT，tail DNA)、01ive尾矩（0TM，01ive tail moment)、尾长（TL，Tail Length)、尾矩 (TM，Tai 1 moment)，通过对这些参数的统计分析，得到在不同浓度下，293T细胞的DNA损伤 程度。如表1所示为不同浓度氧化石墨烯对293T细胞尾部DNA含量、DNA迀移长度、尾矩和 Olive尾矩的影响d土 s)，数据表明，293T细胞的DNA损伤与氧化石墨烯的暴露浓度之间呈 现出良好的剂量-效应关系。
[0051] 表 1
[0053] ***Ρ〈〇.〇〇1
[0054] 综上所述，本发明采用自制的载玻片，只需在载玻片上铺制一层胶，对铺胶、裂解、 解旋、电泳等步骤加以优化，使得单细胞凝胶电泳技术操作简单、图像清晰，采用安全的核 酸电泳染料Gelgreen或Genelight代替溴化乙锭染料，染色效果更好，也减少了对实验者的 身体危害。
[0055] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的试剂盒，其特征在于，包括如下试剂:低熔 点琼脂糖凝胶、细胞裂解液、碱性电泳缓冲液、染色液。2. -种单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 铺胶:在载玻片上铺设盖玻片，且形成以载玻片为底面、盖玻片为侧壁的小槽，即微 电泳槽;将DNA样品悬液与低熔点琼脂糖凝胶混匀得细胞混合液，采用所述细胞混合液在电 泳槽中铺胶，盖玻片与载玻片之间存在间隙，微电泳槽上的细胞混合液在凝固前渗入两侧 的间隙中； 2) 裂解:将铺胶后的载玻片浸入细胞裂解液中裂解； 3) 解旋、电泳、中和洗涤:将裂解后的载玻片浸入碱性电泳缓冲液中解旋，解旋完毕后 电泳，电泳结束后，中和洗涤载玻片； 4) 干燥:将中和洗涤之后的载玻片干燥； 5) 染色:琼脂圈染色、干燥后，分析评价细胞DNA的损伤程度。3. 根据权利要求2所述的单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的方法，其特征在于:步骤 1)中，细胞DNA损伤样品悬液是指悬浮有细胞DNA损伤样品且无钙、镁的PBS，低熔点琼脂糖 凝胶是指低熔点琼脂糖与无钙、镁的PBS的混合液，低熔点琼脂糖凝胶中低熔点琼脂糖的质 量浓度为〇.75%，细胞DNA损伤样品悬液与低熔点琼脂糖凝胶的体积比为1:10。4. 根据权利要求2所述的单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的方法，其特征在于:步骤 1)中，微电泳槽的制作方法如下:将盖玻片划成窄条，将窄条无缝粘结在载玻片的中部，再 将新盖玻片粘在载玻片的两端，盖玻片与窄条之间留有间距，形成微电泳槽。5. 根据权利要求4所述的单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的方法，其特征在于:步骤 1)中，粘接时采用的胶水为UFO强力胶水、AB胶或中性玻璃胶。6. 根据权利要求2所述的单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的方法，其特征在于:步骤 5)中，琼脂圈染色时，选取的染色液为核酸凝胶电泳染料Gelgreen或Genelight。7. 根据权利要求2所述的单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的方法，其特征在于:步骤 1) 中，将细胞混合液平铺于微电泳槽中，细胞混合液在凝固前渗入两端的盖玻片中，4°C避 光凝固25-30min。8. 根据权利要求2所述的单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的方法，其特征在于:步骤 2) 中，所述裂解为避光裂解，细胞裂解液包括2.5mmol/L NaCl、100mmol/L Na2-EDTA、 100mmol/L Tris，pH为10;临用前加 Triton X-100至体积分数为1%，同时加 DMSO至体积分 数为10 % ;细胞裂解条件为:温度4 °C，时间1 _2h。9. 根据权利要求2所述的单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的方法，其特征在于:步骤 3) 中，将裂解后的细胞用蒸馏水清洗，再将其置于碱性电泳缓冲液中避光解旋，解旋时采用 的碱性电泳缓冲液中包括200mmol/L NaOH、lmmol/L EDTA，细胞解旋条件为:温度4°C，时间 20-40min〇10. 根据权利要求2所述的单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤的方法，其特征在于:步骤 3)中，解旋后，将载玻片放在电泳槽中，加入新的预冷碱性电泳缓冲液进行电泳，电泳条件 为:温度4°C，电压21V，时间20-30min;中和洗涤时采用Tris-HCl缓冲液;步骤4)中，载玻片 的干燥温度为37-45°C，干燥时间为10_15min。
【文档编号】G01N27/447GK106018529SQ201610531656
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月7日
【发明人】裴得胜, 杨丽, 马彦博
【申请人】中国科学院重庆绿色智能技术研究院