一种用于白血病和自身免疫病检测用试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于白血病和自身免疫病检测用试剂盒，其包含CD52突变的抗体，本发明将CD52的抗体通过模拟优化寻找到了最优的对抗体结合起到最大功能的位点，通过特定位点的点突变获得了一系列的突变抗体，所述的抗体相对于原始的抗体，具有更好的结合特性以及结合的准确性，具有不可以预料的效果。同时将突变后的抗体去制备用于检测白细胞个数的试剂盒，具有更好的应用前景。
【专利说明】
一种用于白血病和自身免疫病检测用试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及医学领域。具体涉及一种用于白血病和自身免疫病检测用试剂盒。
【背景技术】
[0002] ⑶52又称CAMPATH-1抗原，该抗原表达于正常及恶性的B和T淋巴细胞、NK细胞、单 核细胞、巨噬细胞表面及男性的生殖系统组织，是一种存在于B淋巴细胞和T淋巴细胞表面 的抗原。针对CD52抗原的单克隆抗体在体内可以暂时清除血液内的淋巴细胞，使免疫系统 处于失效状态，使器官移植入患者体内，不会遭到患者免疫系统的排斥，抗CD52单克隆抗体 在体内还能够导致抗体依赖性溶解细胞或杀细胞作用，从而清除血液、骨髓和其他受影响 细胞中的恶性淋巴细胞。抗⑶52单克隆抗体(CAMPATH-1系列）已经被广泛地用于临床治疗， 此抗体为人源化抗⑶52抗体，于2001年5月7日获得美国FDA批准上市，适应症为〃烷化剂及 氟达拉宾治疗无效的慢性B淋巴细胞性白血病〃。另外，抗CD52单克隆抗体在体内还能够导 致抗体依赖性地溶胞或杀细胞作用，从而清除血液、骨髓和其他受影响器官中的恶性淋巴 细胞。
[0003] 目前，虽然国内外已经获得了多种抗⑶52抗原的单克隆抗体，但这些单克隆抗体 的特异性等特性不够理想。因此，本领域还需要研制对人免疫原性更小，表达量更高，以及 具有其他优良特性的抗CD52单克隆抗体，从而开发出对于慢性淋巴细胞白血病具有显著疗 效的药物。
[0004] CN1225480 C中公开了抗人CD52抗体，但是其结合能力还是不高。和大多数蛋白分 子一样，抗CD52单抗具有不稳定性，会经历多种化学和物理降解。和传统合成的小分子药物 相比，生物分子具有复杂的结构如一级、二级、三级等高级结构。而蛋白质的结构特别是高 级结构非常脆弱，容易发生结构变化，如变性、聚集、和沉淀。保持抗体的高级结构是发挥它 们生物学活性的最基本要求。这些降解的产物会对生物制药的安全性产生很大的影响。特 别是一些蛋白聚集物会激发人体的免疫反应，轻者会降低生物药物的疗效，重者甚至会造 成病人的死亡。抗体药物不仅仅需要在生产的时候能得到高纯度的产品，还要在运输、储存 和使用过程中保持结构稳定。CN 101619305 A中同样公开了抗人⑶52抗体编码序列及其应 用，但是该抗体仍然存在一定的缺陷，效价仍然存在一定的提高空间。
[0005] CD52高表达在很多白血病恶性细胞表面。有文献表明，在病人体内，恶性细胞表面 的CD52密度远远大于体内的正常细胞，CD52抗原具有的高度糖基化带来的细胞表面负电荷 的增加被认为与细胞的恶性程度城正相关性。还有观察报道恶性细胞表面CD52抗原分子可 能脱落于血液中，检测病人血清中的可溶性CD52分子可以作为诊断白血病的一个标志。因 此，通过抗体检测CD52的表达量可以用来鉴定白血病和相应的自身免疫性疾病。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供针对人CD52具有更高结合特性的的突变的工 程抗体，同时提供该单域抗体在制备检测的应用。
[0007] 本发明提供一种抗体突变的方法，包括结合抗体结构数据分析，针对抗体功能区 结构的残基进行计算机结构模拟，通过改变结构域的残基是否突变以及突变的方向，将以 往需要多轮突变筛选或是通过噬菌体库筛选突变的方式大大简化，将所有突变选择集中在 一起进行结构分析及其可行性，直接一步获得最终的突变方案。因此相比以往方法，本方法 更加简捷明确。
[0008] 本发明提供一种原始的工程抗体，该抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0: 1所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0009] 本发明针对所述的工程抗体，发现其重链可变区氨基酸序列中的第1 lLeu、14Pro、 361'印、40361'、81\^1、8461]1、86厶811，轻链可变区氨基酸序列中的141'111'、16617、351^8、 39Asn、41Leu、84Glu、87Asp、89Gly是抗体中提高抗体性能的决定性位点。
[0010] 本发明另外提供一种改造后的抗体，所述抗体的在重链可变区氨基酸序列中的第 111^11、14?1'〇、361'印、40361'、81\^1、846111、86厶811，轻链可变区氨基酸序列中的141'111·、 16Gly、351^8、39厶811、411^11、846111、87厶8卩、89617进行了任一的突变。
[0011] 通过一系列的验证，所述的位点对于突变后的氨基酸也是有比较苛刻的要求，并 非在相应的位点突变为任何的氨基酸均可以提高抗体性能，有些甚至导致抗体的功能减 弱。具体的最优的突变氨基酸序列分别为：
[0012] 重链可变区氨基酸序列中的突变方式为LeullPr〇(表示第11位的Leu突变）、 Prol4Ser、Trp36Met、Ser40Val、Val81Cys、Gln84Trp、Asn86Gl}^：i--个；轻链可变区氨基 酸序列突变方式为Thrl4Val、Glyl6Ser、Lys35Gly、Asn39Met、Leu41Ser、Glu84Tyr、 Asp87Ser、Gly89Pro 任--个。
[0013] 本发明另外提供一种具体的突变组合为:重链可变区的LeullPro和轻链可变区的 Glu84Tyr、重链可变区的Pro 14Ser和轻链可变区的Gly89Pro、重链可变区的Trp36Met和轻 链可变区的Lys35Gly、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Glyl6Ser、重链可变区的 Gln84Trp和轻链可变区的Glu84Tyr、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Gly89Pro、重 链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Thrl4Val、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的 Lys35Gly、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Leu41Ser、重链可变区的Asn86Gly和轻 链可变区的Gly89Pro。
[0014] 本发明另外一方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述 的人CD52的突变的单克隆抗体，或本发明所述的人CD52突变的单克隆抗体。
[0015] 本发明的另外一方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有表达上述突变的 单克隆抗体的编码链。
[0016] 本发明的另外一方面，提供了本发明所述的人CD52突变单克隆抗体用于检测以及 治疗白血病的用途。
[0017] 有益效果:与现有技术相比，本发明的优点如下:本发明将CD52单克隆抗体通过优 化寻找到了最优的对抗体结合起到最大功能的位点，通过特定位点的点突变获得了一系列 的突变抗体，所述的抗体相对于原始的抗体，具有更好的结合结合特性以及结合的准确性， 具有不可以预料的效果。同时将突变后的抗体去制备用于检测及治疗白血病的试剂盒，具 有更好的应用前景。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1抗体突变位点的选定
[0019] 首先，针对SEQ ID NO: 1和2的抗体重链可变区和轻链可变区链进行抗体结构数据 分析，针对结构域的残基进行计算机结构模拟，重链可变区氨基酸序列中的第llLeu、 14?1'〇、361'印、40361'、81\^1、8461]1、86厶811，轻链可变区氨基酸序列中的141'111'、16617、 35Lys、39Asn、41Leu、84Glu、87Asp、89Gly是抗体中提高抗体性能的决定性位点。
[0020] 通过建模，发现，在以上位点进行特定氨基酸的突变，可以提高与CD52的结合能 力，这些具体的重链可变区突变形式分别为：LeullPro、Prol4Ser、Trp36Met、Ser40Val、 Val81Cys、Gln84Trp、Asn86Gly任--个；轻链可变区氨基酸序列突变方式为Thrl4Val、 Glyl6Ser、Lys35Gly、Asn39Met、Leu41Ser、Glu84Tyr、Asp87Ser、Gly89Pro任--个；另外提 供一种具体的突变组合为:重链可变区的LeullPro和轻链可变区的Glu84Tyr、重链可变区 的Prol4Ser和轻链可变区的Gly89Pro、重链可变区的Trp36Met和轻链可变区的Lys35Gly、 重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Glyl6Ser、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的 Glu84Tyr、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Gly89Pro、重链可变区的Asn86Gly和轻 链可变区的Thrl4Val、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Lys35Gly、重链可变区的 Asn86Gly和轻链可变区的Leu41Ser、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Gly89Pro任一 一种形式。
[0021] 实施例2突变抗体的制备
[0022]通过全序列合成的方式，获得了编码SEQ ID NO: 1和2的氨基酸序列的编码核苷酸 序列，在生物工程公司合成。采用定点突变法分三段扩增带有上述突变位点的序列，然后用 搭桥PCR法，扩增得到突变抗体CD52的编码基因序列。将前面所获得25种不同的单克隆抗体 亚克隆至表达性的载体PET32a中，并将测序鉴定正确的重组质粒转化到表达型宿主菌DE3 中，其涂布在含有l〇〇yg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基的板上，37 °C过夜。（2)挑选单个菌 落接种在10mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37°C摇床培养过夜。（3)接种lmL的过夜菌种 至300mL LB培养基中，37 °C摇床培养，培养到0D值达到1.0时，加入IPTG，28 °C摇床培养过 夜，（4)第二天，离心收菌。（5)将菌体破碎以获得抗体粗提液。（6)经镍柱离子亲和层析纯化 抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，所述抗体为ScFv。采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱 液(50mmo 1)用于洗去杂带，高浓度咪挫洗脱液(250mmo 1，500mmo 1)最终可制备纯度达99 % 以上的蛋白。将蛋白浓度调整为140mg/ml。
[0023]实施例3抗体性质分析
[0024] 1、表面胞质团共振法测突变体抗体的结合常数Kd
[0025]抗原⑶52采用(人⑶52基因的克隆及稳定转染细胞系的建立，刘友等)方法制备得 到得到，蛋白浓度稀释为10mg/mL。抗原也可以采用商业购买的方式获得。利用Biacore 3000测突变后的抗体与抗原的绝对亲和力。选用CM-5传感片，表面吸附羧甲基葡聚糖。两个 流通池化&1:1^35〇均以2(^1/111；[11的流速活化6111；[11，将5以8抗原0)52溶于501111口!17.0的磷酸溶 液，以15μ1/π?η的流速注入芯片流通池1，其表面密度约为lOKRu，抗原标记后再用1M乙醇胺 将芯片表面封闭。结合条件:各检测抗体原液浓度为l0mg/ml，依次稀释成200μg/ml，100yg/ ml，50μg/ml，25μg/ml，12μg/ml，0μg/ml，以ΙΟμΙ/min的速度注入芯片的两个流通池，上样 3min;解离条件：流速ΙΟμΙ/min，解离3miru芯片再生条件：lOmM NaOH，1M NaCL·用Biacore evaluation软件分析抗体亲和常数KDc^结果如下：
[0029] 从以上结果可以看出，经过突变后的抗体其亲和常数得到大大的提高，对于抗原 的结合能力也提高了一个数量级。但是针对位点的突变，也不是任一的突变都具有提高抗 体亲和力的效果，比如重链Trp36Asp突变的抗体、重链Asn86Pro突变的抗体、轻链Glu84Gly 突变的抗体、轻链Asp87Gly突变的抗体、轻链Gly89Met突变的抗体均导致抗体的亲和力大 幅度的降低，其它的位点突变也不能提高抗体的亲和力，在此不一一列举。
[0030] 实施例4:外周血细胞检测 [0031] 正常人外周血检测
[0032]取31个试管，每管加入正常人抗凝外周血100μ1(其中白细胞的浓度为6000个），加 入0.5yg ΡΕ标记的本申请制备得到的抗体（同时采用磁珠标记），室温避光孵育20分钟，使 用磁性进行细胞分离;加入2ml溶血素室温避光反应10分钟后1000转/分钟离心5分钟，弃上 清;加入2ml冷PBS缓冲液，重悬，1000转/分钟离心5分钟，弃上清;加入300μ1含1 %多聚甲醛 的PBS缓冲液，流式细胞仪检测。通过检测，发现其中通过磁珠分离的细胞均为白细胞，通过 细胞检测发现，本发明提供的重链可变区和轻链可变区突变的抗体分离后的血液中，残留 的白细胞个数均小于10个。而⑶52抗体、⑶52-26突变抗体、CD52-27突变抗体、⑶52-28突变 抗体、CD52-29突变抗体、CD52-30突变抗体其处理后的血液通过细胞仪检测其中白细胞残 留的数量分别为325、3840、4956、4245、5346、3998个。由此可见，本发明提供的抗体具有更 好的检测白细胞的最低限度。
[0033]以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于白血病检测用试剂盒，其含有抗体，所述抗体含有轻链可变区序列和重链 可变区序列，其序列分别如SEQ ID No: 1和2所示。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:重链可变区氨基酸序列中存在1个氨基酸 的突变，具体的突变方式为1^1111?1'〇、？1'〇14361'、1'印36]^1:、36140\^1、\^181〇5^、6111841'印、 Asn86Gly 任意一个。3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:轻链可变区氨基酸序列中存在1个氨基酸 的突变，具体的突变方式为 Thrl4Val、Glyl6Ser、Lys35Gly、Asn39Met、Leu41Ser、Glu84Tyr、 Asp87Ser、Gly89Pro 任意一个。4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:在SEQ ID No: 1和2所示抗体的基础上，存 在如下任一的突变组合:重链可变区的LeullPro和轻链可变区的Glu84Tyr、重链可变区的 Prol4Ser和轻链可变区的Gly89Pro、重链可变区的Trp36Met和轻链可变区的Lys35Gly、重 链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Glyl6Ser、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的 Glu84Tyr、重链可变区的Gln84Trp和轻链可变区的Gly89Pro、重链可变区的Asn86Gly和轻 链可变区的Thrl4Val、重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Lys35Gly、重链可变区的 Asn86Gly和轻链可变区的Leu41Ser、或重链可变区的Asn86Gly和轻链可变区的Gly89Pro。5. 根据权利要求1-4任一所述的抗体在制备用于白血病检测中的试剂盒应用。
【文档编号】G01N33/574GK106018814SQ201610642436
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月7日
【发明人】查文娟
【申请人】查文娟