一种测定降钙素原的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定降钙素原的试剂盒。本发明的目的在于解决现有技术中定降钙素原检测过程操作复杂、以及测定准确度低的问题，本发明所采用双试剂，先将含有抗人类风湿因子抗体的试剂R1与样本相混合，使得样本中的类风湿因子抗原与试剂R1中的抗人类风湿因子抗体结合形成抗原抗体复合物，以达到将类风湿因子抗原清除的目的；再将含有乳胶包被抗人降钙素原抗体的试剂R2与上述样本混合，降钙素原抗原发生特异性结合，形成不溶性的聚苯乙烯微球?抗原?聚苯乙烯微球颗粒复合物乳浊液，产生一定的浊度，在一定波长下进行浊度测定，即可测得样本中被检测降钙素原的含量。本发明具有准确度高、无污染、操作方便等优点。
【专利说明】
一种测定降钙素原的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定降钙素原的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 降钙素原(PCT)是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏 器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高。局部有 限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高。细菌内毒素在诱导过程中担任了 至关重要的作用。
[0003] PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。影响PCT水平的因素包括被感染器官的大小 和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。PCT水平的升高出现在严重休克、全身 性炎症反应综合征和多器官功能紊乱综合征，即使没有细菌感染或细菌性病灶。但是，在这 些病例中PCT水平通常低于那些有细菌性病灶的患者。从肠道释放细胞因子或细菌移位可 能引起诱导。
[0004] PCT来自定位于第11号染色体上（11ρ15, 4)的单拷贝基因，该基因由2800个碱 基对组成，含6个外显子和5个内含子。转录后在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网内翻译成降 钙素原前体，包括N端84个氨基酸、活性降钙素和降钙蛋白三部分。降钙素原前体在内源 多肽酶作用下剪掉nPro-CT端单一序列，生成116氨基酸的PCT，分子量约为13kD，PCT 和降钙素具有一个相同的32个氨基酸的序列。PCT是无激素活性的降钙素前肽物质。正常代 谢时，甲状腺C细胞分泌并产生有激素活性的降钙素。PCT在健康个体中的浓度非常低（〈 O.lng /ml )，并且在活体内外都是非常稳定的蛋白，半衰期大约20~24h。
[0005] PCT在内毒素等细胞因子诱导下，2~3h开始增加，LPS后2h血浆中可检测到， 6~8h体内浓度快速升高，12~48h到达峰值，2~3d后恢复正常。随后有研究表明，PCT 是由细菌内毒素、TNF-a、IL-6等因素作用于肝、脾、肾、肺的神经内分泌细胞或特殊细胞而 产生。动物实验证明，PCT可能是一种次级炎症因子，本身不直接参与启动脓毒血症反应， 但可放大并加重脓毒血症病理过程。
[0006] 目前检测降钙素原的方法有很多，主要有放射免疫法、化学发光、胶体金法。放射 免疫法会产生放射性物质，造成放射性环境污染;化学发光成品较高，且需要检测的仪器较 为昂贵;胶体金法检测速度快，但只能定性或者半定量，检测结果不精确。
【发明内容】
[0007] 本发明针对上述问题公开了一种测定降钙素原的试剂盒，克服了成本高、有污染、 以及测定准确度低的问题。
[0008] 本发明解决上述技术问题提供的技术方案是:一种测定降钙素原的试剂盒，该试 剂盒由试剂R1和试剂R2双液体组分组成，所述的试剂R1为加有抗人类风湿因子抗体、无机 盐离子、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和加速剂的缓冲液； 作为优选，所述的试剂R2为加有乳胶包被抗人降钙素原抗体、无机盐离子、稳定剂、防 腐剂的缓冲液。所述的缓冲液为Tri s缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓 冲液中的一种或多种组合而成。所述的无机盐离子为氯化钠、氯化钾、硫酸钾中的一种或多 种组合而成。所述的加速剂为聚乙二醇-2000、聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯 烷酮中的一种或几种。所述的稳定剂为牛血清白蛋白、甘油、蔗糖、海藻糖、EDTA中的一种或 多种组合而成。
[0009] 作为优选方案，所述的防腐剂为苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种组合而 成。所述的表面活性剂为吐温系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯月桂醚系列中的一种或多种 组合而成。
[0010] 作为优选方案，所述的乳胶包被抗人降钙素原抗体含有功能部位的完整抗体或抗 体片段，或为兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体，或为兔抗人单克隆抗体或羊抗人单 克隆抗体；所述的乳胶包被抗人降钙素原抗体的粒径在40~500nm之间。
[0011] 作为优选方案，所述的试剂盒中彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，它们包 括的成分及相应含量为： 试剂R1: Tris缓冲液 30~130 mmol/L 氯化钠 100~300 mmol/L 聚乙二醇-6000 10-40 g/L EDTA 10~70 mmol/L 吐温-80 0.5-1.5 mL/L 叠氮钠 0.4~0.9 g/L 抗人类风湿因子抗体 0.2~1.8 g/L 其溶剂为纯化水。
[0012] 试剂R2: Tris缓冲液 50~150 mmol/L 牛血清白蛋白 14~56 g/L 氯化钠 40~180 mmol/L 叠氮钠 0.4~0.9 g/L 乳胶包被抗人降钙素原单克隆抗体 2~6 g/L 其溶剂为纯化水。
[0013] 作为优选方案，所述的试剂盒的的制备和使用方法包括以下步骤： (a)按照下列组分含量配制好R1试剂： Tris缓冲液 30~130 mmol/L 氯化钠 100~300 mmol/L 聚乙二醇-6000 10-40 g/L EDTA 10-70 mmol/L 吐温-80 0.5-1.5 mL/L 叠氮钠 0.4~0.9 g/L 抗人类风湿因子抗体 0.2~1.8 g/L 其溶剂为纯化水。
[0014] (b)按照下列组分含量配制好R2试剂： Tris缓冲液 50~150 mmol/L 牛血清白蛋白 14~56 g/L 氯化钠 40~180 mmol/L 叠氮钠 0.4~0.9 g/L 乳胶包被抗人降钙素原单克隆抗体 2~6 g/L 其溶剂为纯化水。
[0015] (C)将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应，进一步优选的，试剂R1与试 剂R2的体积比为3 :1，待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:10到1:50之间。
[0016] (d)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值； (e)根据吸光度变化值计算出样本中的降钙素原的值。
[0017] 作为优选方案，所述的乳胶包被抗人降钙素原抗体的配制方法如下： (a) 将粒径为80nm的胶乳颗粒，用50 mmol/L的MES缓冲液稀释胶乳颗粒到4.0 g/L，每 mL溶液中加入EDAC 1.0 mg，室温反应2小时，在离心机内20000 rpm转速下离心30分钟，去 上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散； (b) 将步骤(a)的产物在离心机内20000 rpm转速下离心30分钟，弃上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得胶乳颗粒最终浓度为4g/L，超声分散，边搅拌边加入等体积的含 抗人降钙素原抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时，胶乳颗粒最终浓度为4.0 g/L。
[0018] (C)将步骤(b)的产物在离心机内20000 rpm转速离心30分钟，弃上清，沉淀悬浮于 50 mmol/L的MES缓冲液中，胶乳颗粒最终浓度为4.0 g/L，然后超声分散，加入BSA，4°C封闭 过夜;离心去上清，用步骤(b)制得的分散液溶解胶乳颗粒，使胶乳颗粒终浓度为4.0 g/L， 超声分散后制得乳胶包被抗人降钙素原抗体。
[0019] 本发明所采用的胶乳增强免疫比浊法的反应原理是:先将含有抗人类风湿因子抗 体的试剂R1与样本相混合，在37°c下孵育5分钟，使得样本中的类风湿因子抗原与试剂R1中 的抗人类风湿因子抗体结合形成抗原抗体复合物，并凝集成大颗粒，以达到将类风湿因子 抗原清除的目的。同时试剂R1中所含的EDTA与样本中的金属离子螯合，除去金属离子的干 扰;再将含有乳胶包被抗人降钙素原抗体的试剂R2与上述中去除过类风湿因子和金属离子 的样本中相应的降钙素原抗原发生特异性结合，在加速剂作用下形成不溶性的聚苯乙烯微 球-抗原-聚苯乙烯微球颗粒复合物乳浊液，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的降钙 素原抗原浓度成正比关系，在一定波长下进行浊度测定，即可测得样本中被检测降钙素原 的含量。
[0020] 样本中降钙素原(PCT)的活性(ng/mL)= 式中：△ At以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值 Δ As以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值 Cs校准液中PCT的浓度 与现有技术相比，本发明具有检测灵敏度更高，检测准确性更好，不产生环境污染物等 优点，另外检测也比较方便。
[0021]
【附图说明】： 图1为使用实施例1中试剂盒与化学发光法的检测结果对比。
[0022] 图2为使用实施例2中试剂盒与化学发光法的检测结果对比。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。 [0024] 实施例1 本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中 试剂R1: Tris缓冲液 80 mmol/L 氯化钠 200 mmol/L 聚乙二醇-6000 25 g/L EDTA 40 mmol/L 吐温-80 1.0 mL/L 叠氮钠 〇.7g/L 抗人类风湿因子抗体 1.0 g/L 其溶剂为纯化水。
[0025] 试剂 R2: Tris缓冲液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 35 g/L 氯化钠 110 mmol/L 叠氮钠 0.65 g/L 乳胶包被抗人降钙素原单克隆抗体4g/L 其溶剂为纯化水。
[0026] 实施例2 试剂R1: MES缓冲液 80 mmol/L 氯化钠 200 mmol/L 聚乙二醇-8000 25 g/L EDTA 40 mmol/L 吐温-80 1.0 mL/L 叠氮钠 〇.7g/L 抗人类风湿因子抗体 1.0 g/L 其溶剂为纯化水。
[0027] 试剂 R2: MES缓冲液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 35 g/L 氯化钠 110 mmol/L 叠氮钠 0.65 g/L 乳胶包被抗人降钙素原单克隆抗体4g/L 其溶剂为纯化水。
[0028] 实施例3 试剂盒的制备和使用方法 1、乳胶包被抗人降钙素原单克隆抗体的制备： (a) 将粒径为80nm的胶乳颗粒，用50 mmol/L的MES缓冲液稀释胶乳颗粒到4.0 g/L，每 mL溶液中加入EDAC 1.0 mg，室温反应2小时，在离心机内20000 rpm转速下离心30分钟，去 上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散； (b) 将步骤(a)的产物在离心机内20000 rpm转速下离心30分钟，弃上清，将沉淀悬浮于 50 mmol/L的MES缓冲液中，使得胶乳颗粒最终浓度为4g/L，超声分散，边搅拌边加入等体积 的含抗人降钙素原抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时，胶乳颗粒最终浓度为4.0 g/L〇
[0029] (c)将步骤(b)的产物在离心机内20000 rpm转速离心30分钟，弃上清，沉淀悬浮于 50 mmol/L的MES缓冲液中，胶乳颗粒最终浓度为4.0 g/L，然后超声分散，加入BSA，4°C封闭 过夜;离心去上清，用步骤(b)制得的分散液溶解胶乳颗粒，使胶乳颗粒终浓度为4.0 g/L， 超声分散后制得乳胶包被抗人降钙素原抗体。
[0030] 2、按照下列组分含量配制好试剂： (a)按照下列组分含量配制好R1试剂： Tris缓冲液 80 mmol/L 氯化钠 200 mmol/L 聚乙二醇-6000 25 g/L EDTA 40 mmol/L 吐温-80 1.0 mL/L 叠氮钠 〇.7g/L 抗人类风湿因子抗体 1.0 g/L 其溶剂为纯化水。
[0031] (b)按照下列组分含量配制好R2试剂： Tris缓冲液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 35 g/L 氯化钠 110 mmol/L 叠氮钠 0.65 g/L 乳胶包被抗人降钙素原单克隆抗体4g/L 其溶剂为纯化水。
[0032] 3、全自动生化分析仪参数设置 (a) 检测温度:37°C; (b) 检测波长:主波长600nm; (c) 反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度 Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反应方向：正反应； 4、检测步骤 (a) 取224μ1试剂R1与4μ1待测样本混匀； (b) 将混匀后的溶液在37°C的条件下孵育5min; (c) 加入56μ1试剂R2,立即测定读取吸光度Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化 Δ A = A2-A1；
(d) 样本中类样本中降钙素原(PCT)的活性（ 〔ng/mL)计算出样本 中的降钙素原的活度。
[0033] 实施例4 试剂盒的制备和使用方法 1、将粒径为80nm的胶乳颗粒，用50 mmol/L的MES缓冲液稀释胶乳颗粒到4.0 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室温反应2小时，在离心机内20000 rpm转速下离心30分钟，去上 清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散;然后在离心机内20000 rpm转速下 离心30分钟，弃上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得胶乳颗粒最终浓度为 4g/L，超声分散，边搅拌边加入等体积的含抗人降钙素原抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温 反应2小时，胶乳颗粒最终浓度为4.0 g/L制得分散溶液。然后在离心机内20000 rpm转速离 心30分钟，弃上清，沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，胶乳颗粒最终浓度为4.0 g/L，然 后超声分散，加入BSA，4°C封闭过夜。离心去上清，用制得的分散液溶解胶乳颗粒，使胶乳颗 粒终浓度为4.0 g/L，再次超声分散后制得乳胶包被抗人降钙素原抗体。
[0034] 2、按照下列组分含量配制好试剂： (a)按照下列组分含量配制好R1试剂： MES缓冲液 80 mmol/L 氯化钠 200 mmol/L 聚乙二醇-8000 25 g/L EDTA 40 mmol/L 吐温-80 1.0 mL/L 叠氮钠 〇.7g/L 抗人类风湿因子抗体 1.0 g/L 其溶剂为纯化水。
[0035] (b)按照下列组分含量配制好R2试剂： 试剂R2: MES缓冲液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 35 g/L 氯化钠 110 mmol/L 叠氮钠 0.65 g/L 乳胶包被抗人降钙素原单克隆抗体4g/L 其溶剂为纯化水。
[0036] 3、全自动生化分析仪参数设置 (a)检测温度:37°C; (b) 检测波长:主波长600nm; (c) 反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度 Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反应方向：正反应； 4、检测步骤 (a) 取224μ1试剂R1与4μ1待测样本混匀； (b) 将混匀后的溶液在37°C的条件下孵育5min; (c) 加入56μ1试剂R2,立即测定读取吸光度Al，5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化 Δ A = A2-A1； (d) 样本中类样本中降钙素原(PCT)的活性
（ng/mL)计算出样本 中的降钙素原的活度。
[0037] 参照附图1，附图1为用实施例1所制得的一种测定降钙素原的试剂盒多次测定不 同样本中降钙素原的测定结果，以及在同等条件下与化学发光法测定结果的对比分析。从 相关性实验结果可见，本试剂盒与化学发光检测结果相关性很好，相关方程y=l.0457 x+ 0.0265，R2=0.9922，从结果可以看出本试剂盒结果准确性可靠，相关性良好，可以应用于降 钙素原(PCT)的检测。
[0038] 参照附图2,附图2为用实施例2所制得的一种测定降钙素原的试剂盒多次测定不 同样本中降钙素原的测定结果，以及在同等条件下与化学发光法测定结果的对比分析。从 相关性实验结果可见，本试剂盒与化学发光检测结果相关性很好，相关方程y=〇.7381x+ 0.06，R 2=0.9933,从结果可以看出本试剂盒结果准确性可靠，相关性良好，可以应用于降钙 素原(PCT)的检测。
【主权项】
1. 一种测定降钙素原的试剂盒，该试剂盒由试剂R1和试剂R2双液体组分组成，其特征 在于:所述的试剂R1为加有抗人类风湿因子抗体、无机盐离子、防腐剂、稳定剂、表面活性剂 和加速剂的缓冲液;所述的试剂R2为加有乳胶包被抗人降钙素原抗体、无机盐离子、稳定剂 、防腐剂的缓冲液。2. 如权利要求1所述的一种测定降钙素原的试剂盒，其特征在于:所述的缓冲液为Tris 缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种组合而成;所述 的无机盐离子为氯化钠、氯化钾、硫酸钾中的一种或多种组合而成;所述的加速剂为聚乙二 醇-2000、聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种;所述的稳定剂 为牛血清白蛋白、甘油、蔗糖、海藻糖、EDTA中的一种或多种组合而成。3. 如权利要求1所述的一种测定降钙素原的试剂盒，其特征在于：所述的防腐剂为苯 酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种组合而成;所述的表面活性剂为吐温系列、聚氧乙烯 苯基醚、聚氧乙烯月桂醚系列中的一种或多种组合而成。4. 如权利要求1所述的一种测定降钙素原的试剂盒，其特征在于:所述的乳胶包被抗人 降钙素原抗体含有功能部位的完整抗体或抗体片段，或为兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克 隆抗体，或为兔抗人单克隆抗体或羊抗人单克隆抗体;所述的乳胶包被抗人降钙素原抗体 的粒径在40~500nm之间。5. 根据权利要求1所述的一种测定降钙素原的试剂盒，其特征在于:所述的彼此独立的 试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: Tris缓冲液 30~130 mmol/L 氯化钠 100~300 mmol/L 聚乙二醇-6000 10-40 g/L EDTA 10~70 mmol/L 吐温-80 0.5-1.5 mL/L 叠氮钠 0.4~0.9 g/L 抗人类风湿因子抗体 0.2~1.8 g/L 其溶剂为纯化水； 试剂R2: Tris缓冲液 50~150 mmol/L 牛血清白蛋白 14~56 g/L 氯化钠 40~180 mmol/L 叠氮钠 0.4~0.9 g/L 乳胶包被抗人降钙素原单克隆抗体 2~6 g/L 其溶剂为纯化水。6. 根据权利要求9所述的一种测定降钙素原的试剂盒，其特征在于:所述的试剂盒的的 制备和使用方法包括以下步骤： (a)按照下列组分含量配制好R1试剂： Tris缓冲液 30~130 mmol/L 氯化钠 100~300 mmol/L 聚乙二醇-6000 10-40 g/L EDTA 10~70 mmol/L 吐温-80 0.5-1.5 mL/L 叠氮钠 0.4~0.9 g/L 抗人类风湿因子抗体 0.2~1.8 g/L 其溶剂为纯化水； (b) 按照下列组分含量配制好R2试剂： Tris缓冲液 50~150 mmol/L 牛血清白蛋白 14~56 g/L 氯化钠 40~180 mmol/L 叠氮钠 0.4~0.9 g/L 乳胶包被抗人降钙素原单克隆抗体 2~6 g/L 其溶剂为纯化水； (c) 将待测样本与试剂R1混合，使其充分反应； (d )将步骤(c )的混合产物中加入试剂R2; (e) 用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值； (f) 根据吸光度变化值计算出样本中的降钙素原的值。7. 根据权利要求6所述的一种测定降钙素原的试剂盒的制备和使用方法，其特征在于： 步骤(c)中所述的试剂R1与试剂R2的体积比为3 :1。8. 根据权利要求6所述的一种测定降钙素原的试剂盒的制备和使用方法，其特征在于： 步骤(c)中所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:10到1:50之间。9. 根据权利要求1所述的一种测定降钙素原的试剂盒，其特征在于:所述的乳胶包被抗 人降钙素原抗体的配制方法如下： (a) 将粒径为80nm的胶乳颗粒，用50 mmol/L的MES缓冲液稀释胶乳颗粒到4.0 g/L，每 mL溶液中加入EDAC 1.0 mg，室温反应2小时，在离心机内20000 rpm转速下离心30分钟，去 上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散； (b) 将步骤(a)的产物在离心机内20000 rpm转速下离心30分钟，弃上清，将沉淀悬浮于 50 mmol/L的MES缓冲液中，使得胶乳颗粒最终浓度为4g/L，超声分散，边搅拌边加入等体积 的含抗人降钙素原抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时，胶乳颗粒最终浓度为4.0 g/L, (c) 将步骤(b)的产物在离心机内20000 rpm转速离心30分钟，弃上清，沉淀悬浮于50 mmo 1 /L的MES缓冲液中，胶乳颗粒最终浓度为4.0 g/L，然后超声分散，加入BSA，4°C封闭过 夜;离心去上清，用步骤(b)制得的分散液溶解胶乳颗粒，使胶乳颗粒终浓度为4.0 g/L，超 声分散后制得乳胶包被抗人降钙素原抗体。
【文档编号】G01N33/68GK106018816SQ201610359610
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】蔡晓辉, 庄庆华, 吴铮, 徐运
【申请人】安徽伊普诺康生物技术股份有限公司